周瑞琪，劉 潔，劉 輝，杭太俊

(1.中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2.海南省食品藥品檢驗所，海南 ?？?570100)

LC/MS用于匹多莫德有關物質結構鑒定

周瑞琪1，劉 潔2，劉 輝2，杭太俊1

(1.中國藥科大學藥物分析教研室，江蘇 南京 210009；2.海南省食品藥品檢驗所，海南 ?？?570100)

采用液相色譜-質譜(LC/MS)技術鑒定匹多莫德的有關物質，選取Sepax GP-C8色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)，以甲醇-三氟乙酸溶液為流動相，梯度洗脫，對匹多莫德有關物質進行分離；采用電噴霧正離子化-高分辨飛行時間質譜法(ESI-TOF MS)測定各有關物質離子的準確質量和元素組成，三重四極桿串聯(lián)質譜(ESI-MS/MS)測定子離子特征。結果表明：在所建立的條件下，匹多莫德及其有關物質的分離良好，檢測并鑒定出11個主要有關物質。該技術能有效地分離鑒定匹多莫德中的有關物質，其鑒定結果可為質量控制和工藝優(yōu)化提供參考。

匹多莫德；有關物質；降解產(chǎn)物；結構鑒定；液相色譜-質譜(LC/MS)

圖1 匹多莫德的化學結構Fig.1 Chemical structure of pidotimod

匹多莫德(pidotimod,(R)-3-[(S)-(5-氧代-2-吡咯烷基)羰基]-四氫噻唑-4-羧酸)是一種化學合成的口服免疫促進劑，其化學結構類似于二肽，示于圖1。20世紀80年代后期，該化合物由意大利Poli化學公司成功合成，并于1993年獲準上市應用于臨床，目前上市劑型有片劑、膠囊、口服溶液和散劑等[1]。它既可以促進非特異性免疫反應，又可以促進特異性免疫反應，具有顯著的抗病毒、抗感染、抗氧化和抗刺激等作用[2-4]。匹多莫德可以用于多種疾病的輔助治療，比如，臨床上常用于呼吸道疾病的預防及治療[5-9]，及細菌感染、病毒感染和復發(fā)性口瘡、白癜風、過敏性紫癜等與免疫功能失衡的有關疾病的治療[3,10-11]。

關于匹多莫德的質量研究和生物樣本分析已有文獻報道[12-19]，其中涉及到的液相色譜-質譜(LC/MS)方法的建立尚不完善。該方法多在流動相中添加甲酸和乙酸等存在末端吸收的成分[12-16]，對匹多莫德及其有關物質的紫外吸收干擾較大，目前仍未有完善的LC/MS方法對匹多莫德有關物質進行分析鑒定。有關物質檢測方法的液相條件多在流動相中添加磷酸和磷酸鹽等非揮發(fā)性物質[17-19]，不適用于LC/MS檢測。

本工作擬建立適用于匹多莫德有關物質檢查的LC/MS方法，通過飛行時間質譜(TOF MS)和三重四極桿串聯(lián)質譜(MS/MS)分別測定有關物質的準確質量和二級質譜，并且通過與對照品比對、二級質譜裂解解析、合成工藝分析，推測它們的結構，希望為匹多莫德的生產(chǎn)工藝和質量控制提供方法參考和依據(jù)。

1 實驗部分

1.1主要儀器與裝置

1290 Infinity 液相色譜-6224飛行時間質譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品，配有二極管陣列檢測器、電噴霧離子源和MassHunter工作站；TSQ Quantum Ultra AM型MS/MS聯(lián)用儀：美國Thermo公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源和Xcalibur3.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2試藥與試劑

匹多莫德原料藥(批號：04.1015-160613)：浙江仙琚制藥股份有限公司產(chǎn)品；雜質A、B對照品：江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司蘇州制藥廠產(chǎn)品；三氟乙酸：純度99%，薩恩化學技術有限公司產(chǎn)品；甲醇：色譜純，美國Tedia公司產(chǎn)品；去離子水：杭州娃哈哈公司產(chǎn)品。

1.3實驗條件

1.3.1色譜條件 色譜柱為Sepax GP-C8(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動相：A為0.005%三氟乙酸溶液， B為甲醇；線性梯度洗脫：0 min(95%A)→20 min(95%A)→35 min(90%A)→36 min(95%A)→40 min(95%A)；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；檢測波長210 nm。

1.3.3MS/MS質譜條件 三重四極桿質譜電噴霧離子源,正離子檢測模式；噴霧電壓3.5 kV；鞘氣(N2)壓力310 kPa；輔助氣(N2)壓力10 kPa；毛細管溫度350 ℃；碰撞氣(Ar)0.20 Pa；碰撞能量10～30 eV。

1.4樣品制備

1.4.1供試品溶液的制備 精密稱定10 mg匹多莫德原料藥，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇-水溶液(5∶95，V/V)溶解樣品并稀釋至刻度，搖勻即得供試品溶液。精密量取適量上述溶液，加溶樣液定量稀釋，分別制成1%和0.1%的自身對照溶液。

1.4.2對照品溶液的制備 取適量各對照品，分別精密稱定，加溶樣液溶解并定量稀釋成1 g/L樣品；各取1 mL對照品溶液和堿破壞樣品，混合均勻，即得混合對照品溶液。

1.4.3強制降解實驗溶液的制備 強制降解條件如下：酸破壞(1 mL 4 mol/L HCl，室溫，3 h)，堿破壞(1 mL 1 mol/L NaOH，室溫，2 h)，氧化破壞(1 mL 3%H2O2，室溫，5 min)，熱破壞(2 mL 溶樣液，90 ℃水浴，5 h)和光照破壞(4 500 lx±500 lx，15 d)。酸破壞和堿破壞在稀釋前使用相應的NaOH溶液和HCl溶液中和，所有破壞樣最終使用溶樣液稀釋成約含1 g/L的強制降解實驗溶液。

2 結果與討論

2.1有關物質檢測

本實驗采用HPLC法分析匹多莫德有關物質，在優(yōu)化的色譜條件下，匹多莫德原料藥及強制降解實驗供試溶液的各有關物質均得到良好分離，測得的各有關物質保留時間從小到大依次編號，其色譜圖示于圖2。圖2a顯示原料藥中雜質含量較少，采用自身0.1%對照法估算有關物質含量，只有雜質9的含量大于0.1%。強制降解實驗結果表明：在氧化條件下主要降解為有關物質2和3(圖2b)；在高溫條件下主要降解為有關物質1、4、9和11(圖2c)；在強酸條件下主要降解為有關物質1、4、5、9和11(圖2d)；在強堿條件下主要降解為有關物質1、4、5、8、9和11(圖2e)；在光照條件下主要降解為有關物質1、2、4、6、7、9和11(圖2f)。未在供試品及強制降解樣品中檢測到雜質對照品B(有關物質10)。

2.2有關物質結構分析

HPLC-ESI+-TOF MS測得各有關物質母離子的準確質量與離子組成，三重四極桿質譜獲取二級質譜碎片信息，通過與匹多莫德及其有關物質對照品二級質譜碎片離子的對比分析，鑒定各有關物質結構，結果示于表1和圖3。

ESI+-TOF MS測得匹多莫德[M+H]+離子的準確質量為245.058 3，與離子式C9H13N2O4S+相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z227、199、134、88、84；匹多莫德的二級碎片離子中，m/z88 碎片與有關物質10一致，來源于相同的噻唑烷結構；m/z84碎片與有關物質4一致，來自相同的吡咯烷酮結構；m/z227與[M+H]+離子中氨基與羧基縮合脫去H2O相應；m/z134為酰胺鍵斷裂而產(chǎn)生的特征碎片；m/z199與[M+H]+離子中噻唑烷環(huán)脫去HCOOH相應，該離子進一步發(fā)生酰胺鍵斷裂產(chǎn)生m/z84離子。匹多莫德的二級質譜分析結果示于圖4，該結果對其有關物質的解析確證具有參考意義。

注：a.原料藥供試品；b.氧化破壞；c.高溫破壞；d.酸破壞；e.堿破壞；f.光照破壞；g.混合對照品圖2 匹多莫德及其強制降解樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of pidotimod and the degradation samples from stress tests

表1 匹多莫德有關物質結構的LC-TOF MS和LC-MS/MS鑒定結果Table 1 Identified results of related substances of pidotimod by LC-TOF MS and LC-MS/MS

圖3 匹多莫德有關物質結構圖Fig.3 Chemical structures of the related substances of pidotimod

圖4 匹多莫德[M+H]+(m/z 245)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.4 MS/MS spectrum of pidotimod [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

圖5 有關物質1[M+H]+(m/z 134)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.5 MS/MS spectrum of related substance 1 [M+H]+(m/z 134) ion and its fragmentation pathways

有關物質1：ESI+-TOF MS測得有關物質1[M+H]+離子的準確質量為134.026 6，與離子式C4H8NO2S+相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z88，與噻唑烷結構相應。該有關物質在酸、堿、熱和光照破壞中均有產(chǎn)生，為易降解產(chǎn)生的雜質，結合其質譜信息，鑒定為匹多莫德兩個環(huán)之間酰胺鍵的水解產(chǎn)物，結果示于圖5。

有關物質2：ESI+-TOF MS測得有關物質2[M+H]+離子的準確質量為261.051 1，與離子式C9H13N2O5S+相應，比匹多莫德質量數(shù)多16，與增加1個氧原子相應；MS/MS主要特征碎片離子為m/z243、225、215、197、150、132、104和84，其中m/z243、150均比匹多莫德相應的特征碎片離子m/z227和134多16，故有關物質2可能為匹多莫德的噻唑烷環(huán)生成亞砜后的產(chǎn)物，其質譜信息及裂解途徑示于圖6。

有關物質3：ESI+-TOF MS測得有關物質3[M+H]+離子的準確質量為243.040 4，與離子式C9H11N2O4S+相應，比有關物質2質量數(shù)少18，與脫去一分子H2O相應；MS/MS主要特征碎片離子為m/z225、215、197、132、104和84，均存在于有關物質2的二級碎片離子中，故推測其為有關物質2的羧基與氨基縮合產(chǎn)生，其質譜信息及裂解途徑示于圖7。

圖6 有關物質2[M+H]+(m/z 261)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.6 MS/MS spectrum of related substance 2 [M+H]+(m/z 261) ion and its fragmentation pathways

圖7 有關物質3[M+H]+(m/z 243)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.7 MS/MS spectrum of related substance 3 [M+H]+(m/z 243) ion and its fragmentation pathways

有關物質5：ESI+-TOF MS測得有關物質5[M+H]+離子的準確質量為263.069 4，與離子式C9H15N2O5S+相應，比匹多莫德質量數(shù)多18，與增加一分子H2O相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z245、227、134。該有關物質在酸、堿和高溫破壞樣品中均明顯增加，其二級碎片離子與匹多莫德及其特征碎片一致，故推測為吡咯烷酮環(huán)上的酰胺鍵水解產(chǎn)生，其質譜信息及裂解途徑示于圖8。

有關物質6：ESI+-TOF MS測得有關物質6[M+H]+離子的準確質量為104.016 5，與離子式C3H6NOS+相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z86、60、58、45。該有關物質僅存在于光照破壞樣品中，分子質量較小，且m/z104 存在于氧化破壞產(chǎn)生的有關物質2和3的二級碎片中，故推測為氧化產(chǎn)物斷裂產(chǎn)生的小分子有關物質，其質譜信息及裂解途徑示于圖9。

有關物質7：ESI+-TOF MS測得有關物質7[M+H]+離子的準確質量為261.055 3，與離子式C9H13N2O5S+相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z215、84。該有關物質比匹多莫德質量數(shù)多16，可能為匹多莫德氧化產(chǎn)物，其二級碎片離子m/z84 為吡咯烷酮結構特征碎片，且無明顯的噻唑烷結構碎片離子，推測其噻唑烷結構發(fā)生變化不易在二級質譜中攜帶正電荷，有關物質7為匹多莫德噻唑烷環(huán)的氮被氧化為氧化胺后的產(chǎn)物，其質譜信息及裂解途徑示于圖10。

圖8 有關物質5[M+H]+(m/z 263)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.8 MS/MS spectrum of related substance 5 [M+H]+(m/z 263) ion and its fragmentation pathways

圖9 有關物質6[M+H]+(m/z 104)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.9 MS/MS spectrum of related substance 6 [M+H]+(m/z 104) ion and its fragmentation pathways

有關物質8：ESI+-TOF MS測得有關物質8[M+H]+離子的準確質量為245.058 9，與離子式C9H13N2O4S+相應，MS/MS主要特征碎片離子為m/z227、188、134、88、84，該有關物質為堿破壞的典型產(chǎn)物，與匹多莫德互為同分異構體，二級碎片多數(shù)與匹多莫德一致，m/z188為其特有的碎片離子，推測為匹多莫德環(huán)合再水解產(chǎn)生的同分異構體，其質譜信息及裂解途徑示于圖11。

圖10 有關物質7[M+H]+(m/z 261)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.10 MS/MS spectrum of related substance 7 [M+H]+(m/z 261) ion and its fragmentation pathways

圖11 有關物質8[M+H]+(m/z 245)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.11 MS/MS spectrum of related substance 8 [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

有關物質9：ESI+-TOF MS測得有關物質9[M+H]+離子的準確質量為227.048 8，與離子式C9H11N2O3S+相應，比匹多莫德質量數(shù)少18，與脫去一分子H2O相應；MS/MS主要特征碎片離子為m/z199、181、170、88、84，該有關物質在供試品和酸、堿、高溫、光照樣品中均被檢測到，為較易產(chǎn)生的雜質，推測為匹多莫德分子內形成酰胺鍵環(huán)合產(chǎn)生，其質譜信息及裂解途徑示于圖12。

有關物質10：ESI+-TOF/MS測得有關物質10(雜質對照品)[M+H]+離子的準確質量為162.058 3，與離子式C6H12NO2S+相應；MS/MS主要特征碎片離子為m/z88，該有關物質在強制降解實驗樣品和供試品中均未檢出，m/z88碎片離子來源于其結構中的噻唑烷環(huán)，有關物質10的二級質譜分析結果對其他有關物質的解析具有參考意義。

有關物質11：ESI+-TOF MS測得有關物質11[M+H]+離子的準確質量為245.059 0，與離子式C9H13N2O4S+相應，與匹多莫德質量數(shù)相同；MS/MS主要特征碎片離子為m/z227、199、88、84，與匹多莫德二級碎片離子相比，m/z134的二級碎片離子不明顯，說明噻唑烷環(huán)相關結構發(fā)生變化，該有關物質在酸、堿、高溫和光照實驗中含量均明顯增加，推測為匹多莫德分子內脫水縮合后異位酰胺鍵水解產(chǎn)生，其質譜信息及裂解途徑示于圖13。

圖12 有關物質9[M+H]+(m/z 227)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.12 MS/MS spectrum of related substance 9 [M+H]+(m/z 227) ion and its fragmentation pathways

圖13 有關物質11[M+H]+(m/z 245)離子的二級質譜圖及其裂解途徑Fig.13 MS/MS spectrum of related substance 11 [M+H]+(m/z 245) ion and its fragmentation pathways

3 結論

本研究建立了揮發(fā)性流動相液相色譜-質譜聯(lián)用方法分析匹多莫德有關物質，匹多莫德與檢出的11個主要有關物質均可得到有效分離。緩沖溶液pH值是影響色譜保留的關鍵因素，pH降低可以增強高極性有關物質的色譜保留，而常用的甲酸和乙酸等pH調節(jié)劑對210 nm的檢測波長干擾較大。為兼顧色譜分離和紫外檢測靈敏度，本研究選用0.005%三氟乙酸溶液作為水相流動相，甲醇作為有機相流動相，結合梯度洗脫的色譜方法實現(xiàn)了匹多莫德與11種主要有關物質的良好分離。

本實驗檢出并鑒定了匹多莫德的11個主要有關物質，其中2個(有關物質4、10)為已知雜質，4個(有關物質1、2、8、9)已有文獻報道[17]，另外5個為未知雜質。根據(jù)雜質來源可將所有有關物質分為工藝雜質和降解雜質。有關物質1～9和11均在強制降解樣品中明顯增加，可歸屬于降解雜質；有關物質1、4和10作為起始原料或中間體參與匹多莫德的合成，故也有可能來源于合成工藝雜質。

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IdentificationoftheRelatedSubstancesofPidotimodbyLC/MS

ZHOU Rui-qi1, LIU Jie2, LIU Hui2, HANG Tai-jun1

(1.ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing210009,China; 2.HainanProvincialInstituteforDrugandFoodControl,Haikou570100,China)

Pidotimod (3-L-pyroglutamyl-L-thiaziolidine-4 carboxylic acid) is a synthetic dipeptide molecule with immunomodulatory properties. Since the early 90’s, a wide scientific production has been published about it. As it’s effective in the treatment of people infected with bacteria and viruses, it is used in the treatment of repeated infections of the respiratory, urogenital, and ear, nose, throat systems. Pidotimod therapy is a reliable, simple, and safe approach to treat children with recurrent respiratory infections. Liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS) method has been used for determination of pidotimod in different biological matrices. Only a few HPLC-UV methods have been reported for the quantification of the related substances in pidotimod and its formulation. The reported LC/MS methods usually use formic acid or acetic acid in the mobile phase which are not suitable for UV detector, and the separation is not feasible for the related substances. And the reported HPLC-UV methods usually use phosphate and phosphoric acid in the mobile phase which are not suitable for mass spectrometry detector. However, there is no reliable LC/MS method for identification of the related substances in pidotimod. In this paper, a LC/MS method was developed for the separation and characterization of process related substances and the major degradation products in pidotimod. Electrospray positive ionization high resolution time-of-flight mass spectrometer (ESI-TOF MS) was used for the determination of the accurate mass and elemental composition of the parent ions of the related substances, and triple quadrupole tandem mass was employed for the product mass spectra determination. The separation was performed on a Sepax GP-C8 column (250 mm×4.6 mm×5 μm) using 0.005% trifluoroacetic acid (TFA) in water as mobile phase A and methanol as mobile phase B. The flow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was set at 30 ℃. Analytes were monitored at 210 nm. The injection volume was 20 μL. Pidotimod was tending to degrade under acid, alkaline, oxidative, thermal stress and photolytic stress. The structures of the related substances were then figured out through elucidation of the fragment ions. A total of 11 related substances were detected and characterized, including process related substances (related substances 1 and 4) and degradation products. Related substances 4 and 10 were identified by synthetic reference and related substances 1, 2, 8 and 9 were reported before this study, while related substances 3, 5, 6, 7 and 11 were reported for the first time. The method is effective for separation and identification of the related substances of pidotimod, and the results are useful for the quality control and process optimization of pidotimod.

pidotimod; related substances; degradation products; structure identification; liquid chromatography-mass spectrometry (LC/MS)

2016-12-22;

2017-05-10

周瑞琪(1991—)，女(漢族)，山東人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: ruiqi_qiqi@163.com

杭太俊(1963—)，男(漢族)，江蘇人，博士生導師，從事藥物分析研究。E-mail: hangtj@cpu.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0433-10

10.7538/zpxb.2016.0207