張 丹，王彩虹，金 瀅，王 喆，張金蘭

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法研究藥物代謝產(chǎn)物的數(shù)據(jù)處理策略

張 丹，王彩虹，金 瀅，王 喆，張金蘭

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)聯(lián)用技術(shù)具有高靈敏度、快速和高質(zhì)量準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，是藥物代謝產(chǎn)物分析的有力手段。通過(guò)使用HPLC-HRMS產(chǎn)生高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)(高分辨質(zhì)量數(shù)、多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)、同位素分布)，結(jié)合多重采集后數(shù)據(jù)處理技術(shù)，可用于藥物代謝產(chǎn)物的快速發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定。本工作綜述了近年來(lái)基于HPLC-HRMS技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的幾種數(shù)據(jù)挖掘策略及應(yīng)用，如，提取離子色譜、質(zhì)量虧損過(guò)濾、同位素過(guò)濾、本底扣除、產(chǎn)物離子過(guò)濾、質(zhì)譜樹狀圖過(guò)濾、SWATH和MSE以及這些技術(shù)的聯(lián)用等。通過(guò)合理地使用其中一種或幾種策略對(duì)HPLC-HRMS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，可以有效地進(jìn)行藥物代謝產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和鑒定。

高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜(HPLC-HRMS)；代謝產(chǎn)物；數(shù)據(jù)處理策略；綜述

高效液相色譜(HPLC)和超高效液相色譜(UPLC)因其載樣量大、適用性好、分離度高等優(yōu)點(diǎn)，已成為分析藥物代謝產(chǎn)物的有效手段[1-3]，它們一般采用質(zhì)譜作為檢測(cè)器[1,4]。與其它檢測(cè)技術(shù)相比，質(zhì)譜能夠提供更高的選擇性、靈敏度以及更豐富的結(jié)構(gòu)信息[5]。特別是與高分辨質(zhì)譜(HRMS)雜化的多功能質(zhì)譜儀[6]，通過(guò)高分辨質(zhì)譜獲得的準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)，結(jié)合雜化的多功能質(zhì)譜獲得的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可高靈敏度、高選擇性地對(duì)體內(nèi)復(fù)雜基質(zhì)中代謝產(chǎn)物進(jìn)行快速檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定[2,7]，如飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF MS)、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(FTICR MS)和靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(Orbitrap MS)等。本工作將重點(diǎn)介紹基于高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-HRMS)的代謝產(chǎn)物檢測(cè)和鑒定的策略及應(yīng)用。

1 代謝物檢測(cè)和鑒定策略

1.1提取離子色譜

提取離子色譜(extracted-ion chromatography, EIC)是對(duì)預(yù)期代謝產(chǎn)物高分辨的m/z值進(jìn)行提取處理，能夠簡(jiǎn)單高效地檢測(cè)代謝產(chǎn)物，借助數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能存在的代謝產(chǎn)物，建立預(yù)期代謝產(chǎn)物高分辨m/z值目錄，以大大提高EIC的處理效率。然而，由于此類數(shù)據(jù)庫(kù)是基于每個(gè)檢測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)獨(dú)特性，需要集成軟件以滿足高通量分析[8]。因此，EIC技術(shù)的最大限制是對(duì)非常規(guī)或由多重代謝轉(zhuǎn)化反應(yīng)形成的代謝產(chǎn)物的檢測(cè)不全面。

Ruan等[8]采用全掃描MS數(shù)據(jù)集的高分辨EIC分析，在大鼠肝S9孵育液中檢測(cè)到11個(gè)茚地那韋代謝產(chǎn)物，高分辨質(zhì)譜的高質(zhì)量準(zhǔn)確度極大地提高了EIC處理的選擇性。

Falck等[9]利用LC-HRMS/MSn結(jié)合EIC技術(shù)從大鼠的尿液中共檢測(cè)到7種艾芬地爾及其代謝物，其中包含2種Ⅰ相代謝物，5種Ⅱ相代謝物，并發(fā)現(xiàn)主要的體內(nèi)代謝物為葡萄糖醛酸結(jié)合物。Poschner等[10]運(yùn)用LC-HRMS結(jié)合EIC技術(shù)從人的乳腺癌細(xì)胞中同時(shí)定量檢測(cè)了10種非共軛激素前體、雄激素、雌激素及其各自的綴合代謝物。

1.2質(zhì)量虧損過(guò)濾技術(shù)

以母體藥物和核心亞結(jié)構(gòu)作為過(guò)濾模板的質(zhì)量虧損過(guò)濾(mass defect filter, MDF)技術(shù)[8]是快速檢測(cè)復(fù)雜生物基質(zhì)中藥物代謝產(chǎn)物的方法[11]。

“質(zhì)量虧損”指一個(gè)元素(或者化合物)的精確質(zhì)量數(shù)和它最接近的整數(shù)值之間的差異。由于代謝產(chǎn)物的質(zhì)量虧損通常位于較窄的范圍內(nèi)，根據(jù)母體藥物和被選擇的核心亞結(jié)構(gòu)的質(zhì)量虧損，可以估算這些代謝產(chǎn)物的質(zhì)量虧損所處的區(qū)間。預(yù)先設(shè)定過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，采用質(zhì)量虧損過(guò)濾，從干擾離子中過(guò)濾出代謝產(chǎn)物離子，將所有處于期望范圍之外的離子排除，從而挖掘出可能的代謝產(chǎn)物[8,12]。因此，運(yùn)用MDF方法檢測(cè)代謝產(chǎn)物，依賴代謝產(chǎn)物與過(guò)濾模板間的質(zhì)量虧損相似性，不需要考慮不同代謝產(chǎn)物的裂解類型[13]。MDF技術(shù)可有效地去除所有的干擾離子，得到“干凈”的色譜圖，簡(jiǎn)化質(zhì)譜解析，已廣泛用于檢測(cè)常規(guī)和非常規(guī)代謝產(chǎn)物，包括分子質(zhì)量比母體藥物小很多的代謝產(chǎn)物[11,13]。近年來(lái)，由于MDF技術(shù)在代謝產(chǎn)物分析中的優(yōu)勢(shì)，其發(fā)展愈發(fā)迅猛，越來(lái)越多地應(yīng)用于藥物代謝分析研究中[14-17]。

Ruan等[8]采用MDF技術(shù)使用藥物過(guò)濾模板的方法檢測(cè)到茚地那韋在鼠肝S9孵育液中的9種常規(guī)代謝產(chǎn)物(M5～M13)，此外，還檢測(cè)到1個(gè)未被報(bào)道過(guò)的代謝產(chǎn)物M14，M14的全掃描MS譜在m/z521.313 4處顯示含有1個(gè)質(zhì)子化分子，比M2少2個(gè)質(zhì)子。根據(jù)二者的MS/MS譜可知，M14的碎片離子與M2相似，說(shuō)明這兩個(gè)代謝產(chǎn)物具有相同的骨架結(jié)構(gòu)，M14缺少的2個(gè)質(zhì)子發(fā)生在氨基吲哚部分。基于以上結(jié)果，提出M14的形成是經(jīng)歷了3-甲基吡啶基團(tuán)丟失和氨基吲哚被氧化成氨基茚酮2個(gè)代謝轉(zhuǎn)化反應(yīng)。除常規(guī)代謝產(chǎn)物外，利用母體藥物和核心結(jié)構(gòu)過(guò)濾模板的方法還發(fā)現(xiàn)了非常規(guī)代謝物，檢測(cè)到了分別經(jīng)N-脫烷基和單羥基化反應(yīng)得到的M3和M4。

Zhu等[13]采用色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)結(jié)合MDF方法篩選和鑒定活性代謝產(chǎn)物。通過(guò)采用HPLC聯(lián)合Orbitrap或FTICR質(zhì)譜技術(shù)分析人肝微粒體(HLM)中的撲熱息痛、雙氯芬酸、卡馬西平、氯氮平、p-甲酚、4-乙苯酚和3-甲基吲哚的GSH-軛和的活性代謝產(chǎn)物。

Wang等[18]采用UPLC-MS/MS結(jié)合MDF技術(shù)從大鼠血漿、尿液等體液和排泄物中共發(fā)現(xiàn)了97種小檗堿代謝物。

1.3同位素過(guò)濾技術(shù)

同位素過(guò)濾(isotope pattern filter, IPF)技術(shù)用于篩查具有不同的同位素模型的代謝產(chǎn)物，包括天然同位素和放射標(biāo)記同位素，其主要用于研究含Cl-和Br-的化合物。

Zhu等[19]建立了一種基于精確質(zhì)量數(shù)的平均同位素過(guò)濾(AMSA-IPF)技術(shù)，該技術(shù)相比于傳統(tǒng)的IPF改進(jìn)了3個(gè)功能：1) 在IPF之前進(jìn)行譜圖平均，以減小離子強(qiáng)度的變異；2) IPF過(guò)程嚴(yán)格基于精確質(zhì)量數(shù)；3) 過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)中包含(M+2∶M)和(M+1∶M)同位素豐度比，提高了該方法的特異性。作者利用AMSA-IPF方法有效地鑒定了大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便樣品中的氯雷他定及其39種代謝物，比EIC技術(shù)多檢測(cè)到16種代謝物，說(shuō)明該方法能夠發(fā)現(xiàn)低強(qiáng)度的代謝物。

1.4本底扣除技術(shù)

本底扣除(background subtraction, BS)技術(shù)是根據(jù)新的算法，從給藥后生物樣本的高分辨數(shù)據(jù)中扣除空白樣本內(nèi)源性本底干擾信號(hào)，選擇性地檢測(cè)代謝產(chǎn)物。此方法需要很好地從藥物相關(guān)離子中區(qū)分背景和基質(zhì)相關(guān)離子，根據(jù)它們的準(zhǔn)確質(zhì)量，從分析物樣本中完全扣除所有干擾離子。該方法能夠快速地檢測(cè)體內(nèi)外代謝產(chǎn)物，不需要假設(shè)它們的分子質(zhì)量、裂解類型和質(zhì)量虧損。

Ma等[11]將BS方法成功地應(yīng)用于HLM孵育中的4個(gè)測(cè)試藥物(氯氮平，雙氯芬酸，丙米嗪和他克林)與谷胱甘肽結(jié)合物的快速檢測(cè)，結(jié)果示于圖1。圖1a顯示了6個(gè)不同的GSH綴合物色譜峰(IM1～I(xiàn)M6)，但在未處理的原始色譜圖中，難以發(fā)現(xiàn)這些代謝物。背景扣除后的譜圖相對(duì)簡(jiǎn)單，能夠較容易地發(fā)現(xiàn)GSH加合物的分子離子。扣除背景后，IM1的雙電荷準(zhǔn)分子離子m/z310.641 0非常清晰，幾乎沒(méi)有干擾離子，而在未經(jīng)處理的質(zhì)譜圖中，該離子受到許多內(nèi)源性物質(zhì)離子的干擾。這說(shuō)明該方法適合檢測(cè)在電噴霧離子化中形成雙電荷離子的GSH結(jié)合物。

注：a.經(jīng)徹底背景扣除后，丙咪嗪與HLM和GSH孵育的色譜圖；b.丙咪嗪與HLM和GSH孵育的原始色譜圖；c.扣除背景后，IM1的雙電荷準(zhǔn)分子離子質(zhì)譜圖；d.未處理的IM1的雙電荷準(zhǔn)分子離子質(zhì)譜圖圖1 丙米嗪谷胱甘肽結(jié)合物的色譜及質(zhì)譜圖[11]Fig.1 Chromatogram and mass spectra of imipramine-GSH

1.5產(chǎn)物離子過(guò)濾和中性丟失過(guò)濾技術(shù)

產(chǎn)物離子過(guò)濾(product ion filter, PIF)和中性丟失過(guò)濾(neutral loss filter, NLF)是依賴代謝產(chǎn)物MS/MS譜的有效性，以及代謝產(chǎn)物與母體藥物或已知代謝產(chǎn)物裂解規(guī)律相似性的技術(shù)。根據(jù)預(yù)期的代謝產(chǎn)物碎片離子或裂解規(guī)律，從復(fù)雜樣本中檢測(cè)代謝產(chǎn)物，使用多個(gè)產(chǎn)物離子或者中性丟失進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，能夠檢測(cè)某些EIC或MDF無(wú)法檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物[8]。PIF和NLF技術(shù)可用于同時(shí)搜索已預(yù)測(cè)和未預(yù)測(cè)的代謝物，無(wú)需額外的樣品注射，特別適用于綴合的代謝物篩選[20]。

Zhou等[20]利用NLF和PIF技術(shù)成功地鑒定了人尿液中三環(huán)抗抑郁藥阿米替林的28種代謝物。

1.6質(zhì)譜樹狀圖過(guò)濾技術(shù)

本課題組運(yùn)用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜/多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)(HPLC-HRMS/MSn)和質(zhì)譜樹狀圖相似度過(guò)濾(MTSF)技術(shù)[21]，建立了一種藥物體內(nèi)成分及其代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和鑒定的新方法。通過(guò)全掃描模式獲得化合物的一級(jí)高分辨質(zhì)譜圖作為質(zhì)譜樹狀圖的樹干，數(shù)據(jù)依賴掃描模式獲得化合物的多級(jí)質(zhì)譜圖作為樹枝，構(gòu)建被檢測(cè)化合物的質(zhì)譜樹狀圖，并將已知結(jié)構(gòu)的化合物質(zhì)譜樹狀圖作為模板導(dǎo)入自建的質(zhì)譜樹狀圖數(shù)據(jù)庫(kù)。將被檢測(cè)樣品的質(zhì)譜樹狀圖與自建的質(zhì)譜樹狀圖庫(kù)進(jìn)行相似度比較，根據(jù)相似度結(jié)果發(fā)現(xiàn)潛在代謝產(chǎn)物。相似度匹配得分的閾值高于200時(shí)，可以過(guò)濾掉約80%的干擾，獲得一定可信度的體內(nèi)成分和代謝產(chǎn)物信息。將該方法運(yùn)用在淫羊藿藥材提取物給藥后的大鼠生物樣品中，共發(fā)現(xiàn)和鑒定了115個(gè)代謝產(chǎn)物，并推測(cè)了淫羊藿黃酮的代謝途徑。與廣泛使用的NLF、PIF和MDF技術(shù)相比，MTSF技術(shù)在發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物方面優(yōu)于NLF和PIF技術(shù)，與MDF技術(shù)互補(bǔ)。MTSF技術(shù)還可用于代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定，特別適用于結(jié)構(gòu)多樣、代謝廣泛的中藥體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究[22]。

1.7SWATH和MSE技術(shù)

每個(gè)窗口所有碎片離子的順序采集(Sequential Windowed Acquisition of all Theoretical fragment ions, SWATH)和MSE是新型的多級(jí)質(zhì)譜掃描技術(shù)，將掃描范圍分為幾十個(gè)Da為間隔的一系列區(qū)間，通過(guò)高速掃描可以獲得掃描范圍內(nèi)所有分子離子的全部碎片信息和結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于代謝物的發(fā)現(xiàn)和鑒定具有高分辨、高掃描速率和高靈敏度的特點(diǎn)，適用于結(jié)構(gòu)多樣、含量較少的代謝物的定性與定量研究。Sun等[23]利用MSE結(jié)合UPLC-Q-TOF MS技術(shù)從中藥復(fù)方開心散中快速鑒定了107種化合物。

Scheidweiler等[24]采用LC/MS結(jié)合SWATH技術(shù)成功地鑒定了人的尿液中47種合成大麻素代謝物。

2 不同技術(shù)的聯(lián)用

對(duì)使用HPLC-HRMS技術(shù)獲得的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，采用EIC、MDF、PIF、NLF和MTSF等數(shù)據(jù)處理技術(shù)，可用于復(fù)雜基質(zhì)中代謝產(chǎn)物的快速發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)鑒定[25-28]，這些技術(shù)的特點(diǎn)示于圖2。不同技術(shù)之間具有互補(bǔ)性，可以全面地發(fā)現(xiàn)常規(guī)和非常規(guī)的代謝產(chǎn)物，并進(jìn)行高效地結(jié)構(gòu)鑒定。

Xing等[16]利用HRMS結(jié)合MDF和BS兩種數(shù)據(jù)處理技術(shù)，從人的血漿及尿液中篩選和鑒定了甲硝唑、泮托拉唑和克拉霉素藥物結(jié)合物的相關(guān)代謝產(chǎn)物。首先利用非靶向BS進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，再利用靶向改進(jìn)的MDF對(duì)甲硝唑、泮托拉唑和克拉霉素的代謝物進(jìn)行了更有效地鑒別，最后根據(jù)全掃描MS譜對(duì)MDF處理色譜圖中存在的單個(gè)峰進(jìn)行快速確認(rèn)，共發(fā)現(xiàn)44種藥物相關(guān)代謝物。BS可濾掉大多數(shù)背景信號(hào)，根據(jù)處理結(jié)果獲得適當(dāng)?shù)拇x物MDF模板，將其與已有的MDF模板同時(shí)應(yīng)用于代謝物的鑒別。

Liu等[29]開發(fā)了多重質(zhì)量虧損過(guò)濾器(MMDF)與依賴于動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)的在線數(shù)據(jù)采集技術(shù)相結(jié)合的方法，以追蹤五味子甲素的所有可能代謝物，共發(fā)現(xiàn)了51種五味子甲素的代謝物，包括49種Ⅰ相代謝物和2種Ⅱ相代謝物。MMDF和DBS方法可以觸發(fā)由背景噪聲和內(nèi)源性成分掩蓋的低水平代謝物的信息依賴型數(shù)據(jù)獲取(information dependent acquisition, IDA)。采用MDF、PIF和NLF等數(shù)據(jù)處理方法的聯(lián)合應(yīng)用來(lái)鑒定五味子甲素的代謝物，根據(jù)準(zhǔn)確分子質(zhì)量、母體藥物的質(zhì)譜碎裂規(guī)律和藥物代謝轉(zhuǎn)化合理途徑來(lái)確定代謝物的結(jié)構(gòu)。

圖2 藥物代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)和鑒定方法Fig.2 Method for the discovery and identification of drug metabolites

Du等[30]使用高分辨質(zhì)譜分析大鼠膽汁中噻氯匹定綴合物，應(yīng)用各種數(shù)據(jù)采集和處理工具進(jìn)行鑒定。使用EIC、MDF和IPF進(jìn)行數(shù)據(jù)處理：使用EIC和IPF技術(shù)檢測(cè)到的假陽(yáng)性代謝物很少，但不能發(fā)現(xiàn)非預(yù)期和失去氯原子的噻氯匹定綴合物；使用MDF技術(shù)能夠檢測(cè)到幾乎所有噻氯匹定綴合物，但是存在許多假陽(yáng)性代謝物。因此，聯(lián)合應(yīng)用這三種方法，可達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，更加全面有效地發(fā)現(xiàn)代謝物。

Liu等[31]建立了一種LC-Q TOF MS的分析方法，從人的血漿、尿液和糞便中查找抗腫瘤新藥?？颂婺岬拇x物。為了高效準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)并鑒定代謝物，使用MDF法查找代謝物，并利用核磁共振技術(shù)(NMR)對(duì)發(fā)現(xiàn)的可能代謝物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，共鑒定到人體內(nèi)29種?？颂婺岽x物。

3 結(jié)語(yǔ)

HPLC-HRMS技術(shù)由于其高靈敏度、高準(zhǔn)確度和高分離能力，成為藥物代謝產(chǎn)物分析的有力技術(shù)手段；通過(guò)結(jié)合各種數(shù)據(jù)處理方法，可用于代謝物的表征，以及未知微量代謝產(chǎn)物的檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定。但是，僅依靠HPLC-HRMS技術(shù)不能確定所有代謝物的結(jié)構(gòu)，需要更多新的技術(shù)和研究方法來(lái)應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)。比如，LC-HRMS具有較高的靈敏度，NMR具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)鑒定能力，二者聯(lián)用能夠更加全面準(zhǔn)確地鑒定復(fù)雜基質(zhì)中的代謝物[31]。

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IdentificationofDrugMetabolitesUsingDataPost-ProcessingStrategiesBasedonHighPerformanceChromatographyCoupledwithHighResolutionMassSpectrometer

ZHANG Dan, WANG Cai-hong, JIN Ying, WANG Zhe, ZHANG Jin-lan

(ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

High performance chromatography coupled with high-resolution mass spectrometer (HPLC-HRMS) has been widely used to discover and identify drug metabolites due to its high sensitivity, rapidity and high mass accuracy. Drug metabolites can be rapidly detected and identified based on mass data (high resolution mass and multiple stage mass) and mass data processing strategy. This paper reviews the strategies and applications for the discovery and identification of drug metabolites using HPLC-HRMS after consulting related papers in recent years. These strategies, including extracted-ion chromatography (EIC), mass defect filter (MDF), isotope pattern filter (IPF), background subtraction (BS), product ion filter (PIF), mass spectral trees similarity filter (MTSF), SWATH and MSE, were developed for the detection and identification of drug metabolites in complex biologic systems. Drug metabolites can be effectively detected and identified through the joint application of one or more strategies.

high performance chromatography coupled with high-resolution mass spectrometer (HPLC-HRMS); drug metabolites; data post-processing strategies; review

2017-04-17;

2017-05-23

張 丹(1993—)，女(漢族)，山東人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: zhangdan@imm.ac.cn

張金蘭(1969—)，女(漢族)，內(nèi)蒙古人，研究員，從事藥物分析研究。E-mail: zhjl@imm.ac.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0410-07

10.7538/zpxb.2017.0076