汪亞麗，王 鷺，曾 蘇，康 玉

(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝和藥物分析研究所，浙江 杭州 310058)

質(zhì)譜法在藥物立體異構(gòu)體區(qū)分中的應(yīng)用及發(fā)展

汪亞麗，王 鷺，曾 蘇，康 玉

(浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物代謝和藥物分析研究所，浙江 杭州 310058)

質(zhì)譜法廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生命科學(xué)、藥學(xué)等領(lǐng)域，能夠提供分子質(zhì)量信息，有助于未知物結(jié)構(gòu)的解析，具有分辨率高、信息量大、樣品用量少、靈敏快速等優(yōu)點(diǎn),在測定有機(jī)化合物精確分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)解析、反應(yīng)機(jī)理等方面發(fā)揮著重要的作用。手性藥物是藥學(xué)領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)，近年來質(zhì)譜法逐漸被用于藥物手性雜質(zhì)區(qū)分中，而且隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),其在手性區(qū)分和分析中越來越受關(guān)注。本工作主要介紹了質(zhì)譜法在手性藥物立體異構(gòu)體雜質(zhì)分析中的應(yīng)用及發(fā)展歷程，闡述了各類質(zhì)譜技術(shù)用于手性異構(gòu)體分析的原理和特點(diǎn)，其中詳細(xì)舉例介紹了質(zhì)譜動力學(xué)方法和離子淌度質(zhì)譜方法在手性雜質(zhì)分析中的應(yīng)用。通過對比分析目前已有的各類手性分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)，說明利用質(zhì)譜法實現(xiàn)手性異構(gòu)體的區(qū)分和定量測定具有明顯的優(yōu)勢。質(zhì)譜法用于藥物手性異構(gòu)體的分離具有快速、不需要復(fù)雜的樣品前處理和昂貴的手性柱等特點(diǎn)，極大地提高了手性藥物分析的效率和準(zhǔn)確度。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的迅速發(fā)展，質(zhì)譜法將在多手性中心藥物的手性雜質(zhì)分離和生物大分子分析(如多糖、多肽)等領(lǐng)域發(fā)揮巨大潛能。

手性分子；質(zhì)譜法；立體異構(gòu)體雜質(zhì)

化合物的手性是自然界普遍存在的特征，生物體內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)以及多糖等都具有與其功能相適應(yīng)的手性結(jié)構(gòu)。分子的手性特點(diǎn)導(dǎo)致具有相同一級結(jié)構(gòu)化合物的空間構(gòu)象各異。藥物在體內(nèi)的吸收和代謝與其立體構(gòu)象有著密切聯(lián)系，具有不同對映體的手性藥物進(jìn)入生物體內(nèi)后受立體選擇性控制，其手性異構(gòu)體的代謝途徑和藥理作用常常各不相同，生物活性和藥效也不同，毒副作用也存在顯著差異[1-3]。目前臨床使用的藥物超過半數(shù)是手性藥物，其中大多數(shù)是消旋體的形式，隨著人們對藥物的藥理作用及代謝研究的深入，藥物的手性特點(diǎn)引起了極大的關(guān)注，藥物立體異構(gòu)體的研究已經(jīng)成為醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點(diǎn)和各制藥公司追求的新目標(biāo)。在新藥研發(fā)中，手性藥物所占比例逐年增加，據(jù)統(tǒng)計，2008～2013年全美銷售的小分子治療藥物中，8種手性藥物長期占據(jù)前10名的位置[2]。此外，根據(jù)美國FDA官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2010年1月～2014年12月，新上市的127種小分子治療藥物中，手性藥物多達(dá)81種，占總量的64%，所占比例最大，在這81種新型手性分子藥物中，絕大多數(shù)為單一對映體藥物[3-4]。

根據(jù)2015版《中國藥典》中藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則的相關(guān)規(guī)定，在單一對映體藥物中可能共存的其他對映體應(yīng)作為雜質(zhì)進(jìn)行檢測，對于表觀含量在0.1%及以上的雜質(zhì)，以及表觀含量在0.1%以下的具有強(qiáng)烈生物作用的雜質(zhì)或毒性雜質(zhì)，應(yīng)予以定性或確證結(jié)構(gòu)。在藥物手性雜質(zhì)分離方法上，傳統(tǒng)的旋光法在靈敏度、精確度或可靠性等方面都難以滿足現(xiàn)代立體化學(xué)研究的要求。為了檢測手性藥物的光學(xué)純度，研究純手性藥物的生物活性及其體內(nèi)過程，有必要研發(fā)更加快速、準(zhǔn)確、靈敏、簡便的手性分子分析方法。

1 手性分子分離方法研究進(jìn)展

為滿足手性化合物研究的需要，各種高靈敏度、高精確度和高可靠性的方法得到迅速發(fā)展，如核磁共振法(NMR)、色譜法、電泳法等。這些廣譜分析檢測技術(shù)具有高分辨率和高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，但也存在操作復(fù)雜、適用范圍有限等缺點(diǎn)[5]，其優(yōu)缺點(diǎn)比較情況列于表1。近年來，質(zhì)譜作為一種快速、準(zhǔn)確、操作簡單的高通量分析方法，也開始被應(yīng)用于同分異構(gòu)體的分離[6]，特別是針對手性異構(gòu)體的分析和定量測定，目前已有多種有效的質(zhì)譜法，如對映體標(biāo)記法(enantiomer-labeled method)、離子-分子反應(yīng)法(ion-molecule reaction)、動力學(xué)方法(kinetic method)[2,7-8]等。

表1 常用的手性分析方法優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 1 Comparation of the advantages and disadvantages of commonly used chiral analysis methods

2 質(zhì)譜法用于手性異構(gòu)體分離研究的發(fā)展歷程

過去，質(zhì)譜通常被認(rèn)為只能提供分子質(zhì)量信息，手性藥物因具有相同的分子質(zhì)量，而無法通過質(zhì)譜區(qū)分。然而，隨著人們對手性區(qū)分機(jī)理的不斷研究，手性分析技術(shù)得到了快速發(fā)展，質(zhì)譜法在手性雜質(zhì)分析中也開始受到重視。由于各種成熟的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學(xué)電離(APCI)、大氣壓光學(xué)電離(APPI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)、超聲噴霧電離(SSI)等，使生物分子無論是在液相還是固相中均能被有效地離子化，從而進(jìn)一步提高了質(zhì)譜分析的靈敏度和特異性[2,9-12]。各種新型質(zhì)譜儀和新的質(zhì)譜分析技術(shù)不斷問世，使質(zhì)譜法在手性分析領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。

質(zhì)譜法進(jìn)行手性區(qū)分的發(fā)展歷程主要表現(xiàn)為：1) 離子化方式改變，提高了質(zhì)譜分析的靈敏度和特異性。進(jìn)行手性識別的質(zhì)譜離子化方式由化學(xué)電離(CI)等傳統(tǒng)的電離方式逐漸發(fā)展為軟電離方式，使得利用碰撞誘導(dǎo)解吸(CID)、氣相的分子/離子交換反應(yīng)以及動力學(xué)方法進(jìn)行手性區(qū)分成為可能，同時也使產(chǎn)生手性差別的條件更為寬松、方式更為多樣、應(yīng)用更為廣泛[13-14]；2) 直接利用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行手性識別，已由單純的手性區(qū)分、絕對構(gòu)型的測定逐漸發(fā)展為手性藥物對映體的定量測定和手性藥物光學(xué)純度的測定。質(zhì)譜法直接進(jìn)行手性區(qū)分具有快速、靈敏度高、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且不需要復(fù)雜的樣品前處理或樣品衍生化，待測物的性質(zhì)也不會受到溶劑的干擾，因此有望在快速高通量的手性藥物質(zhì)量控制方面發(fā)揮作用。

目前，采用質(zhì)譜法區(qū)分對映異構(gòu)體主要分為兩類。一類是質(zhì)譜與其他有手性分離能力的儀器結(jié)合的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，為手性分析提供了高靈敏度和高準(zhǔn)確度的檢測系統(tǒng)，如色譜或者毛細(xì)管電泳與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。另一類則是單獨(dú)使用質(zhì)譜進(jìn)行手性區(qū)分。根據(jù)不同的對映體分離機(jī)理，目前可將手性質(zhì)譜法分為以下4種類型[1]。

2.1主-客體法

主-客體法(host-guest method)的原理是基于非對映異構(gòu)體的形成，但是它并不檢測非對映異構(gòu)體之間的性質(zhì)，而僅僅是使用單極桿質(zhì)譜記錄通過主-客體相互作用產(chǎn)生的非對映異構(gòu)體的相對豐度。

2.2離子/分子反應(yīng)法

離子/分子反應(yīng)法(ion/molecule (equilib-rium) reactions)是在主-客體法的基礎(chǔ)上根據(jù)手性異構(gòu)體存在反應(yīng)速率的差異這一特性實現(xiàn)手性區(qū)分。

2.3非對映異構(gòu)體配合物解離法

非對映異構(gòu)體配合物解離法(collision-induced dissociation of diastereomeric complex)是針對手性分子(AR或AS)和手性配體(ref)形成的非對映異構(gòu)體配合物，無法在單級質(zhì)譜上實現(xiàn)區(qū)分的問題，以串聯(lián)質(zhì)譜的碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)為基礎(chǔ)而建立的，是目前比較新且應(yīng)用最為廣泛的質(zhì)譜手性分析方法。非對映異構(gòu)體配合物解離法又分為3種類型：動力學(xué)方法(kinetic method, KM)、固定配體動力學(xué)方法(fixed ligand kinetic method)、手性比值區(qū)分法(chiral recognition ratio method, CR)。

質(zhì)譜動力學(xué)方法由Cooks[13,15-20]建立，最初應(yīng)用于氣體酸堿度和質(zhì)子親合勢的測定，后來也應(yīng)用于電子親合能、電離能、金屬離子與生物分子親合力、異裂鍵離解能的測定。KM法的最大優(yōu)點(diǎn)是具有較高的靈敏度，甚至可以檢測到由同位素取代引起的熱化學(xué)數(shù)值的細(xì)微變化。由于其操作簡單、譜圖及結(jié)果分析直觀，因此應(yīng)用較為廣泛。

KM法的原理示于圖1。這種方法用于手性異構(gòu)體分離時，一般采用過渡態(tài)二價金屬陽離子(M)與手性參比物(ref*)及手性分析物(AR:R構(gòu)型對映體，AS:S構(gòu)型對映體)形成三元四配位配合物離子(其中1個配體分子提供2個配原子，而另2個配體分子分別提供1個配原子)。三元配合物通過碰撞誘導(dǎo)解離(CID)使其裂解生成二元四配位配合物離子(每個配體分子提供2個配原子)，由于對映體之間的空間構(gòu)型不同，它在二元配合物離子中結(jié)合的牢固程度也不同，即所需的解離能量大小不同，在質(zhì)譜圖上裂解產(chǎn)物的離子豐度不同，據(jù)此可對樣品的手性進(jìn)行識別。

注：M.過渡態(tài)二價金屬陽離子；ref*.手性配體；A.手性分析物圖1 質(zhì)譜動力學(xué)方法原理Fig.1 Principle of the MS kinetic method

在一定的碰撞能量下，母離子[M(A)(ref*)2]2+競爭性丟失一分子配體和分析樣品，二級質(zhì)譜中產(chǎn)生相應(yīng)子離子[M(A)(ref*)—H]+及[M(ref*)2-H]+，手性選擇性的大小取決于[M(AR)(ref*)-H]+和[M(AS)(ref*)-H]+兩種配合物離子的自由能差值Δ(ΔG)chiral。

定義手性選擇性為：

Rchiral=RR/RS=[M(A)R(ref*)-H]+

[M(ref*)2—H]+/[M(A)S(ref*)-H]+

[M(ref*)2-H]+

其中，RR、RS分別是被測物為R、S構(gòu)型時，碰撞誘導(dǎo)解離所得到的兩種離子豐度比，當(dāng)Rchiral=1時，表明沒有手性識別能力，Rchiral值與1相差越遠(yuǎn)則表明手性識別能力越強(qiáng)。通過對映體過量比值法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以實現(xiàn)手性異構(gòu)體的定量檢測。

質(zhì)譜動力學(xué)方法具有分析樣品不需提純、操作簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于分析異構(gòu)體僅過量百分之幾的混合樣品，特別適用于其他衍生化法或色譜分離法無效的情況。

2.4離子淌度質(zhì)譜法

離子淌度質(zhì)譜法(ion mobility mass spectrometry, IMS)[21-27]是在氣相中根據(jù)離子的大小和形狀實現(xiàn)區(qū)分，類似于毛細(xì)管電泳，是一種氣相分析方法。該方法可在大氣壓下實現(xiàn)廣譜快速現(xiàn)場檢測，也稱為離子遷移質(zhì)譜或者大氣壓下質(zhì)譜，其原理示于圖2。離子淌度質(zhì)譜由離子源、離子淌度池和質(zhì)量分析器組成，利用不同物質(zhì)離子在電場作用下運(yùn)動行為的差別對其進(jìn)行分離檢測，手性分子與特定的配體及金屬離子形成配合物，由于立體構(gòu)型的差異，不同異構(gòu)體形成的配合物在相同電場下與碰撞氣的碰撞截面(collision cross section, CCS,Ω)和運(yùn)動行為產(chǎn)生差異，據(jù)此區(qū)分同分異構(gòu)體。根據(jù)離子淌度池的結(jié)構(gòu)與原理，又可分為漂移時間離子淌度質(zhì)譜、行波離子淌度質(zhì)譜、吸入離子淌度質(zhì)譜、場不對稱離子淌度質(zhì)譜四類。

離子淌度質(zhì)譜能增強(qiáng)對具有多個手性中心物質(zhì)的分析能力，在手性分析方面具有很大的發(fā)展?jié)撃?。近年來，離子淌度質(zhì)譜作為一項新興的質(zhì)譜分析技術(shù)，在手性分子分離中受到重視。如Mie等[28]利用場不對稱離子淌度質(zhì)譜分離和分析特布他林對映體，以二價金屬離子為中心，小分子氨基酸為手性配體，與特布他林樣品形成三元復(fù)合物[MⅡ(ARor AS)(ref)2-H]+，離子化后形成非對映體復(fù)合物。當(dāng)金屬離子和小分子配合物選擇恰當(dāng)時，對映體復(fù)合物在質(zhì)譜上得以區(qū)分。已有研究表明[29]，運(yùn)用場不對稱離子淌度質(zhì)譜能夠?qū)崿F(xiàn)對鄰、間、對-苯二甲酸異構(gòu)體的基線分離。該方法同樣可以用于定量檢測，在該研究中特布他林對映體的檢測限可達(dá)0.1%，與HPLC和CE相比，場不對稱離子淌度質(zhì)譜檢測限更低、樣品分析時間更短[30]。為了提高分離效率，離子淌度質(zhì)譜技術(shù)不斷地被改善。2012年，Holness等[22]提出在離子淌度池的碰撞氣體中加入一定量的手性氣體，可以明顯地改善手性異構(gòu)體的分離度。根據(jù)他們的研究，加入一定量的正辛醇可使麻黃堿和偽麻黃堿在漂移管中的分離度達(dá)到1.34。

圖2 離子淌度質(zhì)譜法原理Fig.2 Principle of ion mobility mass spectrometry

3 質(zhì)譜法在手性藥物分離中的應(yīng)用及發(fā)展前景

目前，對于質(zhì)譜法在手性物質(zhì)分離中的研究主要集中在一些小分子手性化合物的分析，如單糖[31-32]、小分子手性氨基酸[33-40]、小分子羧酸[41-42]、手性醇類[43]以及單個手性中心的藥物[44-45]。隨著質(zhì)譜分析技術(shù)的發(fā)展，特別是離子淌度質(zhì)譜的出現(xiàn)，增強(qiáng)了對具有多個手性中心物質(zhì)的分析能力，大大拓展了質(zhì)譜法的適用范圍[46-50]。近兩年，該方法在對其他結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多個手性中心藥物的研究逐漸增多，如利用漂移時間離子淌度質(zhì)譜對(R,S)-麻黃堿和(S,S)-偽麻黃堿進(jìn)行分離[22]，以及利用質(zhì)譜動力學(xué)方法實現(xiàn)對抗多重耐藥性革蘭氏陰性菌的抗生素GSK2251052A與其R構(gòu)型雜質(zhì)的分離[46]。

另外，質(zhì)譜法在生物大分子結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用也越來越受關(guān)注，結(jié)合MALDI方法能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合物及多聚核苷酸等生物分子進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析[51-52]。多糖是生物體內(nèi)普遍存在的一類聚合物，在生物體的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著重要作用，由于多糖碳鏈分支多，連接的單糖單元多存在手性中心，使得多糖結(jié)構(gòu)的測定比多肽和多聚核苷酸更困難。常用的分析方法并不能滿足要求，如NMR，雖然能夠提供糖苷鍵的連接信息，但是該方法需要大量樣品，且不能檢測出微量存在的異構(gòu)體雜質(zhì)。隨著離子淌度質(zhì)譜的出現(xiàn)，使單糖手性異構(gòu)體的分離和檢測成為可能。已有研究表明[14,16,40]，利用離子淌度質(zhì)譜可有效地分離手性單糖的同分異構(gòu)體及手性異構(gòu)體，是一種分析復(fù)雜多糖結(jié)構(gòu)的有效方法，與HPLC和CE相比，檢測限更低，可達(dá)0.1%，樣品分析時間更短。通過該方法檢測連續(xù)單糖的結(jié)構(gòu)，有望實現(xiàn)對生物大分子多糖碳鏈的結(jié)構(gòu)測定。

質(zhì)譜法用于手性分子的分離是在加入手性配體形成非對映體配合物的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，受特定手性配體和配位金屬離子的影響，其應(yīng)用具有一定的局限性。篩選或者合成適合的配體對提高方法的準(zhǔn)確性和改善手性異構(gòu)體之間的分離度非常重要。針對配體的篩選和優(yōu)化，有人提出“手性變形”的概念，即在質(zhì)譜非對映異構(gòu)體配合物解離法中，通過改變配體的大小和配位功能，使配體能夠更好地與手性分子結(jié)合，從而增大方法的手性識別能力和分離度[53]。隨著質(zhì)譜法的不斷改進(jìn)和發(fā)展，該方法在立體異構(gòu)體分離中的研究和應(yīng)用也越來越多，具體情況列于表2。

雖然質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣，但是該方法仍有一些亟待解決的問題。如：檢測靈敏度仍需提高；需要篩選適合的配體；目前的研究大部分是針對單個手性中心的分子，對于具有多個手性異構(gòu)體的多手性中心分子或一些生物大分子的研究尚少[55]；利用各種質(zhì)譜方法雖然能夠較好地分離手性分子的非對映異構(gòu)體，但是在對映異構(gòu)體之間的區(qū)分度還有待提高。因此，進(jìn)一步提高方法的實用性，發(fā)展質(zhì)譜技術(shù)在復(fù)雜基質(zhì)中的手性識別新方法[56-58]，是一項具有挑戰(zhàn)性的研究工作。

綜上，質(zhì)譜法作為一種新興的手性分析技術(shù)，隨著其在藥物分析領(lǐng)域應(yīng)用的逐漸拓展，該方法已顯現(xiàn)出對手性藥物立體異構(gòu)體分析的獨(dú)特優(yōu)勢，在手性分析方面具有很大的發(fā)展?jié)撃?。隨著對質(zhì)譜法的適用性和定量分析方面的深入研究，該方法有望成為一項重要的手性分析技術(shù)，為手性分子立體異構(gòu)體區(qū)分的研究提供新的方向和發(fā)展空間。

表2 質(zhì)譜法在手性分子立體異構(gòu)體區(qū)分中的應(yīng)用Table 2 Applications of mass spectrometry in chiral molecules stereoisomer distinguish

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ApplicationandDevelopmentofMassSpectrometryinDrugStereoisomerSeparation

WANG Ya-li, WANG Lu, ZENG Su, KANG Yu

(InstituteofDrugMetabolismandPharmaceuticalAnalysis,ZhejiangUniversity,Hangzhou310058,China)

Mass spectrometry (MS) is a kind of analytical method widely used in chemistry, life science, medicine and other fields. This method can provide information on molecular weight and is very helpful to structure analysis of unknown substance. It has advantages of high resolution, informative, less dosage of samples, sensitive, rapid, etc. MS plays an important role in the determination of accurate molecular weight of organic compounds, its structural analysis and the reaction mechanism research. As chiral drugs separation is a hot research topic in the field of medicine, MS has also been gradually applied to the distinction between the chiral impurities in recent years. With the continuous development of MS technology, it has obtained more and more attention in the analysis of chiral drug. This paper mainly reviewed the application and development history of MS in drug stereoisomer analysis of late years. The primary chiral MS methods in the current state come down to four categories, such as host-guest (H-G) method, ion/molecule (equilibrium) reactions, collision-induced dissociation (CID) and ion mobility mass spectrometry (IMS). The collision-induced dissociation (CID) of diastereomeric complex can be subdivided into three types for kinetic method (KM), fixed ligand kinetic method and chiral recognition ratio method (CR). All these MS methods were introduced considering their stereoisomer analysis principle and characteristics in this review. Examples were taken to make detailed instructions of the applications and advantages of the KM and IMS, which are two most popular MS methods said above. It has been widely accepted that mass spectrometry techniques have obvious advantages in separation and quantitative determination of stereoisomers owing to their high speed, accuracy and sensitivity. In conclusion, MS does not need complicated sample preparation and expensive chiral column when used to the optical impurities separation of chiral drugs, which greatly enhances the efficiency and accuracy in analysis of drug stereoisomers. The development of the mass spectrometry techniques would greatly promote the cutting-edge investigation and analysis of chiral impurities separation of drugs with multichiral centers and complicated conformation (such as polysaccharide, peptide) in the future.

chiral molecules; mass spectrometry; separation of stereoisomers

10.7538/zpxb.2016.0202

2016-12-16;

2017-03-06

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項目(81230080)資助

汪亞麗(1991—)，女(漢族)，湖北咸寧人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: 21519009@zju.edu.cn

康 玉(1984—)，女(漢族)，甘肅蘭州人，副教授，從事計算機(jī)輔助藥物分析研究。E-mail: yukang@zju.edu.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0400-10