史博洋， 李媛媛， 王儒曉， 曲江勇, 2*， 郭承華*， 劉傳林， 侯建海， 房輝， 劉楚童

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005； 2. 海南熱帶海洋學院，海南兩棲爬行動物研究重點實驗室，海南三亞572000)

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基于線粒體16SrRNA探討渤海海區(qū)矮擬帽貝的種群生態(tài)遺傳

史博洋1， 李媛媛1， 王儒曉1， 曲江勇1, 2*， 郭承華1*， 劉傳林1， 侯建海1， 房輝1， 劉楚童1

(1.煙臺大學生命科學學院，山東煙臺264005； 2. 海南熱帶海洋學院，海南兩棲爬行動物研究重點實驗室，海南三亞572000)

采用聚合酶鏈式反應和直接測序的方法研究了渤海海區(qū)15個矮擬帽貝Patelloidapygmaea種群遺傳多樣性與環(huán)境因子的關(guān)系。180個個體的16S rRNA部分序列(615 bp)共發(fā)現(xiàn)264個多態(tài)性位點，153個轉(zhuǎn)換，114個顛換，界定32個單倍型。所有個體堿基含量依次為C(18.12%)、T(27.74%)、A(33.07%)、G(21.07%)；單倍型多樣性為0.835 1±0.019 1，核苷酸多樣性為0.449±0.214。矮擬帽貝大陸沿岸種群核苷酸多樣性(0.191 8±0.091 7)高于島嶼種群(0.107 3±0.081 6)。種群歷史動態(tài)結(jié)果顯示，矮擬帽貝經(jīng)歷了種群近期擴張。與環(huán)境因子相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數(shù)、日照百分率分別呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；形態(tài)相關(guān)分析結(jié)果表明，變異主成分(殼長、殼寬)與年均降水量呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；年均降水量、日照時數(shù)、日照百分率是影響矮擬帽貝形態(tài)變異、遺傳多樣性的主導因子，環(huán)境越穩(wěn)定地區(qū)種群的遺傳多樣性越高。

矮擬帽貝； 16S rRNA； 生態(tài)遺傳； 遺傳多樣性

環(huán)境因子在物種的進化過程中發(fā)揮著重要作用，物種的分布、行為、生理和遺傳結(jié)構(gòu)通常都會受到環(huán)境因子的影響，探究環(huán)境因子與生物多樣性的相關(guān)性是生態(tài)遺傳研究的重要內(nèi)容之一(Scheiner，1993)。通常種群占據(jù)不同地理環(huán)境并呈現(xiàn)梯度性遺傳變化，這種結(jié)果主要受自然選擇與環(huán)境變遷影響(Jin & Liu，2008)，遺傳結(jié)構(gòu)分化和自然環(huán)境變遷之間的相互作用是目前生態(tài)地理學關(guān)注的焦點。同類物種生活在不同環(huán)境下(溫度、降水、日照等)的地理種群遺傳多樣性存在地理變異，如荒漠沙蜥Phrynocephalusprzewalskii的遺傳多樣性與緯度、降水量顯著正相關(guān)，大石雞Alectorismagna、雉雞甘肅亞種Phasianuscolchicusstrauchi的遺傳多樣性與溫度呈顯著負相關(guān)，以及同種生物因環(huán)境而產(chǎn)生的形態(tài)改變影響基因頻率等(Michod，1981；Nevo，1981；曲江勇，劉迺發(fā)，2012)。環(huán)境對生物的影響(環(huán)境的演替、種群遺傳結(jié)構(gòu)的多變)伴隨著表型與基因型的變化繼而改變種群結(jié)構(gòu)，環(huán)境促進演替使種群遺傳分化趨于平衡穩(wěn)定(Slatkin，1987)。

分子標記作為研究種群遺傳結(jié)構(gòu)和地理分化的重要工具，目前已廣泛用于解決動物生態(tài)遺傳等問題(Wayne & Robert，2004)。動物線粒體DNA具有分子量小、進化速度快、結(jié)構(gòu)簡單、表現(xiàn)為母系遺傳等特點，非常適于動物群體遺傳學和系統(tǒng)進化研究(Canapaetal.，2000)，其中16S rRNA基因進化速率適中，適合種群水平的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)研究(Hondaetal.，2002)。

矮擬帽貝Patelloidapygmaea隸屬軟體動物門Mollusca腹足綱Gastropoda原始腹足目Archaeogastropoda笠貝科Acmaeidae(Surhoneetal.，2010)，中國習見種類，沿岸、島嶼均有分布。矮擬帽貝遍布整個潮間帶(海岸帶以上到淺層潮下帶)，棲息附著在大型水生植物、激浪區(qū)礁巖、珊瑚藻及其他貝殼等表面，主要攝食藻類與浮游植物(Lindberg，1990；Takenori & Takashi，1993；Kirkendale & Meyer，2004；Nakano & Ozawa，2007)。目前矮擬帽貝研究主要集中在系統(tǒng)學和分類學等領(lǐng)域，包括種水平鑒定、形態(tài)變異、遺傳多樣性等(Nakaietal.，2006；Gonzálezwevaretal.，2010)，種群系統(tǒng)地理研究較少。國內(nèi)研究重點多為具有較大經(jīng)濟價值的貝類，分布廣泛但無經(jīng)濟價值的潮間帶貝類的系統(tǒng)地理格局受歷史因素、現(xiàn)今環(huán)境和生態(tài)因素的影響，其遺傳進化、系統(tǒng)地理分布格局未得到深入研究(Nietal.，2012)。

本研究以矮擬帽貝線粒體16S rRNA部分序列，探究矮擬帽貝的生態(tài)遺傳，揭示種群遺傳多樣性隨環(huán)境因子的變異規(guī)律，為中國矮擬帽貝種群遺傳研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品采集、DNA提取及序列獲取

矮擬帽貝采樣點見圖1，大陸沿岸種群包括大連、莊河、營口、錦州、葫蘆島、秦皇島、萊州、蓬萊、煙臺；島嶼種群包括長島、砣磯島、大欽島、南隍城島、北隍城島。采集后測量個體的殼長、殼寬、殼高、殼周長、長斜邊、短斜邊、壁厚等；返回實驗室稱量殼干重、計算頭端角度與尾端角度(表1)，無水乙醇保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 矮擬帽貝地理種群采集點Fig. 1 The sampling sites of Patelloida pygmaea in the Bohai Sea

DNA提取：DNeasy?組織&血液試劑盒(GTIN: 04053228006077，Lot：151046088，GIAGEN，德國)。PCR擴增：選用16S rRNA通用引物(華大基因合成)，16Sar-L：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′；16SbrH：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′(Folmeretal.，1994)，PCR擴增反應體系(25 μL)：12.5 μL Taq MIX(0.625 U Taq酶、0.2 mmol·L-1dNTP、1.5 mmol·L-1MgCl2；Lot：A3701A，TaKaRa，中國大連)；0.15 μL (100 μM)上下游引物、1 μL DNA模板(80～100 ng)。PCR反應條件設置：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性30 s，49 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR結(jié)束后取4 μL于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(1×TBE、5 V/cm恒壓、Goldenview染色)(瓊脂糖，Lot：142075，BIOWEST，西班牙；Goldenview，Lot：OHO9RL，濟南力戈科技有限公司)。PCR產(chǎn)物送北京六合華大公司進行ABI PRIMS 3730雙向測序。

1.2環(huán)境因子

選取經(jīng)度、緯度、年均溫度、溫度變異系數(shù)、年均降水量、降水量變異系數(shù)、年均日照時數(shù)、日照率作為環(huán)境因子(表2)，從國家氣象數(shù)據(jù)共享服務網(wǎng)獲取10個地點近30年氣象數(shù)據(jù)，并計算氣溫、降水量變異系數(shù)(砣磯島、大欽島、小欽島、北隍城島、南隍城島等地區(qū)氣象站因缺少相關(guān)數(shù)據(jù)，未被國家氣象數(shù)據(jù)共享服務網(wǎng)收錄)。

1.3數(shù)據(jù)分析

雙向測序結(jié)果用Conting進行拼接，通過CLUSTAL_X 1.83進行序列比對，單倍型用DnaSP v5統(tǒng)計(Librado & Rozas，2009)。通過ARLEQUIN 3.5計算群體多樣性指數(shù)：單倍型多樣性(h)、核苷酸多樣度(π)、序列平均核苷酸差異數(shù)(k)、擴張系數(shù)(Tau)、有效種群大小(θ)、種群分化系數(shù)(Fst)；AMOVA分析(Excoffier & Lischer，2010)；通過MEGA7計算遺傳距離(D)與序列變異(S)(Kumaretal.，2016)；樣品所測殼長、殼寬、殼高、殼周長、短斜邊、長斜邊、頭端角度、尾端角度、干重、壁厚等形態(tài)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差表示，形態(tài)變異采用主成分分析與相關(guān)性分析，以上統(tǒng)計分析均在SPSS 19.0(Arbuckle，2010)完成。

2 結(jié)果

2.1序列變異與遺傳多樣性

180個矮擬帽貝樣本的mtDNA 16S rRNA部分序列中，共發(fā)現(xiàn)了264個多態(tài)位點，堿基組成為C(18.12%)、T(27.74%)、A(33.07%)、G(21.07%)，轉(zhuǎn)換/顛換比為1.34(缺失位點少于5%)，界定32種單倍型?？傮w單倍型多樣性為0.835 1，核苷酸多樣性為0.449，核苷酸兩兩差異度為118.533。除莊河、蓬萊外，其他地理種群單倍型多樣性較高(表3)；大陸沿岸各種群的核苷酸多樣性、遺傳距離與序列變異整體高于島嶼種群，總體核苷酸多樣性差異較大(π大陸沿岸=0.197 8、π島嶼=0.107 3)，擴張系數(shù)與種群遺傳多樣性表明種群存在近期擴張(總體CI 95%：Tau=426.109、θ0=0、θ1=inf)；大陸沿岸種群與島嶼種群Fst=0.099(P<0.001)；AMOVA分析可知變異主要來自種群內(nèi)(66.93%，P<0.001)(表4)。

表1 15個矮擬帽貝種群形態(tài)數(shù)據(jù)的平均數(shù)與標準差Table 1 Mean values and standard deviation of the morphological data of 15 Patelloida pygmaea populations

表2 10個矮擬帽貝地理種群近30年環(huán)境因子Table 2 Environmental factors of 10 Patelloida pygmaea populations in recent 30 years

表3 15個矮擬帽貝地理種群遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity of 15 Patelloida pygmaea populations

表4 矮擬帽貝分子方差分析Table 4 AMOVA analysis of Patelloida pygmaea

表5 矮擬帽貝遺傳多樣性、形態(tài)與環(huán)境因子相關(guān)性分析Table 5 Relationship correlation of genetic diversity and morphology of Patelloida pygmaea with environmental factors

注Note:*P<0.05.

2.2遺傳多樣性與環(huán)境因子間的相關(guān)性

所有環(huán)境因子經(jīng)正態(tài)分布檢驗，結(jié)果顯示均為正態(tài)分布，通過Person相關(guān)性檢驗(表5)，發(fā)現(xiàn)矮擬帽貝種群遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數(shù)、日照百分率呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；其他數(shù)據(jù)間無顯著相關(guān)性(P>0.05)。主成分分析顯示，殼長、殼寬為變異關(guān)鍵因子(貢獻值：74.6%、18.4%)，殼長、殼寬與環(huán)境因子相關(guān)性分析結(jié)果表明：殼長、殼寬與年均降水量呈顯著負相關(guān)(r=-0.703/-0.728，P=0.023/0.017)。

3 討論

對矮擬帽貝15個種群的線粒體16S rRNA基因序列研究表明，各地理種群較高的單倍型多樣性(0.486～1.000)和較低的核苷酸多樣性(0.001 6～0.185 5)，符合Grant和Bowen(1998)提出的海洋類生物較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性模式，該類型種群可能經(jīng)歷過歷史擴張事件(Bowenetal.，2001)，Tau值與θ值也表明該物種存在近期歷史擴張；大陸沿岸種群與島嶼種群遺傳差異顯著，大陸沿岸種群遺傳多樣性整體高于島嶼種群，且分化顯著，暗示存在顯著的陸島遺傳模式，大陸沿岸種群更易擴張與進化，推測大陸沿岸種群更為古老，島嶼種群基因頻率受陸地基因流影響顯著(Finston & Peck，1995；曲若竹等，2004)。

氣候因子是影響生物進化的重要因子，其中溫度和降水量則是影響陸生動物進化的2個最重要生態(tài)因子，對外溫動物與內(nèi)溫動物均具有顯著影響，且氣候?qū)Σ煌貐^(qū)的同類物種的影響程度也不同。渤海不同地理種群矮擬帽貝遺傳結(jié)構(gòu)研究結(jié)果表明，16S rRNA序列的遺傳距離、序列變異、核苷酸多樣性與日照時數(shù)、日照百分率呈顯著正相關(guān)，說明日照是影響矮擬帽貝遺傳多樣性的重要因素，日照時數(shù)越大，遺傳多樣性越高。溫度是影響貝類遺傳變異的關(guān)鍵環(huán)境因子(Kimetal.，2009)，海表溫度作為海水熱力狀況的物理量，受太陽輻射影響顯著(Joos & Spahni，2008)，推測矮擬帽貝作為潮間帶生物，棲息地以巖石海床為主，日照改變海面溫度繼而影響種群遺傳多樣性，且環(huán)境越不穩(wěn)定，遺傳多樣性越低，與海洋無脊椎動物生態(tài)研究結(jié)果基本一致(Monarietal.，2007；Yuetal.，2009)。

形態(tài)變異主成分(殼長、殼寬)與環(huán)境因子相關(guān)性分析表明，降水量是影響形態(tài)變異的主要因素，與遺傳存在差異的主要原因是自然選擇導致物種基因遺傳與形態(tài)變異的模式不同，即選擇壓力對不同的類型作用不同(Correetal.，2002)。形態(tài)量度和其他環(huán)境因子的相關(guān)性趨勢與遺傳分析一致，說明表型通常是受基因控制和影響，自然選擇對表型作用實際上是作用于基因或基因型，即環(huán)境因素可以通過影響個體表型進而影響基因型頻率(Huangetal.，2007)。穩(wěn)定環(huán)境中，較小的自然選擇壓力使不同的基因型被最大限度地保留，因此遺傳多樣性較高；在氣候不穩(wěn)定區(qū)域，種群保留適應多變環(huán)境的基因型而在選擇壓力下淘汰其他基因型，遺傳多樣性會降低。

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PopulationEcologicalGeneticsofPatelloidapygmaeaBasedonMitochondrial16SrRNAFragmentSequencesintheBohaiSea

SHI Boyang1, LI Yuanyuan1, WANG Ruxiao1, QU Jiangyong1, 2*, GUO Chenghua1*, LIU Chuanlin1, HOU Jianhai1, FANG Hui1, LIU Chutong1

(1. College of Life Sciences, Yantai University, Yantai, Shandong Province 264005, China; 2. Hainan Key Laboratory for Herpetological Research, Hainan Tropical Ocean University, Sanya, Hainan Province 572000, China)

The relationship between genetic diversity and environmental factors of 15Patelloidapygmaeapopulations in the Bohai Sea was studied by PCR and DNA sequencing. A total of 264 polymorphic loci were found in the 16S rRNA partial sequence of the 180 individuals, and 153 transitions as well as 114 transversions were defined by 32 haplotypes. The base contents of C, T, A and G were 18.12%, 27.74%, 33.07%, and 21.07%, respectively. The haplotype diversity was 0.835 1±0.019 1, and the nucleotide diversity was 0.449±0.214. Moreover, the nucleotide diversity ofP.pygmaeapopulation in the coast (0.191 8±0.091 7) was higher than that of island (0.107 3±0.081 6), and the results of population demographic history indicated that the populations ofP.pygmaeamay have experienced a recent demographic expansion. The correlation analysis between environmental factors and genetic factors showed that the genetic distance, sequence variation and nucleotide diversity ofP.pygmaeawere significantly positive correlated with sunshine duration and sunshine percentage (P<0.05). The result of morphological correlation analysis showed that the main components (length and width) were significantly negative correlated with the annual average precipitation (P<0.05). Average annual precipitation, sunshine duration and sunshine percentage were the dominant factors ofP.pygmaeamorphological variation, and the population genetic diversity will be higher in the the area with high environmental stablility.

Patelloidapygmaea; 16S rRNA; ecological genetical; genetic diversity

2017-01-12接受日期：2017-03-28

國家自然科學基金地區(qū)基金項目(31460562)； 煙臺大學博士科研啟動經(jīng)費(SM15B01)； 2016年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201611066009)； 煙臺大學研究生科技創(chuàng)新基金項目； 煙臺大學開放實驗室項目

史博洋, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學研究, E-mail:sby_hope@163.com

*通信作者Corresponding author, E-mail:qjy@ytu.edu.cn; gch@ytu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170013

Q145； Q346

： A

： 1000-7083(2017)04-0386-06