袁 將，姬瑞芳，全慶華，王加利，郭曉宇，張伽妹，譚 鵬，韓 靜，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

去氫駱駝蓬堿在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)代謝研究

袁 將，姬瑞芳，全慶華，王加利，郭曉宇，張伽妹，譚 鵬，韓 靜，劉永剛

(北京中醫(yī)藥大學，北京 100102)

去氫駱駝蓬堿是一種β-咔啉類生物堿，能夠顯著地抑制秀麗隱桿線蟲let-60(n1046gf)的多產(chǎn)卵器表型，具有治療胰腺癌的潛在能力。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)法分析去氫駱駝蓬堿，確定其可能的裂解途徑及特征碎片離子，同時研究其單體在線蟲體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，并對給藥后不同時間點的線蟲成蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿的含量進行半定量分析。結(jié)果顯示，去氫駱駝蓬堿的裂解途徑主要為RDA裂解，包括甲基、羥基等基團的丟失以及吲哚環(huán)的開裂。在電噴霧正離子模式下，檢測到去氫駱駝蓬堿(m/z213)的去甲基化(m/z199)、羥基化(m/z229)的代謝產(chǎn)物。半定量分析結(jié)果表明：0～5 h，線蟲代謝旺盛，線蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿的含量下降約80%；5 h后，代謝速率減慢。該方法適用于去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)代謝產(chǎn)物的研究，能夠為去氫駱駝蓬堿治療胰腺癌的新藥研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。

去氫駱駝蓬堿；秀麗隱桿線蟲；代謝；裂解機制；超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)

去氫駱駝蓬堿(harmine)，又稱肉葉蕓香堿，是一種β-咔啉類生物堿，其基本母核是由吲哚和吡啶駢和而成的，主要來源于多年生草本蒺藜科駱駝蓬(PeganumharmalaL.)，在植物、海洋生物、昆蟲、哺乳動物、人體組織、體液中也有分布。去氫駱駝蓬堿的藥理作用廣泛，包括抗菌、抗瘧原蟲、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗誘變、致幻等，對消化道腫瘤的治療效果顯著[1-4]。由于去氫駱駝蓬堿較好的抗腫瘤活性，許多學者對其結(jié)構(gòu)進行了修飾，發(fā)現(xiàn)9位N原子上的氫被苯丙基、芐基等取代時，其抗腫瘤活性顯著增強，IC50值在10 μmol/L以下時，應用前景廣泛[5-6]。

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)，以下簡稱“線蟲”，屬于線形動物門線蟲綱動物，具有結(jié)構(gòu)簡單、生命周期短、身體透明、易于鏡下觀察、遺傳背景清楚、體型細小、易于高通量篩選、造模簡單等特點，在代謝綜合征疾病(如糖尿病、衰老、脂肪代謝疾病等)和神經(jīng)退行性疾病(如阿茲海默病、帕金森疾病、亨廷頓舞蹈癥等)的藥物篩選、藥物新靶點的發(fā)現(xiàn)和證實、藥物作用機制、化學基因組學和毒理學研究中應用廣泛[7-8]。許多哺乳細胞中的信號通路，如Wnt、Notch和Ras三條信號通路，在線蟲體內(nèi)是非常保守的。其中，Ras/MAPK信號通路在哺乳細胞中控制著細胞的分裂，而在線蟲中控制線蟲產(chǎn)卵器的形成，當這條通路上的基因發(fā)生突變時，如突變頻率較高的ras基因(翻譯產(chǎn)生Ras蛋白，在線蟲中的同源蛋白是Let-60)，線蟲將會形成除正常產(chǎn)卵器外的多個假產(chǎn)卵器，let-60(n1046gf)線蟲株就是根據(jù)此突變構(gòu)建的模型[9]。利用let-60(n1046gf)線蟲株篩選Ras蛋白的抑制劑-抗腫瘤藥物時，產(chǎn)卵器的個數(shù)成為判定篩選結(jié)果的依據(jù)，當藥物有效時，線蟲會形成一個正常的產(chǎn)卵器，恢復為野生型。線蟲身體結(jié)構(gòu)簡單，有完善的神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)，但沒有肝臟等器官，能否像哺乳動物一樣代謝藥物有待進一步研究。近年來研究發(fā)現(xiàn)，線蟲體內(nèi)含有多種酶，比如精氨酸酶[10](代謝精氨酸和部分含氮化合物，如尿素、甲酰胺等)、殼多糖酶[11](線蟲中有其同源蛋白)、乙醛脫氫酶[12](能夠抑制氧化應激)、細胞色素P450酶[13](能夠代謝內(nèi)源性和外源性物質(zhì))、乙醇脫氫酶[14]等代謝酶，為藥物的體內(nèi)代謝研究提供了可能。

本課題組前期研究表明，去氫駱駝蓬堿能夠有效地抑制let-60(n1046gf)線蟲多產(chǎn)卵器株表型，并且呈現(xiàn)劑量依賴性，濃度為80 μmol/L時的抑制率接近90%，但是去氫駱駝蓬堿能否在線蟲體內(nèi)發(fā)生代謝有待研究?；诖?，本研究將采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF MS)聯(lián)用技術(shù)分析去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，并考察代謝速率，豐富完善其在電噴霧正離子模式下的質(zhì)譜裂解規(guī)律，為去氫駱駝蓬堿乃至于β-咔啉類生物堿的研究和線蟲在中藥篩選中的應用奠定基礎。

1 實驗部分

1.1儀器及試劑

ACQUITY 超高效液相色譜儀：美國Waters公司產(chǎn)品；DH3600電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司產(chǎn)品；體式顯微鏡：上海普丹光學儀器生產(chǎn)公司產(chǎn)品；去氫駱駝蓬堿：純度>98%，實驗室自制；1-乙基吲哚-3-甲酸：純度>98%，實驗室自制；let-60(n1046gf)線蟲株：美國Caenorhabditis Genetics Center(CGC)產(chǎn)品；NGM培養(yǎng)基、M9溶液：實驗室配制；甲酸、乙腈：均為質(zhì)譜級，美國Fisher公司產(chǎn)品；蒸餾水：屈臣氏公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.2實驗條件

1.2.1色譜條件 Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；洗脫系統(tǒng)：0.1%甲酸水(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～2 min(2%B)，2～10 min(2%～98%B)，10～12 min(98%B)，12～12.1 min(98%～2%B)，12.1～14 min(2%B)；流速0.3 mL/min；進樣量2 μL；柱溫40 ℃；樣品室溫度4 ℃。

1.2.2質(zhì)譜條件 采用ESI正離子模式檢測，亮氨酸腦啡肽作為校正液；毛細管電壓3.0 kV；錐孔電壓40 V；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度400 ℃；錐孔氣體流速50 L/h；脫溶劑氣流速800 L/h；低能通道碰撞電壓6 V，高能通道碰撞電壓10～80 V；質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 200；Continuum模式下的3D數(shù)據(jù)采集模式；數(shù)據(jù)分析采用MassLynx V4.1數(shù)據(jù)處理工作站及以中藥數(shù)據(jù)庫為基礎的UNIFI 1.7軟件。

1.3NGM培養(yǎng)基的配制

用二甲亞砜(DMSO)將去氫駱駝蓬堿配制成50 mmol/L溶液，按照文獻[15]的方法，另外加入去氫駱駝蓬堿溶液(加藥組)或DMSO(對照組)，配制成每板含80 μmol/L去氫駱駝蓬堿或DMSO的培養(yǎng)基，備用。

1.4秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)與加藥處理

挑取let-60(n1046gf)線蟲株成蟲置于配制好的22 ℃ NGM培養(yǎng)基中產(chǎn)卵2 h，然后將成蟲挑走，加入含有80 μmol/L去氫駱駝蓬堿或DMSO的OP50大腸桿菌作為食物，置于22 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至成蟲。用M9溶液將線蟲成蟲從培養(yǎng)基中洗下，收集在EP管中，置于培養(yǎng)箱中饑餓，分別在0、2、4、6、8、10、16 h時將其取出；以4 000 r/min離心2 min，沉淀部分用甲醇-水混合溶液(3∶1，V/V)振搖清洗3次，每次10 min，除去線蟲體表的雜質(zhì)；然后用300 μL混合溶液將沉淀部分重新混懸，用研磨器充分研磨，將研磨液以13 000 r/min高速離心15 min；取200 μL上述樣品與5 μL內(nèi)標溶液混合(0.01 g/L甲醇)，漩渦振蕩1 min，吸取上清液，進行液相色譜-質(zhì)譜分析。

各取10 μL上述不同時間點的樣品溶液混合作為質(zhì)控樣本(QC)，進行半定量方法學考察。

1.5對照品溶液及內(nèi)標溶液的配制

分別精密稱取1.00 mg去氫駱駝蓬堿對照品和內(nèi)標，加甲醇超聲溶解，定容至10 mL容量瓶中，配制成濃度為0.1 g/L的對照品和內(nèi)標貯備液，儲存于4 ℃冰箱中。精密吸取適量的該儲備液，用甲醇稀釋，配制成濃度為0.01 g/L的對照品和內(nèi)標溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1碰撞能優(yōu)化

去氫駱駝蓬堿是一種β-咔啉類生物堿，該類成分在正離子模式下容易離子化、裂解碎片規(guī)律性較強、響應值高于負離子模式，因此選擇在正離子模式下進行。本實驗吸取2 μL 80 μmol/L去氫駱駝蓬堿注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，考察在電噴霧正離子模式下，不同高能通道10～15、20～25、30～35、40～45、60～65、80～85、100～120、120～140和10～80 V碰撞能量下的碎片離子信息，其質(zhì)譜圖示于圖1。其中，100～120 V和120～140 V高碰撞能量的碎片響應值非常低，僅為e3；而10～15、20～25和30～35 V低碰撞能量的母離子響應值較高，不易裂解且碎片信息較少。因此，最終選擇10～80 V碰撞能量階梯，產(chǎn)生的碎片信息最豐富，響應值較高，且能顯示β-咔啉類生物堿的裂解特征。

2.2去氫駱駝蓬堿的質(zhì)譜裂解機制

去氫駱駝蓬堿是由一分子甲氧基吲哚和一分子甲基吡啶駢和而成，分子式為C13H12N2O，相對分子質(zhì)量為212，其結(jié)構(gòu)式示于圖2。將去氫駱駝蓬堿標準品溶液進行UPLC-Q-TOF MS分析，主要產(chǎn)生m/z213、198、170、155、144、140、130和115等碎片離子。其中，m/z213是去氫駱駝蓬堿的準分子離子[M+H]+；m/z198是準分子離子丟失1個甲基形成的碎片離子[M+H—CH3]+；m/z170是m/z198丟失1個CO(28 u)中性碎片形成的，而丟失CO的前提是在苯環(huán)上形成羥基，然后異構(gòu)化形成羰基，所以m/z198是由吲哚環(huán)上甲氧基中甲基丟失形成的；m/z155是m/z170中性丟失15 u形成的碎片離子[M+H—CH3—CH3]+；m/z144是m/z170發(fā)生RDA裂解，丟失1個乙炔分子形成的；m/z140是由m/z155發(fā)生2次α裂解丟失原吲哚環(huán)上的亞胺基(15 u)而形成的碎片離子[M+H—CH3—CH3—NH]+；m/z130是在m/z144的基礎上丟失1個CH2中性碎片形成的；而m/z115是由m/z155發(fā)生RDA和α裂解形成的碎片離子。去氫駱駝蓬堿可能的裂解途徑示于圖3。綜合來看，在電噴霧正離子模式下，去氫駱駝蓬堿發(fā)生裂解行為時吡啶環(huán)比較穩(wěn)定，吲哚環(huán)易裂解，裂解方式主要是RDA裂解和α裂解。

注：a.10～80 V;b.60～65 V;c.80～85 V; d.100～120 V;e.120～140 V;f.40～45 V; g.30～35 V;h.20～25 V;i.10～15 V圖1 不同碰撞能量下去氫駱駝蓬堿的高能通道質(zhì)譜數(shù)據(jù)Fig.1 MS spectras in high energy scan under different collision energies

圖2 去氫駱駝蓬堿的化學結(jié)構(gòu)式Fig.2 Chemical structure of harmine

2.3去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)代謝物

本研究基于高分辨液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，并借助UNIFI藥物代謝解決方案的策略，首先將化合物去氫駱駝蓬堿的名稱、分子式、結(jié)構(gòu)式(結(jié)構(gòu)式保存為.mol格式的文件)導入UNIFI數(shù)據(jù)庫；第二步將采集的Continuum原始數(shù)據(jù)導入UNIFITM定性分析軟件，將DMSO空白對照組設置為“Reference”，將給藥線蟲組設置為“Unknow”，通過設置可能的代謝途徑及適當?shù)牟杉瘏?shù)對各主要分子離子峰進行識別、校正，并與已建立的目標數(shù)據(jù)庫自動匹配；第三步是結(jié)合特征離子、色譜保留時間、精確分子質(zhì)量、分子碎片峰、對照品信息和相關(guān)文獻進一步驗證所有匹配化合物的結(jié)構(gòu)，排除假陽性結(jié)果。通過初步篩查發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)的代謝產(chǎn)物。

圖3 去氫駱駝蓬堿可能的質(zhì)譜裂解途徑Fig.3 Possible fragmentation pathway of harmine

圖4 去氫駱駝蓬堿(a)、線蟲對照組(b)、線蟲加藥組(c)的BPI圖，以及M0高能通道質(zhì)譜圖(d)Fig.4 BPI chromatograms of harmine (a), nematode control (b), drug administration (c), and MS spectra in high energy scan of M0 (d)

2.3.1M0母藥的確定 通過比較給藥線蟲組和DMSO空白對照組發(fā)現(xiàn)，給藥組在5.04 min出現(xiàn)了獨有的峰(圖4c中*表示該峰)，其準分子離子峰為m/z213.108 0[M+H]+，分子式為C13H12N2O。M0的高能通道質(zhì)譜圖示于圖4d，主要的裂解碎片為m/z198、170、155、144、140、130和115，這與標準品的保留時間及裂解碎片一致，確定M0為去氫駱駝蓬堿，表明去氫駱駝蓬堿確實能進入線蟲體內(nèi)并且可被質(zhì)譜檢測到。

2.3.2羥基化產(chǎn)物的鑒定 代謝產(chǎn)物M1的準分子離子為m/z229.096 1[M+H]+，比去氫駱駝蓬堿的準分子離子m/z213[M+H]+高16 u，并且其裂解碎片離子m/z214.072 8[M1—CH3]+和m/z186.077 9[M1—CH3—CO]+均比去氫駱駝蓬堿相應的碎片離子高16 u。根據(jù)色譜保留行為、精確質(zhì)量數(shù)及質(zhì)譜裂解碎片，推斷M1可能為去氫駱駝蓬堿的羥基化產(chǎn)物，其可能的裂解碎片信息示于圖5。

2.3.3去甲基化產(chǎn)物的鑒定 代謝產(chǎn)物M2的準分子離子是m/z199.085 7[M+H]+，比電噴霧正離子模式下去氫駱駝蓬堿的準分子離子低14 u，并且其裂解碎片離子m/z184.064 0[M2—CH2]+和m/z156.073 1[M2—CH2—CO]+均比去氫駱駝蓬堿相應的碎片離子低14 u。此外，碎片離子m/z156.073 1[M2—CH2—CO]+和m/z131.048 0[M2—CH2—CO—CH3]+表明，M2右側(cè)吡啶環(huán)上可能存在甲基。因此，根據(jù)色譜保留行為、精確質(zhì)量數(shù)及質(zhì)譜裂解碎片，推斷M2為去氫駱駝蓬堿丟失吲哚環(huán)中甲基后形成的去甲基化代謝產(chǎn)物，其可能的裂解碎片信息示于圖6。

圖5 M1的高能質(zhì)譜圖Fig.5 MS spectra in high energy scan of M1

圖6 M2的高能質(zhì)譜圖Fig.6 MS spectra in high energy scan of M2

2.4去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)代謝速率的考察

為了全面了解去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)的含量變化趨勢，本實驗建立了給藥后不同時間點的線蟲成蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿含量的質(zhì)譜半定量分析方法。1-乙基吲哚-3-甲酸的化學結(jié)構(gòu)與去氫駱駝蓬堿相似，且分子質(zhì)量與目標化合物不同，因此選擇1-乙基吲哚-3-甲酸作為內(nèi)標化合物，以目標生物堿與內(nèi)標化合物的相對峰面積比值代表去氫駱駝蓬堿的相對含量。采用UPLC-Q-TOF MS中的MRM數(shù)據(jù)采集模式對給藥后不同時間點的線蟲成蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿含量進行半定量分析，通過繪制相對峰面積比-時間曲線獲得給藥后的線蟲成蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿含量隨時間的變化情況。

2.4.1半定量分析的方法學考察 正離子模式下選取0.87、5.04、7.15、9.46、12.03 min所對應的m/z192.160 4、213.103 4、274.460 0、149.023 5、338.342 5離子進行半定量分析方法學考察，具體結(jié)果列于表1?？梢钥闯觯?個提取離子色譜峰峰面積的重復性、精密度和系統(tǒng)穩(wěn)定性的RSD分別在1%～4%、1%～8%、2%～8%之間，均在可以接受的范圍內(nèi)，可用于半定量分析。

表1 重復性、精密度和系統(tǒng)穩(wěn)定性結(jié)果Table 1 Results of repeatability, precision and system stability

圖7 去氫駱駝蓬堿在線蟲體內(nèi)含量的變化圖Fig.7 Changes of harmine content in vivo of nematode

2.4.2數(shù)據(jù)的采集與處理 按1.4節(jié)方法處理線蟲，進行3次重復實驗，采用 UPLC-Q-TOF MS中的MRM數(shù)據(jù)采集模式對不同時間點的樣品進行高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。用MassLynx V4.1軟件計算目標化合物和內(nèi)標化合物的峰面積，然后用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計繪圖，分別得到給藥后不同時間點的線蟲成蟲體內(nèi)去氫駱駝蓬堿的相對含量。其中，橫坐標為給藥后不同時間點，縱坐標為不同時間點相對峰面積比(與0 h相比)，繪制的相對峰面積比-時間曲線示于圖7。可見，在0～5 h內(nèi)，線蟲代謝旺盛，去氫駱駝蓬堿能夠被線蟲代謝掉80%左右；5 h后線蟲代謝速率減慢；10 h后基本趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本工作總結(jié)了電噴霧正離子模式下去氫駱駝蓬堿可能的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并在活性篩選結(jié)果的指導下考察了去氫駱駝蓬堿在秀麗隱桿線蟲let-60(n1046gf)體內(nèi)的代謝情況，發(fā)現(xiàn)線蟲能夠代謝去氫駱駝蓬堿生成去甲基化(m/z199)、羥基化(m/z229)代謝產(chǎn)物，同時半定量分析結(jié)果證明，線蟲在給藥后不同時間點的代謝速率是不同的。本工作為去氫駱駝蓬堿的后續(xù)研究和秀麗隱桿線蟲在中藥活性篩選、機制研究奠定了基礎。此外，代謝速率研究可為今后藥物機制研究中給藥時間、取樣時間的設定以及治療胰腺癌的新藥研發(fā)提供參考。

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MetabolismResearchofHarmineinvivoofCaenorhabditiselegans

YUAN Jiang, JI Rui-fang, QUAN Qing-hua, WANG Jia-li, GUO Xiao-yu, ZHANG Jia-mei, TAN Peng, HAN Jing, LIU Yong-gang

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijng100102,China)

Harmine is one ofβ-carboline alkaloid that significantly inhibits the multivulva phenotype oflet-60(n1046gf), a worm calledCaenorhabditiselegans. Therefore, harmine has an important potential application in pancreatic cancer. Metabolic researchinvivois one of the important ways of pharmacodynamic substance research, which can illuminate the existent form medicineinvivoand confirm the real active constituent of medicine. The fragmentation pathway of harmine was analyzed by ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS), and the possible fragmentation pathways and characteristic fragment ions were determined. The metabolites of harmane inCaenorhabditiseleganswere studied by UPLC-Q-TOF MS. The MRM data acquisition model was used to study the content of harmine in the nematode worms at different time after administration by the semi-quantitative analysis. The results show that the fragment pathways of harmine are mainly RDA cleavage, including the loss of methyl groups and hydroxyl groups, and the cracking of indole ring. The metabolites of demethylated (m/z199) and hydroxylated (m/z229) of harmine (m/z213) were detected in positive ion mode. The results of semi-quantitative study show that the metabolism of nematodes is strong in 0-5 h, and the content of harmine is decreased by about 80%, the metabolism rate slows down after 5 h. The study can lay the foundation for the development of new drugs for the treatment of pancreatic cancer.

harmine;Caenorhabditiselegans; metabolism; fragmentation mechanism; ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS)

2017-02-09;

2017-03-30

北京中醫(yī)藥大學校級課題(2016-JYB-QNJSZX003)資助

袁 將(1991—)，男(漢族)，山東臨沂人，碩士研究生，中藥化學專業(yè)。E-mail: bucmyj2015@163.com

劉永剛(1981—)，男(漢族)，山東臨沂人，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎研究。E-mail: liuyg0228@163.com

韓 靜(1977—)，女(漢族)，河北人，副研究員，從事中藥活性研究。E-mail: hanjing8585@163.com

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0478-08

10.7538/zpxb.2017.0025