趙 雪，孫 慧，張 琪，任天明，顧景凱

(吉林大學(xué)藥物代謝研究中心，吉林 長春 130012)

LC-MS/MS法測定比格犬血漿中氯吡格雷活性代謝物

趙 雪，孫 慧，張 琪，任天明，顧景凱

(吉林大學(xué)藥物代謝研究中心，吉林 長春 130012)

建立了一種定量測定比格犬血漿中氯吡格雷活性代謝物(active metabolize, AM)的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法。采血管中加入酯酶抑制劑敵敵畏，采樣后立即離心處理，取上層血漿，加入2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(MPB)進(jìn)行衍生化，反應(yīng)完成后直接加入含0.1%甲酸的冰乙腈沉淀蛋白，取上清液，測定氯吡格雷活性代謝物的衍生化產(chǎn)物(MP-AM)。以乙腈-0.1%甲酸為流動(dòng)相，梯度洗脫，API4000電噴霧離子源，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式掃描。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，獲得了峰寬較窄且對稱的色譜峰；MP-AM的線性范圍為1～1 000 μg/L，相關(guān)系數(shù)大于0.995；生物基質(zhì)效應(yīng)較小，提取回收率在92.8%～95.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.27%。該方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合國家食品藥品監(jiān)督管理總局(China Food and Drug Administration, CFDA)的相關(guān)要求，適用于比格犬血漿中氯吡格雷的藥代動(dòng)力學(xué)研究。

氯吡格雷；活性代謝物；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；藥代動(dòng)力學(xué)

氯吡格雷是美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的抗血小板藥物，用于治療心血管疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化血栓、不穩(wěn)定型心絞痛和心肌梗死等[1-2]。生物體內(nèi)氯吡格雷(85%)經(jīng)酯酶水解轉(zhuǎn)化為沒有活性的羧酸衍生物M1，只有少部分氯吡格雷經(jīng)細(xì)胞色素P450酶(Cytochrome P450)作用產(chǎn)生活性代謝物(AM)。AM的巰基通過二硫鍵與二磷酸腺苷(ADP)的P2Y12受體的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致與此受體偶聯(lián)的血小板糖蛋白受體的纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)不能暴露，從而達(dá)到抗血小板的作用。15%氯吡格雷主要在CYP2C19、CYP1A2、CYP2B6的作用下氧化成M2；48%的M2被酯酶水解，產(chǎn)生無活性的M3；M2主要在CYP3A4、CYP2B6、CYP2C19的作用下開環(huán)形成AM。氯吡格雷的代謝通路示于圖1，衍生化反應(yīng)示于圖2。

圖1 氯吡格雷的代謝通路Fig.1 Metabolic pathway of clopidogrel

圖2 AM的衍生化反應(yīng)Fig.2 Derivatization reaction of AM

AM結(jié)構(gòu)中含有活潑巰基，在生物體內(nèi)不穩(wěn)定，所以必須對巰基進(jìn)行衍生化保護(hù)，再測定氯吡格雷活性代謝物的衍生化產(chǎn)物(MP-AM)；另外，AM含有酯鍵，而血漿中有豐富的酯酶，故在血漿樣品采集時(shí)需加入酯酶抑制劑。目前，MP-AM定量分析法存在的問題是[3-4]：衍生化前對酯鍵的保護(hù)沒有詳細(xì)的描述、液相時(shí)間較長、樣品處理大多采用固相萃取和液-液萃取等繁瑣的操作方法。

本實(shí)驗(yàn)擬采用加入酯酶抑制劑、優(yōu)化色譜條件、簡化樣品前處理步驟等手段，對氯吡格雷活性代謝物進(jìn)行分析，希望建立一種準(zhǔn)確可靠、方便快捷的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)步驟

1.1儀器、藥品及試劑

API 4000液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有美國Applied Biosystem公司的電噴霧離子源以及Analyst 1.6.2數(shù)據(jù)處理軟件；高效液相色譜系統(tǒng)：美國Agilent公司產(chǎn)品；Sartorius BT 25 S分析天平：德國Sartorius公司產(chǎn)品；移液器(200、1 000 μL)：美國Eppendorf公司產(chǎn)品；Legend Micro 17R低溫高速離心機(jī)：美國Thermo公司產(chǎn)品；QL-901 Vortex渦流儀：海門市其林貝爾公司產(chǎn)品；MDF-382E(N)冰箱(-80 ℃)：日本Sanyo公司產(chǎn)品；BCD-206TXB冰箱(4 ℃)：中國海爾公司產(chǎn)品。

氯吡格雷(批號20150101)：天士力有限公司產(chǎn)品；聯(lián)苯雙酯(批號Q01130302)：北京協(xié)和藥廠產(chǎn)品；NH4HCO3、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮：美國Sigma公司產(chǎn)品；MP-AM溶液(5 mg/L)：加拿大多倫多研究化學(xué)(TRC)公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)：美國Sigma公司產(chǎn)品；甲酸(分析純)：北京化工廠產(chǎn)品；敵敵畏：購于農(nóng)資商店。

1.2實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1色譜條件 色譜柱：Ascentis C18柱(5 cm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸(B)；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃；進(jìn)樣量20 μL；梯度洗脫程序：0～0.3 min(45%A)，0.3～1.0 min(45%～95%A)，1.0～2.5 min(95%A)，2.5～2.7 min(95%～45%A)，2.7～4.0 min(45%A)。

1.2.2質(zhì)譜條件 ESI離子源，正離子檢測方式；離子噴射電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力0.31 MPa，源內(nèi)氣體2(GS2，N2)壓力0.28 MPa，氣簾氣體(N2)壓力0.17 MPa；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)掃描方式；MP-AM及聯(lián)苯雙酯的解簇電壓(DP)分別為70 V和35 V，碰撞能量(CE)分別為26 eV和19 eV；用于定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z504.1→m/z354.1(MP-AM)和m/z436.0→m/z386.9(聯(lián)苯雙酯)。

1.3溶液配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制 取適量5 mg/L MP-AM儲備液，用乙腈-水溶液(50∶50，V/V)稀釋，得到 5、15、50、150、500、1 500、5 000 μg/L MP-AM標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；另取適量MP-AM儲備液，用乙腈-水溶液(50∶50，V/V)稀釋，得到60、600、20 000 μg/L質(zhì)控工作液；兩種溶液均存于4 ℃冰箱中，備用。

1.3.2內(nèi)標(biāo)工作液的配制 準(zhǔn)確稱取10.52 mg聯(lián)苯雙酯，用乙腈溶解并稀釋至1 g/L，作為儲備液于4 ℃冰箱中保存；用乙腈-水溶液(50∶50，V/V)將儲備液稀釋至25 μg/L，作為工作液于4 ℃冰箱中保存。

1.3.3衍生化試劑的配制 取適量MPB，用乙腈溶解并稀釋至100 mmol/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4NH4HCO3溶液的配制 取適量NH4HCO3，用0.5%氨水溶液稀釋至200 mmol/L，備用。

1.3.5酯酶抑制劑-敵敵畏的配制 取適量敵敵畏，用1%肝素稀釋至20 mmol/L，備用。

1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品配制及未知生物樣品處理

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品制備 分別量取20 μL MP-AM標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成含待測物MP-AM血漿濃度分別為1、3、10、30、100、300、1 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液；另取200 μL質(zhì)控工作液，配制成含待測物MP-AM血漿濃度分別為2.4、24、800 μg/L質(zhì)控樣品溶液，分裝、凍存于-80 ℃冰箱中。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品溶液須現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品處理 取50 μL已配制好的標(biāo)準(zhǔn)曲線(質(zhì)控)樣品溶液，加入50 μL內(nèi)標(biāo)、100 μL NH4HCO3、100 μL乙腈和700 μL冰1%甲酸-乙腈溶液，渦旋振蕩60 s，于4 ℃離心機(jī)以13 300 r/min離心5 min，取20 μL上清液，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣分析。測試結(jié)果的定量依據(jù)為MP-AM與內(nèi)標(biāo)峰面積之比。采用權(quán)重系數(shù)1/X2進(jìn)行最小二乘線性回歸分析，得到MP-AM在比格犬血漿中濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，示于圖3。

圖3 比格犬血漿中MP-AM典型標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of MP-AM in beagle dog plasma

1.4.3生物樣品采集及處理 隨機(jī)選取3只比格犬，給藥前12 h禁食，自由飲水。灌胃給藥，給藥劑量6.6 mg/kg。采用比格犬前肢隱靜脈取血方式，分別于給藥前0 h和給藥后0.083 3、0.25、0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12 h采集2 mL全血，迅速加入至含酯酶抑制劑及肝素的采血管中(采血管須預(yù)冷)，立即于4 ℃離心機(jī)以13 300 r/min離心1 min；取50 μL上層血漿于2.00 mL抗吸附管中，加50 μL內(nèi)標(biāo)、100 μL NH4HCO3和100 μL MPB，渦流振蕩30 s，避光反應(yīng)10 min；最后加入680 μL 冰1%甲酸-乙腈溶液，渦旋振蕩60 s，于4 ℃離心機(jī)以13 300 r/min離心5 min，上清液于-80 ℃保存，待測。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1專屬性 取50 μL比格犬空白血漿，按1.4.2節(jié)方法處理并進(jìn)樣分析；另取受試比格犬給藥后采集的血漿樣品，按1.4.3節(jié)方法處理并進(jìn)樣分析，所得色譜圖示于圖4。

2.1.2最低定量限 取20 μL 10 μg/L的MP-AM標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用比格犬空白血漿配制成1 μg/L血漿樣品，按照1.4.3節(jié)方法處理并進(jìn)樣分析，共測定6個(gè)平行樣本，定量下限數(shù)據(jù)列于表1。

從表1可以看出，MP-AM的準(zhǔn)確度均在80%～120%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于20%，說明MP-AM的定量下限為1 μg/L是準(zhǔn)確可靠的。

2.1.3精密度與準(zhǔn)確度 用比格犬空白血漿配制2.4、24、800 μg/L 3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品(每個(gè)濃度6個(gè)平行樣本)，以考察批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；與同批隨行的標(biāo)準(zhǔn)樣品一同進(jìn)樣，考察同批內(nèi)樣品的準(zhǔn)確度和精密度，連續(xù)測試3天，評價(jià)日間準(zhǔn)確度與精密度。結(jié)果表明：日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%，準(zhǔn)確度在±15%之內(nèi)，說明該方法的準(zhǔn)確度、精密度良好，可以保證未知生物樣品測定的準(zhǔn)確性。

2.1.4基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 取20 μL濃度為12、120、4 000 μg/L的MP-AM標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，用純凈水稀釋至2.4、24、800 μg/L，混合均勻后，分別取50 μL稀釋好的溶液，加入50 μL內(nèi)標(biāo)、100 μL NH4HCO3、100 μL乙腈和700 μL 1%甲酸-乙腈溶液，渦旋混合60 s，取20 μL上清液進(jìn)樣分析，測定峰面積分別為AMP-AM、AIS。另取50 μL空白比格犬血漿、100 μL NH4HCO3、100 μL乙腈和700 μL 1%甲酸-乙腈溶液，渦旋混合60 s，于4 ℃離心機(jī)以13 300 r/min離心1 min后取上清液，分別加入50 μL稀釋至2.4、24、800 μg/L的工作液和50 μL內(nèi)標(biāo)，渦旋混合60 s，進(jìn)樣分析，測定峰面積分別為BMP-AM、BIS。提取回收率=(隨行質(zhì)控峰面積/A)×100%，基質(zhì)效應(yīng)=(B/A)×100%。按上述方法計(jì)算得到MP-AM的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子(matrix factor, MF)CV≤10.15%，低、中、高3個(gè)濃度的MP-AM提取回收率分別為95.1%、92.8%、94.7%，內(nèi)標(biāo)提取回收率為96.7%，其結(jié)果列于表2。

2.1.5穩(wěn)定性 按照1.4.2節(jié)方法制備室溫放置穩(wěn)定性樣品及自動(dòng)進(jìn)樣器穩(wěn)定性樣品(2.4、24、800 μg/L，3個(gè)濃度各3個(gè)平行樣本)，并按1.4.3節(jié)方法處理，取處理后上清液分別于室溫放置2 h、自動(dòng)進(jìn)樣器放置2 h后進(jìn)樣分析；按照1.4.2節(jié)方法制備長期凍存穩(wěn)定性樣品及反復(fù)凍融穩(wěn)定性樣品，分別進(jìn)行-80 ℃冰箱長期凍存30天及3次反復(fù)凍融，再按照1.4.3節(jié)方法處理，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，不同濃度(2.4、24、800 μg/L)樣品測定值的準(zhǔn)確度和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于±15%，說明該方法的穩(wěn)定性良好。

注：a.空白血漿；b.定量下限(LLOQ)；c.給藥后血漿加內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯雙酯圖4 比格犬血漿中MP-AM(左)與內(nèi)標(biāo)聯(lián)苯雙酯(右)的LC-MS/MS色譜圖Fig.4 LC-MS/MS chromatograms of MP-AM (left) and IS (right) in beagle dogs plasma

表1 MP-AM定量下限的準(zhǔn)確度、均值及精密度Table 1 Accuracy, mean and standard deviztion of MP-AM’s LLOQ

表2 質(zhì)控樣品測定濃度、準(zhǔn)確度及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Concentration, accuracy and standard deviation of quality control samples

將配制好的高濃度和低濃度MP-AM和內(nèi)標(biāo)工作液于4 ℃放置15天后，與新鮮配制的相同濃度MP-AM和內(nèi)標(biāo)工作液一同進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，比較兩者的峰面積。結(jié)果表明：兩者平均峰面積的偏差小于±15%，說明這兩種工作液于4 ℃冰箱中放置15 天后穩(wěn)定。

2.2藥代動(dòng)力學(xué)結(jié)果

比格犬灌胃給6.6 mg/kg氯吡格雷后，MP-AM的血藥濃度-時(shí)間曲線示于圖5，具體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)列于表3。

圖5 比格犬給藥后血漿中MP-AM的平均血漿濃度-時(shí)間曲線(n=3)Fig.5 Plasma concentration-time curve of the active metabolite produced after oral administration of clopidogrel to beagle dogs (n=3)

表3 比格犬血漿中MP-AM的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 3 Pharmacokinetic parameters of MP-AM in beagle dog plasma

2.3討論

2.3.1衍生化前酯鍵保護(hù) 氯吡格雷為上市很多年的藥物，已有很多關(guān)于氯吡格雷巰基代謝物定量分析方法的報(bào)道[5-9]，但是均未對其衍生化前酯鍵保護(hù)做詳細(xì)的描述，而這個(gè)環(huán)節(jié)會直接影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。針對這一問題，本實(shí)驗(yàn)采用如下操作予以解決：1) 實(shí)驗(yàn)操作在冰浴下進(jìn)行，采血管須預(yù)冷，這是由于低溫條件下，酶的活性比較低；2) 生物體內(nèi)存在大量的酯酶，為了保證測定數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，須在血漿樣品采集時(shí)于采血管中預(yù)先加入酯酶抑制劑。通常，有機(jī)磷、烷化劑、重金屬等都可以不可逆地抑制酶的活性。本實(shí)驗(yàn)選用有機(jī)磷農(nóng)藥-敵敵畏作為酯酶抑制劑，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)酯酶抑制劑濃度過大會導(dǎo)致溶血，濃度過低則達(dá)不到完全抑制酯酶活性的作用，所以在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了系列濃度水平的考察，優(yōu)化了本實(shí)驗(yàn)中酯酶抑制劑的濃度。

2.3.2衍生化條件 氯吡格雷的活性代謝物中含有巰基，生物體內(nèi)巰基不穩(wěn)定，極易氧化或與其他生物大分子(如谷胱甘肽等)結(jié)合，因此需要對其進(jìn)行衍生化保護(hù)。衍生化條件對于定量準(zhǔn)確與否至關(guān)重要，為此本實(shí)驗(yàn)控制衍生化試劑的加入在樣品采集后2 min內(nèi)完成，這樣可以保證不穩(wěn)定的巰基在與衍生化試劑反應(yīng)前不被氧化，為氯吡格雷巰基代謝物的準(zhǔn)確定量提供了時(shí)間保證。在此基礎(chǔ)上，還對衍生化反應(yīng)時(shí)長及MPB加入量進(jìn)行了考察。

1) 反應(yīng)時(shí)長：取相同的生物樣品，保持衍生化反應(yīng)條件及樣品處理方法等因素一致，考察5、10、20、30 min時(shí)間點(diǎn)的MP-AM濃度值。結(jié)果表明，反應(yīng)10 min可確保反應(yīng)完全。

2) MPB加入量：嘗試在體系中加入50、100、200 mmol/L的MPB，分別命名為體系1、體系2和體系3。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相同的生物樣品在體系1中的測得值低于體系2，體系2和體系3測得的結(jié)果沒有差別。因此，最終選擇向體系中加入100 μL 100 mmol/L烷基化試劑。由于MPB需要避光保存，本反應(yīng)是在避光條件下進(jìn)行的。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所建立的分析方法經(jīng)過了完整的生物樣品方法學(xué)確證，其準(zhǔn)確度、精密度均可達(dá)到國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)的相關(guān)要求，且操作簡便、快速、靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)對氯吡格雷活性代謝物的準(zhǔn)確定量分析，可滿足氯吡格雷藥代動(dòng)力學(xué)研究的需要。

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DeterminationofClopidogrelActiveMetaboliteinBeagleDogPlasmabyLC-MS/MS

ZHAO Xue, SUN Hui, ZHANG Qi, REN Tian-ming, GU Jing-kai

(ResearchCenterforDrugMetabolism,JilinUniversity,Changchun130012,China)

A method of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was developed for determining clopidogrel active metabolite (AM) in beagle dog plasma. LC separation was performed using water containing 0.1% formic acid and acetonitrile as mobile phases with the gradient elution at a flow rate of 1 mL/min. Quantitative analysis was achieved after the chromatographic separation on an Ascentis C18 column (5 cm×4.6 mm×5 μm). The electrospray ionization (ESI) source in positive mode and multiple reaction monitoring (MRM) were used for the detection of clopidogrel AM derivative (MP-AM). The sample pretreatment conditions such as the extraction method, the derivative reagents were optimized. The alkylating reagent 2-bromo-3’-methoxyacetophenone (MPB) was used to stabilize clopidogrel AM in blood. Blood samples were centrifuged immediately after collection to take plasma and MPB was then added. Protein precipitation with iced acetonitrile (containing 0.1% formic acid) as precipitation solvent was used for sample extraction. The post-extracted samples were analyzed by LC-MS/MS. The peaks are narrow and symmetrical. The linear range of MP-AM is 1-1 000 μg/L, and the linear correlation coefficient is more than 0.995. The method has no matrix interference. The recoveries of MP-AM range from 92.8% to 95.1% at three spiked levels of 2.4, 24 and 800 μg/L with the relative standard deviations (RSD) less than 8.27% (n=6). The intra-assay/inter-assay accuracy and precision are all acceptable. The method is simple, accurate and robust, which is suitable for research the pharmacokinetic of AM in beagle dog plasma.

clopidogrel; clopidogrel active metabolite; liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); pharmacokinetic

2017-02-21;

2017-04-24

趙 雪(1991—)，女(漢族)，吉林磐石人，碩士研究生，微生物與生化藥學(xué)專業(yè)。E-mail: zhaoxue1310@163.com

顧景凱(1963—)，男(漢族)，遼寧新民人，教授，從事藥物代謝與藥物動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: gujk@jlu.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0460-08

10.7538/zpxb.2017.0035