羅志剛，賀玖明，李鐵鋼，周 幟，黃羅嬌，張瑞萍，馬雙剛，庾石山，再帕爾·阿不力孜,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中央民族大學(xué)生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081)

基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)的整體動(dòng)物體內(nèi)藥物成像分析新方法研究

羅志剛1，賀玖明1，李鐵鋼1，周 幟1，黃羅嬌1，張瑞萍1，馬雙剛1，庾石山1，再帕爾·阿不力孜1,2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050；2.中央民族大學(xué)生物成像與系統(tǒng)生物學(xué)研究中心，北京 100081)

質(zhì)譜分子成像技術(shù)作為體內(nèi)藥物分析的新興工具受到越來越多的關(guān)注，其中生物體內(nèi)復(fù)雜基質(zhì)的干擾是面臨的關(guān)鍵問題之一。本研究利用高分辨質(zhì)譜技術(shù)的優(yōu)勢，采用空氣動(dòng)力輔助離子化質(zhì)譜成像方法(AFAI-MSI)，建立了高特異性的整體動(dòng)物體內(nèi)藥物成像分析新方法，以提高體內(nèi)藥物成像分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。以候選新藥右旋娃兒藤寧堿(S-(+)-deoxytylophorinidine, CAT)為研究對(duì)象，采用高分辨質(zhì)譜全掃描與靶向掃描相結(jié)合的方式，對(duì)整體動(dòng)物體內(nèi)藥物的分布進(jìn)行AFAI-MSI分析。結(jié)果表明，該方法能夠準(zhǔn)確地反映藥物特異性分布和處置情況。通過一次質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)，從整體動(dòng)物水平同時(shí)實(shí)現(xiàn)了候選新藥體內(nèi)分布和藥物干預(yù)下內(nèi)源性代謝物的成像分析，為候選新藥的早期研發(fā)提供思路與手段。

質(zhì)譜成像；空氣動(dòng)力輔助離子化(AFAI)；藥物分析；代謝產(chǎn)物；內(nèi)源性代謝物

藥物在整體動(dòng)物水平的吸收、分布、代謝及排泄情況的研究是新藥研發(fā)的重要內(nèi)容。獲取藥物對(duì)生物體內(nèi)源性物質(zhì)的干預(yù)和調(diào)控作用信息，對(duì)于藥物的藥效、作用機(jī)制及毒理的闡釋具有重要意義。分子成像技術(shù)是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的最直觀分析方法[1-3]，現(xiàn)有的成像技術(shù)主要有放射自顯影、熒光成像和質(zhì)譜成像等。其中，放射自顯影和熒光成像技術(shù)雖然靈敏度高，但需要特異性標(biāo)記[4-5]，且不能區(qū)分藥物和代謝產(chǎn)物；質(zhì)譜成像技術(shù)(MSI)無需特異性標(biāo)記，能夠同時(shí)進(jìn)行多分子檢測和分析，且對(duì)藥物及其代謝產(chǎn)物具有很好的區(qū)分和選擇性[6-10]。但該方法仍面臨一些技術(shù)上的挑戰(zhàn)，例如，由于藥物及其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物體內(nèi)分布差異大、含量低、易受動(dòng)物體內(nèi)復(fù)雜基質(zhì)的影響，因此需要高分辨、高特異性的質(zhì)譜成像技術(shù)與方法，以提高獲得信息的準(zhǔn)確性和可靠性[11-12]。

通常，傳統(tǒng)的藥物成像分析只關(guān)注藥物本身，忽略了其對(duì)內(nèi)源性代謝物的影響。最新的系統(tǒng)生物學(xué)觀點(diǎn)認(rèn)為，考察內(nèi)源性物質(zhì)的變化對(duì)藥物代謝特性的影響是成功預(yù)測藥物吸收、分布、代謝、排泄性質(zhì)以及毒性評(píng)價(jià)的前提[13]。綜合考察藥物、代謝物和內(nèi)源性代謝物的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化，有助于更深入地了解藥物的體內(nèi)過程和變化規(guī)律，為其作用機(jī)制、藥效及毒性的預(yù)測與評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

近年來，HE等采用自主研制的新型常壓敞開式空氣動(dòng)力輔助離子化(AFAI或AFADESI)技術(shù)及其裝置[14-15]，探索并創(chuàng)建了整體動(dòng)物體內(nèi)藥物成像分析的AFAI-MSI方法[8,16]，獲得了抗腫瘤候選新藥右旋娃兒藤寧堿(S-(+)-deoxytylophorinidine, CAT)及其主要代謝物在整體動(dòng)物體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布情況[8]。本工作將在前期研究的基礎(chǔ)上，擬采用Q-Orbitrap高分辨質(zhì)譜AFAI-MSI技術(shù)，建立全掃描與靶向掃描相結(jié)合的質(zhì)譜成像分析方法，在整體動(dòng)物水平同時(shí)考察抗腫瘤候選新藥(CAT)分布和內(nèi)源性代謝物在藥物干預(yù)下的成像分析，旨在建立候選藥物體內(nèi)整體分析及原位表征新方法。希望為新藥研發(fā)早期階段，揭示藥物體內(nèi)作用部位和過程的研究提供思路與手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與裝置

AFAI離子源接口：與Q-Orbitrap質(zhì)譜儀相

兼容；離子傳輸管：長度500 mm，外徑4 mm，內(nèi)徑3 mm；氣體流量計(jì)(0～45 L/min)：天津流量儀表有限公司產(chǎn)品；高壓電源(-10 000～10 000 V)：東文高壓電源股份有限公司產(chǎn)品；MTS225三維電控平移臺(tái)：北京光學(xué)儀器廠產(chǎn)品；SC100步進(jìn)電機(jī)控制器：北京北光世紀(jì)儀器有限公司產(chǎn)品；LSP01-2A Longer Pump注射泵：保定蘭格恒流泵有限公司產(chǎn)品；CM 3600冷凍切片機(jī)：德國萊卡公司產(chǎn)品；MRS-2400A48U Microtech掃描儀：上海中晶科技有限公司產(chǎn)品。

1.2材料與試劑

1.2.1試劑 甲醇：色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；甲酸：色譜純，美國Dikma Technologies 公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；生理鹽水：吉林科倫康乃爾制藥有限公司產(chǎn)品；干冰：北京龍潔斯經(jīng)貿(mào)有限公司產(chǎn)品。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3只健康雄性SPF級(jí)SD大鼠(許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001)：購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所。大鼠體重為160～170 g，分別用于空白、給藥30 min和2 h后藥物分布的質(zhì)譜成像分析。

1.2.3樣品 CAT樣品：由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所庾石山教授課題組提供。CAT及其主要代謝物M1的結(jié)構(gòu)式示于圖1。

1.3實(shí)驗(yàn)過程

1.3.1整體大鼠組織切片的制備 采用尾靜脈注射，以10 mg/kg劑量分別在給藥CAT 30 min和2 h后，使用超劑量乙醚將大鼠麻醉處死；右側(cè)臥固定于冷凍模具中，倒入冷凍液，于-80 ℃冷凍保存。進(jìn)行冷凍切片前，移入-20 ℃冰箱中，放置過夜。采用冷凍切片機(jī)切出厚度為40 μm的整體切片，盡可能包含主要器官，用相同的方法對(duì)空白對(duì)照的大鼠進(jìn)行切片。質(zhì)譜成像實(shí)驗(yàn)前，將切片在真空干燥器中干燥30 min。

圖1 CAT和M1的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of CAT and M1

1.3.2整體大鼠質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)的采集 采用與Q-Orbitrap質(zhì)譜儀相兼容的AFAI-MSI系統(tǒng)，設(shè)定噴霧電壓4 000 V，噴霧氣壓力0.8 MPa，傳輸管電壓1 200 V，毛細(xì)管溫度450 ℃。樣品解析系統(tǒng)參數(shù)與前期研究基本保持一致[8]，噴霧溶劑為甲醇-水溶液(80∶20，V∶V，含0.1%甲酸)，流速10 μL/min。電噴霧針與樣品表面的角度為60°，噴嘴與樣品間的距離為0.7 mm，噴嘴與傳輸管入口間的距離為3 mm，質(zhì)譜采集錐與傳輸管出口間的距離為20 mm，抽氣流速為45 L/min。樣品沿X軸方向移動(dòng)速度為0.4 mm/s，相鄰兩個(gè)掃描行之間的步進(jìn)間隔為0.5 mm。分別采用正離子模式的全掃描(m/z100～1 000)和2個(gè)二級(jí)質(zhì)譜掃描(母離子分別為m/z364和350，母離子的選擇寬度為2 u)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，全掃描質(zhì)量分辨率為70 000，二級(jí)質(zhì)譜掃描分辨率為17 500，譜圖采集頻率約為2.5 Hz。

2 結(jié)果與討論

2.1高分辨全掃描與靶向掃描的質(zhì)譜成像分析

AFAI-MSI成像平臺(tái)系統(tǒng)參數(shù)與前期實(shí)驗(yàn)一致[8,16]，對(duì)給藥CAT 2 h和空白對(duì)照的大鼠整體組織切片進(jìn)行全掃描(m/z100～1 000)和二級(jí)質(zhì)譜掃描，AFAI-MS譜圖及成像結(jié)果示于圖2。從圖2a中可以看出，質(zhì)譜峰信號(hào)復(fù)雜，背景離子強(qiáng)度高，藥物和代謝產(chǎn)物的離子峰較弱。但從區(qū)域放大圖(圖2b、2c)中可以觀察到離子峰m/z364.190 5和m/z350.175 1，它們與背景離子或內(nèi)源性代謝物離子得到良好區(qū)分。對(duì)m/z364.190 5和m/z350.175 1進(jìn)行成像分析，結(jié)果示于圖2d～2g。對(duì)比質(zhì)量容差為±0.005(質(zhì)量分辨率=350/0.005=70 000，圖2d、2e)和±0.02(質(zhì)量分辨率=350/0.02=17 500，圖2f、2g)的成像圖可以發(fā)現(xiàn)：在高分辨的圖2d中可以觀察到藥物CAT的分布輪廓特征；在低分辨的圖2f中可觀察到內(nèi)源性代謝物或背景離子對(duì)藥物成像的干擾，這給藥物成像結(jié)果的判斷帶來困難。

采用AFAI-MS/MS掃描模式對(duì)組織切片中的藥物(m/z364)和代謝產(chǎn)物(m/z350)進(jìn)行成像數(shù)據(jù)獲取和分析，結(jié)果示于圖2h～2k。從圖2h和2i中可以觀察到碎片離子m/z70，質(zhì)譜信號(hào)具有很好的特異性，證明是CAT及其代謝產(chǎn)物的特征子離子。在m/z(70.065 8±0.005)質(zhì)譜圖上，可清楚地觀察到藥物和代謝產(chǎn)物的分布輪廓，這與高分辨全掃描成像結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，利用Q-Orbitrap質(zhì)譜儀的高分辨分析能力，采用全掃描與二級(jí)質(zhì)譜掃描相結(jié)合的方式，在內(nèi)源性代謝物干擾的情況下，可實(shí)現(xiàn)藥物及其主要代謝產(chǎn)物同時(shí)、準(zhǔn)確地質(zhì)譜成像分析。

2.2藥物CAT干預(yù)下內(nèi)源性代謝物的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化

在上述研究基礎(chǔ)上，采用質(zhì)譜全掃描方式對(duì)候選新藥CAT及其代謝產(chǎn)物M1，在不同給藥時(shí)間和空白大鼠體內(nèi)的分布情況進(jìn)行AFAI-MSI分析，結(jié)果示于圖3。質(zhì)譜成像圖顯示了清晰的器官輪廓，與光學(xué)圖片中相應(yīng)器官的輪廓匹配良好；另外，成像圖顯示了CAT在不同器官分布的含量差異，與MS/MS譜掃描獲得的成像圖一致。從質(zhì)譜成像圖中可以觀察到：CAT在胃腸區(qū)的分布含量最高；在腦、脊髓、腎、腎上腺及胰腺中均有較高的含量分布；在肺中分布較少，在心臟和肝中分布最少。對(duì)比不同給藥時(shí)間的成像圖可獲得以下信息：給藥2 h后，CAT在腦、腎上腺及腎臟中均可穩(wěn)定存在，在心、肝、肺部位分布較少；CAT及其主要代謝產(chǎn)物M1在胃和腸部位蓄積和排泄。該成像結(jié)果與本課題組前期多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)分析結(jié)果一致[8]。上述結(jié)果證明，高分辨與全掃描模式結(jié)合的AFAI-MSI方法能夠高靈敏度、高特異性地檢測藥物及其代謝產(chǎn)物，且能反映藥物在整體動(dòng)物中的分布情況。

采用AFAI-MSI成像技術(shù)，利用高分辨質(zhì)譜全掃描方式，不僅可對(duì)藥物及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，同時(shí)可獲得大量內(nèi)源性代謝物的信息。CAT、代謝產(chǎn)物和代表性內(nèi)源性代謝物在整體動(dòng)物體內(nèi)的分布情況示于圖4。該圖分別顯示了 CAT藥物([M+H]+,m/z364.190 4)及其代謝產(chǎn)物([M+H]+,m/z350.173 5)和代表性內(nèi)源性代謝物中膽堿(m/z104.107 1)，氨基酸類(m/z121.064 5、122.071 6、148.133 3)，脂類(m/z754.532 5、796.525 8、798.541 0、848.556 2)等分子的分布情況。其中，氨基酸類主要分布在胃腸區(qū)域；酯類m/z754.532 5主要分布在肺中，m/z798.541 0分布在腦和脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中；膽堿在大鼠體內(nèi)的分布情況隨給藥時(shí)間的延長而發(fā)生顯著變化，在空白大鼠切片組織中，膽堿主要分布在胃腸的腔壁組織和大腦中，給藥30 min 和2 h的大鼠切片組織中，膽堿與CAT的分布特點(diǎn)一致，在皮層和胃腸腔隨藥物的分布變化其含量顯著提高。由此認(rèn)為，膽堿的分布變化可能與CAT的調(diào)控作用或藥效、毒性作用有關(guān)。

注：a.給藥CAT 2 h后大鼠組織切片AFAI-MS全掃描質(zhì)譜圖；a′.空白大鼠組織切片AFAI-MS全掃描質(zhì)譜圖;b.圖a中m/z 364處的放大質(zhì)譜圖；b′.圖a′中m/z 364處的放大質(zhì)譜圖；c.圖a中m/z 350處的放大質(zhì)譜圖；c′.圖a′中m/z 350處的放大質(zhì)譜圖；d.提取離子m/z 364.190 5在±0.005容差范圍內(nèi)的全掃描質(zhì)譜像圖；e.提取離子m/z 350.175 1在±0.005容差范圍內(nèi)的全掃描質(zhì)譜像圖；f.提取離子m/z 364.190 5在±0.02容差范圍內(nèi)的全掃描質(zhì)譜像圖；g.提取離子m/z 350.175 1在±0.02容差范圍內(nèi)的全掃描質(zhì)譜像圖；h.m/z 364的子離子AFAI-MS/MS質(zhì)譜圖；i.m/z 350的子離子AFAI-MS/MS質(zhì)譜圖；j.提取離子m/z 70.065 8在±0.005容差范圍內(nèi)的子離子掃描(m/z 364)質(zhì)譜像圖；k.提取離子m/z 70.065 8在±0.005容差范圍內(nèi)的子離子掃描(m/z 350)質(zhì)譜像圖圖2 AFAI-MSI分析給藥CAT 2 h后大鼠體內(nèi)藥物分布的質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)和結(jié)果Fig.2 Imaging data and results obtained by AFAI-MSI analysis from whole-body rat tissue section after dosing for 2 h

圖3 AFAI-HRMS 和 MS/MS方法分析CAT (m/z 364)及其主要代謝產(chǎn)物M1 (m/z 350)在整體動(dòng)物體內(nèi)的分布特征Fig.3 Distribution characteristics of CAT (m/z 364) and its metabolite M1 (m/z 350) in the whole body tissue section by AFAI-HRMS and MS/MS

上述結(jié)果表明，該方法可實(shí)現(xiàn)動(dòng)物體內(nèi)不同種類內(nèi)源性代謝物的同時(shí)成像分析?；诟叻直尜|(zhì)譜的AFAI-MSI方法在不需預(yù)先了解化合物結(jié)構(gòu)信息的情況下，通過對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析，可獲取未知內(nèi)源性代謝物在器官組織中的分布信息，可以為代謝物的結(jié)構(gòu)確認(rèn)提供信息。

3 結(jié)論

針對(duì)藥物及其代謝物的高靈敏、高分辨的檢測需求，本研究采用高分辨質(zhì)譜AFAI-MSI成像技術(shù)，建立了一種整體動(dòng)物體內(nèi)藥物成像分析和原位表征的新方法。該方法能夠獲取藥物及其代謝產(chǎn)物在整體動(dòng)物體內(nèi)的分布信息，同時(shí)可獲取大量未知內(nèi)源性代謝物在藥物干預(yù)下的分布信息。利用高分辨質(zhì)譜全掃描模式，只需一次質(zhì)譜成像分析，即可實(shí)現(xiàn)在整體動(dòng)物水平上同時(shí)考察候選新藥和內(nèi)源性代謝物在藥物干預(yù)下的空間動(dòng)態(tài)變化。這有助于更深入地了解藥物的體內(nèi)過程和變化規(guī)律，為其作用機(jī)制、藥效及毒性的預(yù)測與評(píng)價(jià)提供依據(jù)，同時(shí)有望為候選新藥的早期研發(fā)、揭示藥物體內(nèi)作用部位及過程等提供研究思路與手段。

致謝：感謝清華大學(xué)唐飛教授和王曉浩教授課題組在質(zhì)譜成像裝置硬件開發(fā)上的幫助；感謝科邁恩(北京)科技有限公司田潤濤博士在質(zhì)譜成像軟件開發(fā)上的支持；感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所黃瀾老師在整體動(dòng)物切片制作過程中給予的幫助。

圖4 AFAI-MSI全掃描模式分析CAT(m/z 364) 、代謝產(chǎn)物M1(m/z 350) 和代表性內(nèi)源性代謝物(m/z 104, m/z 121等) 在整體動(dòng)物體內(nèi)的分布特征Fig.4 Distribution characteristics of CAT (m/z 364), its metabolites (m/z 350) and endogenous metabolites (m/z 104, 121, et al) in whole-body rat tissue section acquired by AFAI-MSI in full mass scan mode

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DevelopmentofaNovelImagingMethodforWhole-BodyAnimalBiopharmaceuticalAnalysisUsingHighResolutionMassSpectrometryTechnique

LUO Zhi-gang1, HE Jiu-ming1, LI Tie-gang1, ZHOU Zhi1, HUANG Luo-jiao1,
ZHANG Rui-ping1, MA Shuang-gang1, YU Shi-shan1, ABLIZ Zeper1,2

(1.StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China; 2.CenterforImagingandSystemsBiology,MinzuUniversityofChina,Beijing100081,China)

Mass spectrometry imaging (MSI) is a label-free molecular imaging technique whereby to simultaneously measure and map multiple biomolecules directly from tissue sections. It is reported that MSI analysis of metabolites has undergone a fast development and has been developed into a powerful tool for drug development and discovery in recent years. However, some problems, such as molecule covering range, sensitivity of metabolite detection, and the interference from the complicated biological matrix are still remaining as challenges for current MSI technologies. To tackle with these problems, our group previously developed an air flow assisted ionization (AFAI) MSI platform, and successfully applied it oninvivopharmaceutical analysis. Aiming at increasing the sensitivity and specificity ofinvivopharmaceutical analysis, an integrated MSI method to simultaneously image drug and endogenous metabolites in whole body tissue section was developed using AFAI-MSI in a full mass scan mode. This method can acquire not only the distribution of drugs and its metabolites, but also enormous various endogenous metabolites in one experiment, as resulted to obtaininsituspatial and chemical information of parent drugs and metabolites in whole-body tissue sections; and the target organs of drugs can be directly mapped. Based on our previously reported AFAI ion source, we modified the interface to couple the AFAI ion source on a Q-orbitrap mass spectrometer, and constructed an new AFAI-MSI device, and further specifically programed the data features (high resolution MS data) into our MSI software, finally achieved rapid and reliable MSI analysis of tissue section, along with high stability and accuracy information for metabolite identification. The drug candidateS-(+)-deoxytylophorinidine (CAT) was selected to study the spatial distribution in rat. AFAI-MSI analysis was performed for the administered tissue sections along with the data acquiring in high mass resolution full scan mode and targeted selected ion scan mode, and the distribution and dispersion of CAT in rat euthanized at different time points (30 min and 2 h) were acquired accurately and specially. By integrating the advantage of air flow-assisted ionization (AFAI) and high resolution mass spectrometry imaging (HRMSI), a high specified MSI method has been developed to improve accuracy and reliability for the simultaneous mapping drug and endogenous metabolites in whole-body rat tissue section. The acquired information of the endogenous metabolites lay a foundation to disclose the relevance of the biological transformation pattern and distribution characteristic with the effect and toxicity of new drugs, thus providing critical basis for the early prediction of drug effect and toxicity. The study demonstrated that the simultaneous imaging drug and the endogenous metabolites can be realized by high mass resolution AFAI-MSI analysis in a single experiment, which will provide an alternative way for the earlier drug discovery.

mass spectrometry imaging; air flow assisted ionization; pharmaceutical analysis; drug metabolites; endogenous metabolites

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373370，21335007)，重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)(2016YFF0100304)資助

羅志剛(1976—)，男(漢族)，河北安新人，助理研究員，從事藥物分析研究。E-mail: luozhg@imm.ac.cn

再帕爾·阿不力孜(1961—)，男(維吾爾族)，新疆烏魯木齊人，研究員，從事藥物分析研究。E-mail: zeper@imm.ac.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0417-08

10.7538/zpxb.2017.0036