周 韋，劉易昆，陳子林

(武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430071)

毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及其在藥物和生物分析中的應(yīng)用

周 韋，劉易昆，陳子林

(武漢大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430071)

毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)聯(lián)用技術(shù)是在液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項新型分析技術(shù)，它結(jié)合了毛細管電泳具有的分離效率高、分離速度快、樣品消耗量少以及質(zhì)譜檢測具有的高靈敏度和強結(jié)構(gòu)解析能力等優(yōu)點，現(xiàn)已成為倍受分析化學(xué)工作者關(guān)注的新型微量分析技術(shù)。目前，CE-MS聯(lián)用技術(shù)是中藥有效成分分析，體內(nèi)藥物分析以及生物樣品，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和多糖等分析的重要手段。本文對CE-MS聯(lián)用技術(shù)中同軸鞘流及無鞘流納流電噴霧等幾種接口裝置的研究進展，CE-MS技術(shù)在中藥活性成分分析及多級質(zhì)譜結(jié)構(gòu)解析以及氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)等生物樣品分析中的應(yīng)用研究進行了綜述，并對該技術(shù)的發(fā)展進行了展望。

毛細管電泳-質(zhì)譜(CE-MS)；電噴霧離子化接口裝置；藥物分析；生物分析；綜述

毛細管電泳(CE)具有分離速度快、樣品消耗量少、分離效率高等特點。目前，用于毛細管電泳的檢測器主要有紫外(UV)、激光誘導(dǎo)熒光(LIF)和質(zhì)譜(MS)。在CE與UV聯(lián)用時，由于毛細管電泳內(nèi)徑一般只有幾十微米左右，其進樣量相對較小，且紫外檢測器光程較短，導(dǎo)致了CE-UV方法的檢測靈敏度較低，在檢測痕量樣品時，尤其是在檢測較為復(fù)雜的生物樣品基質(zhì)時受到限制。雖然LIF檢測器靈敏度較高，但其檢測對象必須能夠發(fā)射熒光，對于沒有熒光信號的物質(zhì)，常常需要經(jīng)過復(fù)雜的衍生化處理，另外，商品化的毛細管電泳儀由于激光誘導(dǎo)熒光檢測器檢測波長單一，故受到激發(fā)光波長的限制，導(dǎo)致CE-LIF技術(shù)的應(yīng)用范圍受到一定的限制。MS檢測器具有高選擇性、高靈敏度的特點，此外，它還可以準確地測定化合物的相對分子質(zhì)量，并提供結(jié)構(gòu)信息，對于復(fù)雜樣品特別是未知樣品的檢測是一種理想的方法。CE-MS聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展結(jié)合了毛細管電泳在分離上以及質(zhì)譜在檢測上的優(yōu)勢，在微量復(fù)雜樣品的分析中體現(xiàn)出自身的優(yōu)勢。自1987年Smith等[1]首次提出該技術(shù)以來，CE-MS聯(lián)用裝置及應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注與研究，并得到了快速發(fā)展。

CE-MS技術(shù)的發(fā)展對毛細管電泳以及質(zhì)譜的應(yīng)用起著促進作用。一方面，MS為CE提供了一種高選擇性和高靈敏度的檢測手段，并且不會影響毛細管電泳中樣品的分離；另一方面，CE為MS檢測提供了高效分離過程，比較適合復(fù)雜的分析對象，如藥物及生物樣品。因此，CE-MS作為一種快速、高效的分析手段，在藥物及生物樣品分析中倍受關(guān)注。與常用的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)相比，CE-MS技術(shù)需要的樣品量更少、分離效率更高、分析速度更快，在蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域中，已經(jīng)作為HPLC-MS的補充應(yīng)用于復(fù)雜樣品的分析[2]。目前，CE-MS技術(shù)已廣泛應(yīng)用于藥學(xué)[3]、蛋白質(zhì)組學(xué)[4]、多糖分析[5]、代謝組學(xué)[6]、生物標志物分析[7]、法醫(yī)學(xué)[8]、食品分析以及單細胞分析[9-10]等多個領(lǐng)域。但是，由于CE進樣量較少、分離的重現(xiàn)性不好、定量分析時線性范圍相對較窄等原因，在藥物代謝動力學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展受到限制。

在CE-MS聯(lián)用中，對于CE的限制主要是背景緩沖液(BGM)的選擇，添加劑以及表面活性劑等必須容易離子化，防止其不利于電離，且毛細管壁的涂層要足夠穩(wěn)定，避免因其脫落而污染離子源。目前，CE中的毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電動毛細管色譜(MEKC)以及毛細管電色譜(CEC)等多種分離模式都已經(jīng)實現(xiàn)與MS聯(lián)用，其中CZE因為簡單方便且不需添加劑，是目前CE-MS聯(lián)用中應(yīng)用最多的模式。在CE-MS中，背景緩沖液必須與質(zhì)譜離子化方式相匹配，大多數(shù)用的是揮發(fā)性較強的甲酸、乙酸及其銨鹽。非水毛細管電泳(NACE)因其BGM中的有機溶劑易揮發(fā)且導(dǎo)熱性好，在CE-MS中受到了科學(xué)家的青睞。CE-MS接口技術(shù)是實現(xiàn)聯(lián)用的最關(guān)鍵部分，也是多年研究的重點之一。目前，常用于CE-MS聯(lián)用的離子源主要有電噴霧電離源(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)和電感耦合等離子體(ICP)。其中，MALDI主要用于離線的CE-MS聯(lián)用，ICP主要用于金屬或含金屬元素樣品的分析，ESI是目前在線CE-MS應(yīng)用最廣泛的離子源技術(shù)，絕大多數(shù)的接口技術(shù)都是基于ESI離子化原理來設(shè)計并應(yīng)用的，這也是本文討論的重點。

CE-MS接口裝置研發(fā)是研究的熱點與重點課題之一。因為用于CE分離的管路較細，電泳中能夠產(chǎn)生的電滲流(EOF)流量較小，在與MS連接時，一方面需要保證CE出口端能夠?qū)щ?，以確保外加CE分離電場，另一方面需要產(chǎn)生穩(wěn)定的電噴霧，以實現(xiàn)質(zhì)譜的檢測。在盡量減小對CE分離效果影響的前提下，研發(fā)高效、穩(wěn)定、具有高離子化效率的電噴霧接口是科學(xué)家關(guān)注的重要研究內(nèi)容，也是限制CE-MS技術(shù)實際應(yīng)用的關(guān)鍵性問題[11]。多種形狀和材料的管路，如金屬毛細管、有機聚合物管以及削尖處理的石英毛細管等已被應(yīng)用于CE-MS接口裝置，以改善電噴霧效率。多種微流體裝置也被設(shè)計用于改善CE-MS聯(lián)用的電噴霧接口問題[12]。下面將對近5年來，CE-MS聯(lián)用裝置及其在藥物及生物樣品分析中的應(yīng)用進行綜述。

1 CE-MS聯(lián)用裝置的研究進展

自CE-MS聯(lián)用技術(shù)提出以來，對于聯(lián)用接口裝置的研究一直是倍受科學(xué)家關(guān)注的重點課題。ESI離子源的出口端噴霧液體與CE中的緩沖液可以相互匹配，接口處的電壓可以同時用于毛細管電泳的分離以及電噴霧的進行，有利于產(chǎn)生穩(wěn)定的電噴霧。由于ESI自身的優(yōu)勢以及LC-ESI-MS接口技術(shù)的成熟，使得ESI源的接口在CE-MS聯(lián)用裝置中占據(jù)了主導(dǎo)地位，這是接口技術(shù)研發(fā)的重點方向。CE-ESI-MS接口主要分為有鞘流液(sheath-flow)和無鞘流(sheathless)兩種，兩種接口各有優(yōu)勢。因為易導(dǎo)電、揮發(fā)性較強且易電離的鞘流液的加入，鞘流接口裝置產(chǎn)生的電泳及電噴霧都較穩(wěn)定，是最早實現(xiàn)商品化的接口技術(shù)；但是鞘流液的加入對樣品產(chǎn)生了稀釋作用，降低了質(zhì)譜檢測的靈敏度，且鞘流液也容易使出口端的樣品發(fā)生擴散，影響出峰的峰型及分離效率，這是目前鞘流接口存在的主要問題。無鞘流接口可分為毛細管末端直接加電壓和液接型(liquid junction)兩種。因為不會對樣品產(chǎn)生稀釋，其檢測靈敏度較高。但因為沒有鞘流液的輔助，噴霧端液體過少，容易導(dǎo)致電噴霧不穩(wěn)定，因此，無鞘流接口一般要求毛細管電泳的電滲流相對較大[13]。另外，未經(jīng)鞘流液稀釋的高濃度樣品在噴霧時也容易發(fā)生較強的離子抑制作用，影響樣品電離的效率。目前，針對無鞘流接口的研究較多，但商品化的儀器較少。

1.1鞘流接口裝置

鞘流接口裝置是通過在毛細管出口端加入液體以達到產(chǎn)生穩(wěn)定電泳及電噴霧的作用。鞘流液的引入主要有三個作用：第一，在噴霧端電極和毛細管電泳的緩沖液之間起導(dǎo)電作用，使CE中能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的電驅(qū)動；第二，可以通過調(diào)節(jié)鞘流液的組成成分對CE中的背景緩沖液進行修飾，使其更利于電噴霧及質(zhì)譜檢測；第三，補充CE中產(chǎn)生的EOF，防止因為EOF過小而造成噴霧不穩(wěn)定的情況。相對來說，鞘流接口裝置的發(fā)展較為成熟，是最早實現(xiàn)商品化的CE-MS接口裝置[14]，目前已經(jīng)有多種接口裝置被應(yīng)用于實際分析中。

最早商品化并被廣泛使用的CE-MS接口是同軸三通的鞘流接口[15]，裝置示意圖示于圖1。該接口裝置主要由一個同軸三通的金屬套管組成，最里面是分離用的毛細管，中間可以通過外接納升泵提供鞘流液，最外部通入N2氣流輔助產(chǎn)生電噴霧。在中間的金屬套管中通入電流，一方面用于電噴霧，另一方面通過鞘流液的導(dǎo)電性，連接CE管路的出口端為其提供穩(wěn)定的電回路。這種設(shè)計的優(yōu)勢在于幾乎沒有死體積，不會對CE分離產(chǎn)生不利的影響，其穩(wěn)定性相對較好。但是，此裝置在使用過程中對鞘流液的流量要求較大，一般需要達到μL/min級別，是CE分離流量的幾十倍甚至上百倍，對樣品的稀釋作用較強，會降低質(zhì)譜分析的靈敏度。另外，末端的鞘流液會導(dǎo)致樣品峰的擴散，降低CE的分離度，也會對CE的峰型產(chǎn)生不利的影響。目前，主要通過對其內(nèi)部毛細管進行削尖成錐形[16]，或者將內(nèi)部連接鞘流的金屬套管設(shè)計成錐形等方法進行改進，以提高電噴霧的穩(wěn)定性及噴霧效率[17]。為了在不影響其接口端噴霧穩(wěn)定性的前提下減小鞘流液對分離和檢測的不利影響，可采用減少鞘流液流量以及取消噴霧氣等多種方法。

圖1 同軸三通鞘流接口裝置示意圖Fig.1 Scheme of coaxial sheath-flow interface with sheath gas

圖2 二元斜面形鞘流接口裝置示意圖Fig.2 Scheme of the dual-beveled-edge CE-ESI-MS interface

通過納升噴霧的方法可以有效地減小鞘流液對樣品的稀釋效應(yīng)。在分離毛細管的末端采用鍍金處理，使毛細管末端液體接電形成穩(wěn)定的電回路。用于分離的毛細管被插入另一個內(nèi)徑較大且末端經(jīng)過打磨成錐形的石英套管中。鞘流液通過外層包裹的大孔徑毛細管引入，在末端尖端處與CE毛細管中的緩沖液混合并噴出。采用這種包裹型的鞘流接口裝置，其最終的流量大約為500 nL/min，與普通的同軸三通鞘流接口相比，其稀釋倍數(shù)降低了1倍以上[17]。此外，還采用了一種斜面接口來提高CE-MS接口處較小流量液體的噴霧穩(wěn)定性，裝置示意圖示于圖2。CE分離毛細管與用于提供鞘流液的毛細管末端都被磨成斜面型，電滲流與鞘流液在毛細管尖端處混合后，通過電噴霧離子化后進入MS分析，管路末端通過鍍金進行導(dǎo)電，以提供穩(wěn)定的電流回路用于CE。結(jié)果顯示，采用此種斜面型的接口裝置，其產(chǎn)生穩(wěn)定電噴霧的液體流量可以減小到600 nL/min，減小了鞘流液對樣品的稀釋作用[18-19]。此外，將毛細管套入不銹鋼管的內(nèi)部，利用套管與毛細管外壁之間的空隙來傳輸鞘流液的方式也被應(yīng)用于接口技術(shù)中，其可以產(chǎn)生最低流速為100 nL/min的電噴霧[20]。

圣母大學(xué)的Dovichi課題組研究了一種利用電驅(qū)動鞘流液的自動化鞘流CE-MS接口裝置[21]，該裝置將傳統(tǒng)的機械泵驅(qū)動鞘流液更換為同樣使用電泳來驅(qū)動，實現(xiàn)了鞘流液部分的自動化以及微量鞘流液的引入，裝置示意圖示于圖3。該裝置將傳統(tǒng)的外部金屬套管換成可以同樣產(chǎn)生EOF的玻璃毛細管，在外部玻璃毛細管中引入一個較低的電壓HV2，該電壓既可以作為CE分離出口端的電壓，產(chǎn)生用于分離的穩(wěn)定電流回路，又可以通過自身產(chǎn)生電滲流的方式驅(qū)動鞘流液，產(chǎn)生微量且穩(wěn)定的流體。與傳統(tǒng)的機械泵相比，電驅(qū)動的鞘流液裝置在不加入分流裝置的情況下就可以產(chǎn)生用于輔助噴霧的流量更小且穩(wěn)定的流體，加電壓的方式也更利于自動化調(diào)控和使用。目前，該裝置已經(jīng)被商品化生產(chǎn)，并逐漸應(yīng)用于藥物、蛋白質(zhì)、多肽、多糖等多類復(fù)雜生物樣品的分離與檢測中，在某些方面表現(xiàn)出比傳統(tǒng)LC-MS更加優(yōu)良的分析性能。

圖3 電驅(qū)動鞘流液型CE-MS接口裝置示意圖[21]Fig.3 Scheme of the CE-MS sheath interface with electrokinetic flow[21]

1.2無鞘流接口裝置

CE-MS在1987年被研發(fā)出來時，所使用的接口是無鞘流裝置，但因為其穩(wěn)定性和重復(fù)性較差，很快被加入鞘流液的同軸接口所取代。由于無鞘流的接口不存在對樣品的稀釋作用，檢測靈敏度相對較高，因此又逐漸被探索和研究，尤其是近些年來，無鞘流接口裝置的研發(fā)倍受關(guān)注。

CE能夠產(chǎn)生的EOF流量較小，在不加鞘流液的情況下，存在的最主要挑戰(zhàn)是在出口端如何加上電壓使其形成穩(wěn)定的電流回路進行電泳分離并提供噴霧電壓。在此前提下，要盡可能的使其對CE分離效率以及電噴霧的穩(wěn)定性產(chǎn)生較小的影響，并且接口裝置要易于制備，耐用性好。最早使用的加電壓方式是在毛細管的末端直接插入尺寸較細的金屬電極[22]，或者在毛細管末端通過機械或者侵蝕的方法制造一個小孔，插入金屬電極，用于接入電壓[23]，示于圖4a。這種方法的問題在于插入的金屬電極會對流路產(chǎn)生阻礙，容易形成渦旋或產(chǎn)生氣泡，影響CE分離的效率和穩(wěn)定性。還有一種最常見的毛細管出口端加電壓的方式是在其末端鍍上一層導(dǎo)電的涂層，包括多種金屬涂層，如金[24]、銀[25]、銅[26]、鎳，以及非金屬導(dǎo)電涂層，如石墨等，導(dǎo)電涂層被涂覆在管壁的末端用于導(dǎo)電連接[27-28]，示于圖4b。但這種涂層涂覆方法存在的最大問題是操作較為復(fù)雜且穩(wěn)定性較差，多次重復(fù)使用后涂層容易脫落，導(dǎo)致分離與電噴霧的不穩(wěn)定，因此這種方法很少被商品化生產(chǎn)和使用。

圖4 多種無鞘流接口裝置原理示意圖Fig.4 Scheme of several sheathless CE-MS interfaces

另外一種方式是將毛細管分成兩段[29]，中間管路裸露部分的液體可以通過外部包裹的電極加上電壓形成回路，示于圖4c，但這種方法存在的主要問題是在分成兩段的過程中，形成孔的大小難以保證，導(dǎo)致其重復(fù)性差，操作較為困難。為了解決這一問題，氫氟酸腐蝕的方法被用于形成末端多孔的毛細管柱，在多孔的末端管路外部加一個具有緩沖液薄層的金屬套管，可以成功地實現(xiàn)電壓的加入，示于圖4d[30]。雖然這種方式解決了電壓加入的問題，但是氫氟酸的腐蝕會導(dǎo)致毛細管非常脆弱，容易損壞，不利于商品化的生產(chǎn)和使用。通過將毛細管分離和電噴霧電離分開成兩部分，在斷開的部分加入金屬導(dǎo)電套管，也可以解決末端加電的問題，示于圖4e[31]。這種兩段式連接方式同樣可以通過將第二段毛細管換成金屬管路，直接在金屬管路外部加入電壓，示于圖4f[32]。但是這些裝置需要特別注意兩段毛細管必須對齊才能保證穩(wěn)定的流路，且存在一定的死體積，容易影響分離和噴霧的效果。

圖5 外部包裹的多孔無鞘流CE-MS接口裝置示意圖[33] Fig.5 Scheme of the CE-MS interface with a large inner diameter separation capillary and a small porous emitter[33]

因為較脆、易損壞，末端腐蝕后形成多孔毛細管用于導(dǎo)電的方法沒有被廣泛應(yīng)用。將腐蝕的一小段易損壞的毛細管與前面用于分離的毛細管分開，再用金屬套管包裹住接口部分，可以有效地解決這一問題[33]，示于圖5。這種接口裝置由三部分組成，最內(nèi)層是一個經(jīng)過腐蝕處理后的多孔毛細管，其內(nèi)徑20 μm，外徑90 μm，在管子的外部套上一個用于分離的大孔徑毛細管，外徑360 μm，內(nèi)徑100 μm，在起到CE分離作用的同時，可對內(nèi)部較脆弱的多孔毛細管起到保護作用。在這兩根毛細管的外部再加上一根金屬套管，用于為內(nèi)部液體導(dǎo)電，形成穩(wěn)定的電流回路。金屬套管內(nèi)部的導(dǎo)電液體可以通過多孔毛細管接上電壓用于電泳分離和電噴霧。該裝置表現(xiàn)出良好的分離效果和穩(wěn)定性，因為沒有鞘流液的存在，使其檢測的靈敏度得到了明顯提升，因為用于分離的毛細管內(nèi)徑較大，其分離的柱容量也相對較大。目前，這種接口裝置已經(jīng)被商品化銷售和使用，在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中有著良好的應(yīng)用前景。

陳子林等[34]研制了一種液接型無鞘流電噴霧裝置，示于圖6。該方法利用一段可以導(dǎo)電的全氟磺酸(Nifion)管將CE分離毛細管和MS電噴霧毛細管連接，在全氟磺酸管的外部加入一小段用于裝載緩沖鹽的聚氯乙烯管。聚氯乙烯管緩沖液中外加的電壓HV2不僅可以用于質(zhì)譜電噴霧，還可以有效地解決分離毛細管出口端接電的問題。作者同時研制了一種Lupamin高分子聚合物涂覆的毛細管電色譜柱，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于氨基酸和多肽樣品的CE-MS分析[35]。

圖6 液接型無鞘流CE-MS接口裝置示意圖[34] Fig.6 Scheme of the sheathless CE-MS interface by liquid junction method

2 CE-MS應(yīng)用研究進展

CE-MS聯(lián)用技術(shù)具有分離效率高、分析速度快、高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點，不僅可以應(yīng)用于一些復(fù)雜樣品的分離和檢測，還可以提供分子質(zhì)量信息用于解析結(jié)構(gòu)特征，因此，在復(fù)雜生物樣品分析中具有獨特的優(yōu)勢。下面將對CE-MS技術(shù)在藥物、蛋白質(zhì)、多肽分析中的應(yīng)用進展進行概述。

2.1藥物分析

CE-MS作為一種微量、高靈敏度分離與檢測技術(shù)，在藥物結(jié)構(gòu)、組分、純度分析中發(fā)揮著重要的作用。例如，CE-MS在中藥有效成分的結(jié)構(gòu)鑒定及含量分析，單克隆抗體藥物的分析[36]，生物藥物在體內(nèi)的N端糖基化修飾的分析[37]，蛋白質(zhì)藥物的生物相似性分析等[38]領(lǐng)域均有報道。

注：BC為補骨脂甲素；IBC為補骨脂乙素圖7 采用CE-MS分析補骨脂甲素和補骨脂乙素[39]Fig.7 Analysis of bavachin and isobavachalcone by CE-MS[39]

采用同軸三通的CE-MS接口裝置，本課題組成功地將CE-MS用于補骨脂中有效成分的含量測定[39]。補骨脂是一種具有抗炎、抗氧化等多種功效的傳統(tǒng)中藥材，對于其有效成分的分離和檢測具有重要的意義。補骨脂甲素和補骨脂乙素是補骨脂中兩種重要的有效成分，互為同分異構(gòu)體。由于其分子質(zhì)量相同，較難分離，所以在質(zhì)譜檢測中將其分離后再進行檢測具有重要的意義。采用醋酸銨作為流動相，通過優(yōu)化緩沖液的pH值、濃度、鞘流液種類等條件，成功地實現(xiàn)了這對同分異構(gòu)體的分離，結(jié)果示于圖7。采用質(zhì)譜檢測器，其最低檢測限達到了60 μg/L，遠低于紫外檢測器，可以實現(xiàn)對中藥補骨脂提取物中這兩種成分的直接分離和檢測。采用CE-MS分離模式，已成功地實現(xiàn)了長春花等中藥中有效成分的分離和含量檢測[40]。

非水毛細管電泳是毛細管電泳(NACE)的一種模式，與普通的水相毛細管電泳相比，其具有不同的分離選擇性及分離機理，特別適用于水相溶解度差或穩(wěn)定性差的藥物分析。本課題組將非水毛細管電泳通過同軸三通的接口與離子阱質(zhì)譜相連，成功實現(xiàn)了對傳統(tǒng)中藥材防己科植物中的漢防己甲素、漢防己乙素和及育哼賓3種有效成分的分析[41]。以1號峰對應(yīng)的小檗堿為內(nèi)標物，NACE-MS對3種有效成分以及內(nèi)標小檗堿分離效果良好，結(jié)果示于圖8a和8b。由于MS檢測的靈敏度相對較高，利用該方法還實現(xiàn)了對中藥防己和蝙蝠葛提取物中3種成分含量的直接測定，結(jié)果示于圖8c和8d。結(jié)果表明，NACE與質(zhì)譜聯(lián)用在中藥活性組分分析中具有很好的應(yīng)用前景。

此外，采用質(zhì)譜法不僅可以實現(xiàn)對中藥中有效成分的高效分離和測定，還可以實現(xiàn)對其分子結(jié)構(gòu)裂解情況的解析。本課題組利用離子阱質(zhì)譜可以進行多級質(zhì)譜分析的特點，探索了漢防己乙素在多級質(zhì)譜條件下主要碎片峰的分子質(zhì)量信息，進行了分子結(jié)構(gòu)裂解情況的分析，結(jié)果示于圖9。

本課題組還實現(xiàn)了對石蒜、苦參等傳統(tǒng)中藥材中主要生物堿成分含量的測定，并通過離子阱質(zhì)譜提供的分子裂解信息，對其多級質(zhì)譜裂解規(guī)律進行解析[42-43]。

此外，多種不同接口裝置也被應(yīng)用于實際藥物分析中。Haselberg等[44]報道了無鞘流CE-ESI裝置在糖蛋白類藥物分析中的應(yīng)用，在檢測人類干擾素-β重組子中，至少有18種多糖類組分被檢測和鑒定，包括多種脫酰胺基、琥伯酰亞胺衍生化和氧化產(chǎn)物。在對人類紅細胞生成素的重組子檢測中，可以實現(xiàn)60 min內(nèi)檢測并鑒定74種多糖類組分和250多種氧化和乙?；耐之悩?gòu)體，其含量范圍在0.35～950 nmol/L之間。這些檢測方法和數(shù)據(jù)對生物藥品的生產(chǎn)和生物相似物的鑒定起著重要作用。CE-MS也是一種獨特的在線酶活性鑒定以及酶抑制劑篩選手段，如將該方法應(yīng)用于腫瘤入侵和轉(zhuǎn)移相關(guān)的金屬蛋白酶-9的酶活性測定以及抑制劑篩選中[45]。Marakova等[46]利用無鞘流的CE-ESI-MS/MS裝置與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用，同時鑒定和定量了多種協(xié)同作用藥物和生物基質(zhì)。Harrison[47]建立了一種用于運動員興奮劑檢測的CE-MS技術(shù)，因為CE具有快速和高通量的特點，這種檢測方法在運動員興奮劑檢測中具有潛在的優(yōu)勢。

注：a.總離子流色譜圖；b.提取離子色譜圖；c.中藥防己中成分含量的測定；d.中藥蝙蝠葛中成分含量的測定1.小檗堿；2. 漢防己乙素；3. 漢防己甲素；4. 育哼賓圖8 采用非水CE-MS分析防己科植物中3種有效成分[41]Fig.8 Analysis of active alkaloids in menispermaceae family by NACE-MS

圖9 正離子模式下，漢防己乙素的分子裂解分析[41]Fig.9 Fragmentation pathways of main fragment ions for tetrandrine in positive ion mode

2.2氨基酸、多肽及蛋白質(zhì)的分析

氨基酸和多肽樣品是CE-MS研究中相對較多的分析對象，在生物分析領(lǐng)域具有一定的實用價值。Lupamin是一種帶有大量氨基的高分子聚合物，本課題組通過將Lupamin涂覆在毛細管柱中，在酸性條件下實現(xiàn)了對多種氨基酸和多肽樣品的分離。并利用圖6中搭建的液接型無鞘流電噴霧接口，實現(xiàn)對樣品的MS檢測，其結(jié)果示于圖10。通過在毛細管內(nèi)表面引入帶正電的固定相，可以防止在酸性條件下帶正電的氨基酸和多肽樣品在毛細管內(nèi)表面的靜電吸附，另外，無鞘流的電噴霧接口也可以防止鞘流液帶來的稀釋作用，提高了檢測的靈敏度。

近年來，CE-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用也是研究的熱點領(lǐng)域，用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析的新裝置和新方法不斷被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。目前，在蛋白質(zhì)分析中應(yīng)用較為廣泛的有電驅(qū)動鞘流液接口和金屬套管包裹的腐蝕多孔無鞘流接口裝置。

Docvichi課題組利用研發(fā)的電驅(qū)動鞘流液電噴霧接口技術(shù)將CE與多種MS連接，如三重四極桿、軌道離子阱等，由于該接口技術(shù)既可以產(chǎn)生穩(wěn)定的EOF和電噴霧，又可以減少鞘流液對樣品的稀釋作用，實現(xiàn)了對多種蛋白質(zhì)的微量分析，證明了這種裝置在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用優(yōu)勢與價值[48-49]。將CE與軌道離子阱質(zhì)譜(CE-Orbitrap MS)相連用于胰蛋白酶消化后的牛血清蛋白勻漿分析時，其最低檢測限達到0.3 nmol/L[50]。利用該裝置與三重四極桿質(zhì)譜相連，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)對阿片類神經(jīng)遞質(zhì)亮氨酸腦啡肽進行定量檢測，其檢測限達到60 pmol/L，靈敏度相當(dāng)于nanoLC/MS的10～20倍，比LC-MS/MS的檢測靈敏度提高的倍數(shù)更高[51]。通過在CE-MS分析前加入一段C18固相微萃取柱進行富集處理，在大腸桿菌的胰蛋白酶細胞裂解液中鑒定出了4 902種多肽和871種蛋白質(zhì)，該結(jié)果也是目前CE-MS鑒定出的最大的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)[52]。目前，該接口裝置已經(jīng)成功地被商品化生產(chǎn)，將在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)揮更大的作用。

圖10 幾種氨基酸和多肽樣品的CE-MS色譜圖[34]Fig.10 Chromatogram of amino acids and peptides by CE-MS

金屬套管包裹的腐蝕多孔無鞘流接口裝置在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用也較為廣泛，通過該接口裝置實現(xiàn)了大量天然蛋白質(zhì)分子的分離和檢測，包括多種高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)非共價復(fù)合物。實驗證明，在4～900 nL/min流量范圍內(nèi)，該接口裝置都可以產(chǎn)生穩(wěn)定的電噴霧，特別是在較低流量時，該接口裝置因為離子抑制作用的減少而體現(xiàn)出更高的靈敏度。該裝置能夠檢測螃蟹中分子質(zhì)量在445 ku～1.34 mu之間血藍蛋白的含量，而普通的含鞘流液的接口裝置卻無法檢測[53]。這一結(jié)果進一步驗證了無鞘流的CE-MS接口裝置在小流量分析、大分子分析和提高靈敏度方面的優(yōu)勢。

CE-MS方法也同樣被應(yīng)用于在線酶反應(yīng)與檢測中。將一個固定化的酶微反應(yīng)器加入CE-MS裝置中，可以實現(xiàn)酶的在線反應(yīng)與分離檢測。蛋白質(zhì)的磷酸化在細胞分裂、分化、轉(zhuǎn)移和信號通路中都發(fā)揮著重要作用，對其含量的測定也是研究的重點。Mou等[54-55]通過這種方法將堿性磷酸酶固定在一個CE-MS微反應(yīng)器上，用于蛋白質(zhì)和多肽樣品中磷酸化酶的化學(xué)計量學(xué)測定。該裝置的原理示于圖11，它包括一個二維的分離過程。首先，因為帶電荷量和分子大小的差異，磷酸化和未磷酸化的多肽在第一段分離毛細管中分離，先后到達含有固定了堿性磷酸酶的微反應(yīng)器中，磷酸化的多肽會在酶的作用下發(fā)生去磷酸化作用，而本身沒有磷酸化的蛋白質(zhì)和多肽不會發(fā)生改變。通過第二段分離毛細管，未磷酸化的蛋白質(zhì)或多肽和去磷酸化的蛋白質(zhì)或多肽分別到達質(zhì)譜檢測端，測出其含量，并可以算出磷酸化蛋白質(zhì)或多肽的含量及其所占的比例。該方法通過加入一個微反應(yīng)器，成功地實現(xiàn)了磷酸化蛋白質(zhì)去磷酸化后的在線含量測定，防止因為離子化效率的差異造成檢測結(jié)果不準確。因此，該方法實現(xiàn)了一種對磷酸化蛋白質(zhì)和多肽的“非差異性”在線快速檢測。

圖11 CE-MS在線磷酸化酶反應(yīng)器原理示意圖[54] Fig.11 Determination of peptide phosphorylation stoichiometry via automatic CE-MS system[54]

3 總結(jié)與展望

經(jīng)過20多年的發(fā)展，CE-MS聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)成為一種重要的分析手段，特別是在生物體系中微量成分的分離、定性和定量檢測中體現(xiàn)了獨特的優(yōu)勢。結(jié)合CE分析速度快、分離效率高和易于實現(xiàn)微型化的特點與質(zhì)譜分析的靈敏度高、選擇性好以及可以提供物質(zhì)的分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)勢，CE-MS在藥物、蛋白質(zhì)組學(xué)、多糖組學(xué)中已實現(xiàn)高通量和高靈敏度的分析。

今后，CE-MS聯(lián)用技術(shù)在以下幾個方面將具有良好的發(fā)展前景：1) 新型毛細管電色譜柱在CEC-MS聯(lián)用技術(shù)中的應(yīng)用。目前，CE-MS使用的大多數(shù)是空的毛細管柱或通過簡單的涂覆改變毛細管壁的帶電情況，從而改善分離效果，與MS匹配的新型毛細管電色譜柱相對較少。隨著CE-MS技術(shù)逐漸從裝置的研發(fā)向應(yīng)用實際復(fù)雜樣品分析方向的發(fā)展，開發(fā)分離選擇性好、分離效率高且適合質(zhì)譜聯(lián)用的毛細管電色譜柱具有重要意義；2) 在線酶反應(yīng)、在線固相微萃取等技術(shù)與CE-MS聯(lián)用的結(jié)合。實現(xiàn)樣品的高效、快速和自動化分析一直是分析領(lǐng)域的熱點，而在線酶反應(yīng)或富集技術(shù)與CE-MS的結(jié)合是實現(xiàn)復(fù)雜樣品快速高靈敏度分析的重要手段；3) CE-MS技術(shù)在復(fù)雜樣品分析中的應(yīng)用。CE-MS聯(lián)用技術(shù)在微量復(fù)雜樣品分析中具有獨特的優(yōu)勢，目前在實際樣品中的應(yīng)用相對較少，CE-MS聯(lián)用技術(shù)在藥物、蛋白質(zhì)組學(xué)、多糖組學(xué)、食品分析和單細胞分析等領(lǐng)域都具有良好的應(yīng)用前景。

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RecentAdvancesinCapillaryElectrophoresis-MassSpectrometryandItsApplicationinPharmaceuticalandBiologicalAnalysis

ZHOU Wei, LIU Yi-kun, CHEN Zi-lin

(SchoolofPharmaceuticalSciences,WuhanUniversity,Wuhan430071,China)

Capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), developed on the basis of liquid chromatography-mass spectrometry, is a new hyphenated technique that combines the advantages like high separation efficiency, short analytical time, low sample consumption in CE and the high sensitivity, powerful molecular structure elucidation in MS. It has been paid great attention by analytical scientists and become a powerful tool for analysis of active components in Chinese medicine, in vivo drugs and bio-samples like amino acids, peptides, proteins and polysaccharides. In this paper, a brief review was given on recent advance in CE-MS and its applications, including advance in sheath-flow and sheathless nano-spray interfaces and applications in analysis of pharmaceutical and biological samples. The first part of this review summarizes the development of stable and efficient interfaces to improve the feasibility of CE-MS technique. Several interfaces like coaxial sheath-flow, electrokinetic sheath-flow, liquid injection and sheathless interface with etching emitter have been reviewed. The second part introduces the application of CE-MS in the past few years. The applications are categorized according to the types of analytes, including the analysis for active components in Chinese medicines, in vivo drugs, amino acids, peptides, proteins and carbohydrates. Coatings for capillary inner wall, online processing strategies, sample preparation methods and other experiment methods have been discussed in each category. In the last part of this review, a perspective of this technique has been discussed.

capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS); electrospray ionization interface; pharmaceutical analysis; bioanalysis; review

2016-12-26;

2017-02-28

國家自然科學(xué)基金(81573384，21375101)資助

周 韋(1994—)，男(漢族)，安徽合肥人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: zhouwei1994@whu.edu.cn

陳子林(1963—)，男(漢族)，江西樂平人，教授，從事藥物分析與篩選研究。E-mail: chenzl@whu.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0362-13

10.7538/zpxb.2016.0210