楊 超，霍 祎，鄧海騰

(清華大學生命科學學院教育部生物信息學重點實驗室，北京 100084)

CRIP1生物學功能的定量蛋白質(zhì)組學分析

楊 超，霍 祎，鄧海騰

(清華大學生命科學學院教育部生物信息學重點實驗室，北京 100084)

CRIP1(cysteine-rich intestinal protein 1)是含有雙鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白，在很多腫瘤細胞中高表達，但其在肺癌細胞中的生理學功能尚不明確。本研究應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學探究CRIP1過表達對肺癌順鉑耐藥細胞(A549/DDP)的影響及作用機制。運用慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建了CRIP1過表達的A549/DDP穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，利用Western Blotting證實了單克隆細胞系中CRIP1的過表達。發(fā)現(xiàn)CRIP1過表達能夠加快細胞增殖，增加細胞的耐藥性。通過定量蛋白質(zhì)組學分析，鑒定了CRIP1過表達引起的蛋白質(zhì)組的變化，并且對上調(diào)和下調(diào)的蛋白進行聚類分析。結(jié)果表明，CRIP1過表達上調(diào)了煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)和NAD依賴型氧化還原酶的表達，從而促進細胞的增殖，并且提高了細胞的耐藥性。

CRIP1；過表達；生長速率；蛋白質(zhì)組學；煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)

CRIP1(cysteine-rich intestinal protein 1)屬于含有雙鋅指結(jié)構(gòu)域(即LIM結(jié)構(gòu)域)的蛋白質(zhì)[1]，其分子質(zhì)量為8.5 ku[2]，LIM結(jié)構(gòu)域與心衰和心臟的發(fā)育有關(guān)[3]。CRIP家族成員在胚胎發(fā)育過程中起著重要作用[4]，CRIP1會影響鋅離子的轉(zhuǎn)運[5]。近期研究發(fā)現(xiàn)，CRIP1在許多腫瘤細胞中高表達，是一個潛在的腫瘤標志物。在骨肉瘤中，CRIP1高表達是病癥減輕的標志[6]。在乳腺癌的治療中，CRIP1是預(yù)后良好的標志物，也可以作為乳腺癌分期的標志物[7-8]。另外，CRIP1和Galectin-3在子宮內(nèi)膜癌中共表達，會影響患者預(yù)后和生存[9]；CRIP1和S100P是前列腺癌中的高表達基因，其表達水平受表觀遺傳調(diào)節(jié)[10]。CRIP1在肺癌細胞中的生物學功能尚不清楚。

近年來，蛋白質(zhì)組學已經(jīng)成為癌癥研究的重要工具[11-12]。串聯(lián)質(zhì)譜標簽(TMT)是一種常用的蛋白定量技術(shù)，通過TMT試劑與多肽N端及賴氨酸殘基側(cè)鏈的胺基反應(yīng)，標記酶解后的肽段。TMT試劑由反應(yīng)基團、報告基團和平衡基團組成，不同樣本的同一肽段標記后的質(zhì)荷比在一級譜圖中是相同的，而在二級質(zhì)譜中，報告基團和平衡基團之間的鍵斷裂，產(chǎn)生不同質(zhì)荷比的報告離子用于定量分析。

本研究擬通過建立CRIP1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，闡明CRIP1對細胞生長和耐藥的影響，并且結(jié)合定量蛋白質(zhì)組學分析，揭示CRIP1調(diào)控腫瘤細胞生長和耐藥的生物學功能。

1 實驗部分

1.1儀器

Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀、Orbitrap Fusion Tribrid液相色譜-質(zhì)譜儀、細胞CO2培養(yǎng)箱、酶標儀：美國Thermo公司產(chǎn)品；臺式低溫高速離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)、核酸電泳儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、蛋白質(zhì)電泳裝置：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2材料

2×Taq PCR MasterMix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒和DH5α：北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品； CRIP1抗體：英國Abcam公司產(chǎn)品；CCK8試劑盒：日本Dojindo公司產(chǎn)品；pcDNA3.1(+)、pLVX-IRES-Zsgreen1和A549/DDP：均為實驗室保存；DMEM、RPMI 1640、PBS和雙抗：加拿大Wisent公司產(chǎn)品；DTT：德國Merck公司產(chǎn)品；IAM：美國Sigma公司產(chǎn)品；胰酶(質(zhì)譜級)：美國Promega公司產(chǎn)品；TMT試劑和乙腈：美國Thermo公司產(chǎn)品。

1.3實驗方法

1.3.1目的基因的獲取與載體構(gòu)建 首先從肺癌順鉑耐藥細胞(A549/DDP，下同)中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，所用上游引物為5’-CCCAAGCTTGGGATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGCCC-AAGTGTCCCAAGTG-3’，下游引物為5’-CGCGGATCCGCGTTACTTGAAAGTGTG-GCTCTCGG-3’進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，產(chǎn)物回收。分別用HindIII和BamHI回收的目的片段和pcDNA3.1(+)載體進行雙酶切。PCR目的片段與載體連接，進行連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。

構(gòu)建pLVX-CRIP1-IRES-Zsgreen1質(zhì)粒，以pcDNA3.1(+)-CRIP1質(zhì)粒為模板進行亞克隆設(shè)計CRIP1引物，以5’-GGAATTCCATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGCC-CAAGTGTCCCAAGTG-3’為上游引物，以5’-GCTCTAGAGCTTACTTGAAAGTGTGGCTCTCGG-3’為下游引物，進行PCR實驗和產(chǎn)物回收。用EcoRI和XbaI進行雙酶切，依次進行連接、轉(zhuǎn)化和測序。

1.3.2細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染 用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞至70%左右用于慢病毒包裝。用3種輔助質(zhì)粒(pLP1∶pLP2∶VSVG=2∶3∶2)，pLVX-CRIP1-IRES-Zsgreen1作為主質(zhì)粒，對照組用pLVX-IRES-Zsgreen1作為主質(zhì)粒，分別在293T細胞中進行慢病毒顆粒包裝，獲得包裝完成的慢病毒顆粒并進行濃縮。

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549/DDP細胞系用于過表達CRIP1，將A549/DDP鋪于24孔板，細胞密度為30%～40%，加入一定量濃縮后的慢病毒顆粒和終濃度7 mg/L的聚凝胺溶液，感染6 h，換成含有10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，可通過熒光顯微鏡觀察是否具有綠色熒光，長滿至100 mm平皿。

選取綠色熒光較強的平皿，作為選定的多克隆細胞，一部分用于實時熒光定量核算擴增(qPCR)鑒定，一部分用于分選單克隆，用流式細胞儀分選GFP單細胞于96孔板，培養(yǎng)一段時間后挑選亮度較高的細胞系擴大培養(yǎng)，進一步鑒定。

1.3.3穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的鑒定 提取上一步的多克隆細胞系，進行CRIP1過表達qPCR鑒定。用Trizol試劑提取細胞總RNA，配置逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)體系，對以cDNA為模板的CRIP1的qPCR引物進行qPCR檢測，采用SYBR Green Master Mix配置反應(yīng)體系，每組3個平行實驗，使用的儀器是Roche，結(jié)果用2-ΔΔCt法分析，內(nèi)參基因為Actin。

利用Western Blotting鑒定單克隆細胞系CRIP1過表達。選取2種熒光顯微鏡下較亮的過表達單克隆細胞系(CRIP1-OE1和CRIP1-OE2)和1種對照組細胞系(Control)提取全蛋白，用BCA(bicinchoninic acid)法測定并計算蛋白濃度，取等量的蛋白煮沸變性后，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，封閉1 h，CRIP1一抗于4 ℃孵育過夜并回收，洗膜，二抗于室溫孵育1 h，洗膜。加入ECL發(fā)光液反應(yīng)1 min，置于Bio-rad凝膠成像儀成像。

1.3.4細胞生長曲線的檢測 用胰酶將CRIP1-OE和Control細胞從100 mm培養(yǎng)皿消化下來，收取細胞；使用血球計數(shù)法將細胞濃度調(diào)整為30 000個/毫升，加入96孔板(每孔100 μL)，設(shè)置4組平行實驗；分別在0、12、24、36、48、60、72、84、96 h以10∶1加入CCK8，2 h后測定450 nm吸光度值，并繪制細胞生長曲線，對比CRIP1-OE和Control組的細胞增殖速度。

1.3.5細胞順鉑耐藥性的檢測 用胰酶將CRIP1-OE和Control細胞從100 mm培養(yǎng)皿消化下來，以800 r/min離心5 min后收取細胞，用培養(yǎng)基重懸，使用血球計數(shù)法調(diào)整細胞濃度為20 000個/毫升，加入96孔板培養(yǎng)至貼壁牢固，設(shè)置3組平行實驗；以0、40、80、120、160、200、240、320、400 μmol/L順鉑作用于細胞24 h，用CCK8計數(shù)，通過測量細胞的存活率研究CRIP1對細胞耐藥性的影響。

1.3.6定量蛋白質(zhì)組學分析 定量蛋白質(zhì)組學分析包括以下四個步驟：第一步，蛋白提取。利用胰酶分離100 mm培養(yǎng)皿中貼壁的CRIP1-OE細胞和Control組細胞，分別收集于1.5 mL的EP管，用PBS洗2～3次，然后，用適量的8 mol/L尿素充分裂解，高速離心20 min，取上清用BCA試劑盒測量蛋白濃度，取100 μg蛋白，稀釋至濃度1 g/L以下。

第二步，溶液內(nèi)酶解。在室溫下向蛋白溶液中加入適量的DTT，反應(yīng)1 h；避光并加入適量的IAM，反應(yīng)30 min；加入PBS稀釋尿素；按照與蛋白1∶50比例加入質(zhì)譜級胰酶，于37 ℃反應(yīng)14 h，用10% TFA終止反應(yīng)，調(diào)節(jié)pH為2左右。

第三步，樣品除鹽、TMT標記和鑒定。用Sep-Pak C18除鹽柱，依次經(jīng)活化、平衡、上樣(3次過柱)、漂洗和洗脫5個步驟，使用的試劑依次是乙腈、0.1%TFA、50%ACN+0.1%TFA，除鹽后離心，用100 mmol/L TEAB復(fù)溶，調(diào)至pH 8；向CRIP1-OE組中加入TMT6-128試劑，Control組中加入TMT6-131試劑，于室溫反應(yīng)1 h，用羥胺終止反應(yīng)，合并兩種樣品，揮去TMT試劑中的乙腈，再次進行除鹽、揮干，用0.1%FA復(fù)溶至100 μL，進行HPLC分離肽段，后續(xù)在蛋白質(zhì)組學平臺上進行二級質(zhì)譜鑒定。

第四步，蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)分析。采用Protein Discoverer(Thermo)軟件搜索數(shù)據(jù)庫，找到鑒定蛋白。根據(jù)軟件評分，選取大于4分的蛋白質(zhì)進行分析。上調(diào)蛋白的標準是TMT比值大于1.5，下調(diào)同理。用Panther軟件對上調(diào)和下調(diào)蛋白進行聚類分析。

2 實驗結(jié)果

2.1CRIP1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建結(jié)果及鑒定

將構(gòu)建成功的真核表達載體pcDNA3.1(+)-CRIP1酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定的目的條帶符合預(yù)期大小，測序結(jié)果證實了目的條帶已與載體連接。亞克隆的測序結(jié)果證實了pLVX-CRIP1-IRES-Zsgreen1質(zhì)粒構(gòu)建成功。用pLVX-CRIP1-IRES-Zsgreen1質(zhì)粒包裝病毒顆粒侵染A549/DDP細胞后，選取較亮的多克隆細胞進行qPCR分析，證明質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細胞并表達CRIP1，示于圖1a。對篩選出的過表達細胞系CRIP1-OE1、CRIP1-OE2和轉(zhuǎn)入空載的Control細胞進行Western Blotting分析，發(fā)現(xiàn)在CRIP1過表達細胞中CRIP1表達量明顯增加，證明過表達細胞系構(gòu)建成功，示于圖1b。

2.2CRIP1對細胞增殖和耐藥性的影響

用CCK8試劑盒測量細胞數(shù)目，根據(jù)繪制的細胞生長曲線，發(fā)現(xiàn)與對照組細胞相比，CRIP1-OE細胞系生長速度明顯加快，表明CRIP1能夠促進細胞增殖。從第48 h開始，能夠明顯看到細胞數(shù)目的顯著差異，到96 h時，差異更加明顯，測量CRIP1-OE細胞吸光度為3.11，對照組為2.65，說明CRIP1-OE細胞的表型之一是增殖速度加快，示于圖2a。通過1.3.5節(jié)的方法檢測CRIP1-OE細胞的順鉑耐藥性，比較實驗組和對照組細胞存活率，發(fā)現(xiàn)實驗組的細胞存活率大于對照組。實驗結(jié)果表明，CRIP1過表達增強了A549/DDP細胞的耐藥性，示于圖2b。

注：a.CRIP1過表達細胞和Control細胞中CRIP1 mRNA的水平；b.CRIP1過表達細胞和Control細胞中CRIP1蛋白的表達水平圖1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中CRIP1過表達的驗證Fig.1 Confirmation of CRIP1 overexpression in stably transfected cells

2.3CRIP1過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的蛋白質(zhì)組學分析

為了理解CRIP1在細胞中的生物學功能，對CRIP1過表達的A549/DDP細胞和對應(yīng)的Control細胞進行基于TMT標記的定量蛋白質(zhì)組學分析。共鑒定到4 525個蛋白，其中上調(diào)蛋白質(zhì)(比值>1.5)152個，下調(diào)蛋白質(zhì)(比值<0.67)142個。用Panther軟件對所有變化的蛋白質(zhì)進行聚類分析，結(jié)果表明，CRIP1過表達能夠影響代謝過程、細胞組成、生物學調(diào)控、細胞粘附、細胞增殖等細胞過程，尤其對細胞初級代謝中含氮化合物的代謝有較大影響，示于圖3。

為了證實CRIP1的表達量變化，鑒定到了CRIP1蛋白胰酶降解后被TMT標記的一個肽段：TLTSGGHAEHEGKPYCNHPCYAAMFGPK。該肽段的二級質(zhì)譜圖示于圖4a，其中碰撞碎裂后產(chǎn)生的b、y系列離子與肽段序列匹配，斷裂形成的TMT報告基團質(zhì)量分別為128.13 Da和131.11 Da，其離子強度比值為2.4∶1，說明該肽段在CRIP1過表達細胞的含量是對照細胞的2.4倍。對CRIP1的全部二級譜圖的定量結(jié)果進行平均，計算出CRIP1在過表達細胞系中升高了4倍左右。同理，鑒定了煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(NAMPT)降解后被TMT標記的一個肽段VLEILGK，其二級圖譜顯示該肽段相較于對照細胞升高了1.7倍，將NAMPT的全部二級圖譜的定量結(jié)果進行平均，計算出NAMPT在CRIP1過表達細胞系中升高了1.7倍，示于圖4b。同時，在定量蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)NAD依賴型氧化還原酶表達量增加，例如AKR1C1和AKR1B10分別上調(diào)2.3倍和2.1倍，示于圖5。

注：a.CRIP1過表達細胞和Control細胞的生長曲線；b.順鉑刺激下CRIP1過表達細胞和Control細胞的存活率曲線圖2 CRIP1過表達對細胞生長和耐藥性的影響Fig.2 Effects of CRIP1 overexpression on cell growth and drug resistance

圖3 CRIP1過表達細胞與對照細胞差異表達蛋白的聚類分析Fig.3 GO analysis of differentially expressed proteins between CRIP1 overexpressing cells and the control cells

注：a.TMT標記過的CRIP1酶解肽段TLTSGGHAEHEGKPYCNHPCYAAMFGPK的二級質(zhì)譜圖；b.TMT標記過的NAMPT酶解肽段VLEILGK的二級質(zhì)譜圖圖4 CRIP1過表達細胞和Control細胞中CRIP1和NAMPT表達的定量蛋白質(zhì)組學分析Fig.4 Quantitative proteomics analysis of CRIP1 and NAMPT expression in CRIP1 overexpression and the control cells

圖5 蛋白質(zhì)組學中NAD依賴型氧化還原酶的表達Fig.5 Expression of oxidoreductase dependent on NAD in proteomics analysis

3 討論

本研究構(gòu)建了CRIP1過表達細胞系，發(fā)現(xiàn)CRIP1過表達可使細胞生長速度加快，耐藥性增強。通過蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)CRIP1過表達會影響細胞的代謝過程，尤其會導(dǎo)致NAMPT上調(diào)。NAMPT是細胞內(nèi)NAD合成的限速酶，可以將煙酰胺轉(zhuǎn)化為哺乳動物的煙酰胺單核苷酸，進而合成NAD[13]，主要影響補救途徑[14]。它在很多腫瘤中高表達，其中包括乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤等實體瘤[15]和血液瘤[16]。腫瘤細胞代謝與NAMPT的調(diào)節(jié)作用有關(guān)，可以通過影響NAD依賴的酶(如SIRT家族和PARP家族)[17-18]，維持細胞NAD水平。另外，NAMPT在清除細胞內(nèi)ROS方面，可以與GSH系統(tǒng)相互作用，從而減輕藥物處理引發(fā)的ROS對細胞的殺傷作用[19]。也有一些研究認為，通過影響細胞內(nèi)NAD含量的變化，NAMPT保障了糖酵解和線粒體呼吸鏈代謝需求[20]，從而維持了線粒體穩(wěn)態(tài)并增加了細胞的耐藥性。NAMPT還與腫瘤預(yù)后有關(guān)[21-22]。其高表達可能導(dǎo)致細胞內(nèi)NAD的增加，從而引起NAD依賴的氧化還原酶表達上調(diào)，促進肺癌細胞的生長。

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QuantitativeProteomicsAnalysisonBiologicalFunctionofCRIP1

YANG Chao, HUO Yi, DENG Hai-teng

(MOEKeyLaboratoryofBioinformatics,SchoolofLifeSciences,TsinghuaUniversity,Beijing100084,China)

The aim of the present study is to investigate the effects of cysteine-rich intestinal protein (CRIP1) over-expression on cellular processes using proteomics. CRIP1 is a protein that contains a double zinc finger domain, and is highly expressed in many tumor cells, but its roles in lung cancer cells remain elusive. In this study, the CRIP1 gene was cloned and used pLVX-IRES-Zsgreen1 lentiviral vector that encodes a GFP to transfect A549/DDP cells that was a cisplatin resistant cells as compared to A549 cells. The real-time quantitative PCR (qPCR) was used to confirm the transfection efficiency of CRIP1. Flow cytometry was used to isolate single cells, which was seeded into a 96-well plate and cultured to obtain monoclonal cell lines. The monoclonal cell lines with high brightness were screened by fluorescence microscopy and CRIP1 over-expression was confirmed by western blot analysis, indicating that a stable cell line was established successfully, in which CRIP1 was over-expressed. The growth curves of CRIP1 over-expression cells and the control cells were measured by the CCK8 assay. It showed that CRIP1 over-expression increased cell proliferation. CRIP1 over-expression cells and the control cells were also treated with cisplatin at different concentrations for 24 h and examined the viability of cisplatin-treated cells. Results showed that CRIP1 over-expression enhanced cells’ resistance to cisplatin.

To further explore the mechanism underlying CRIP1 over-expression mediated cellular processes, quantitative proteomics was applied to identify differentially expressed proteins between the control and CRIP1 over-expression cells. The quantitative proteomics was carried out using the TMTsixplexTMIsobaric Label Reagent, which modified the free amino group at the peptideN-terminus and lysine residues. Modified peptides generated reporter ions in MS/MS spectra to provide quantitative information about the proteins being analyzed. It was found that CRIP1 over-expression upregulated the expressions of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), which was the rate limiting enzyme in the scavenge pathway for production of the intracellular nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). The CRIP1 over-expression mediated upregulation of NAMPT can increase the cellular NAD level. It was also revealed that CRIP1 over-expression upregulated expressions of NAD-dependent oxidoreductases, such as aldo-keto reductase family 1 member C1 (AKR1C1) and aldo-keto reductase family 1 member B10 (AKR1B10). Extensive studies have reported that NAD is essential for the cellular anti-oxidant systems and for maintaining mitochondrial integrity. The results suggest that the CRIP1 over-expression mediated NAMPT upregulation contributed to the enhanced cell growth and resistance to cisplatin.

cysteine-rich intestinal protein 1 (CRIP1); overexpression; growth rate; proteomics; nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT)

2017-04-17;

2017-05-25

科技部973項目(2014CBA02005)資助

楊 超(1991—)，女(滿族)，河北承德人，碩士研究生，生物學專業(yè)。E-mail: hiyangchao@163.com

鄧海騰(1964—)，男(漢族)，云南宣威人，博士生導(dǎo)師，從事蛋白質(zhì)組學研究。E-mail: dht@mail.tsinghua.edu.cn

O657.3

：A

：1004-2997(2017)04-0486-08

10.7538/zpxb.2017.0077