劉曉云，陳笑艷，鐘大放

(中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物代謝研究中心，上海 201203)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜生物分析方法的基質(zhì)效應(yīng)和對(duì)策

劉曉云，陳笑艷，鐘大放

(中國科學(xué)院上海藥物研究所藥物代謝研究中心，上海 201203)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法具有高靈敏度、高選擇性、高通量等特點(diǎn)，已經(jīng)成為生物分析的主流方法，廣泛應(yīng)用于新藥發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過程中新化學(xué)實(shí)體及其代謝物的定量分析。然而，由于生物樣品基質(zhì)成分復(fù)雜，共洗脫物質(zhì)會(huì)影響分析物的離子化，使分析物的質(zhì)譜響應(yīng)增加或降低，從而影響LC-MS/MS分析方法的準(zhǔn)確度和精密度。一般而言，離子抑制較離子增強(qiáng)更為常見。因此，在建立LC-MS/MS法時(shí)，需要對(duì)離子抑制進(jìn)行評(píng)估和校正，并采用不同的策略消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響。本文綜述了生物樣品分析中基質(zhì)效應(yīng)的來源和評(píng)估方法，重點(diǎn)介紹了克服基質(zhì)效應(yīng)的策略。引起基質(zhì)效應(yīng)的物質(zhì)包括磷脂、鹽類、尿素、代謝物等內(nèi)源性物質(zhì)和賦形劑、抗凝劑、固定相釋放物質(zhì)及降解產(chǎn)物等外源性物質(zhì)。目前基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)方法主要有提取后加入法和柱后灌注法。克服基質(zhì)效應(yīng)的策略主要有使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)，將極性藥物衍生化，沉淀蛋白后稀釋上清液，優(yōu)化樣品預(yù)處理方法、色譜和質(zhì)譜條件等。結(jié)合本課題組的應(yīng)用實(shí)例，重點(diǎn)闡述了建立LC-MS/MS生物分析方法時(shí)，為減少基質(zhì)效應(yīng)遇到的困難及解決方法。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)；藥動(dòng)學(xué)；基質(zhì)效應(yīng)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)于20世紀(jì)90年代發(fā)展成熟，在靈敏度、選擇性、分析通量以及對(duì)藥物分析的適用性等方面有非常突出的優(yōu)勢(shì)，特別適用于復(fù)雜基質(zhì)(如血漿)中微量藥物及代謝物的定量分析，是近20年來生物分析的主流技術(shù)。然而，基質(zhì)效應(yīng)是該技術(shù)用于生物樣品定量分析中最突出的問題。在分析過程中，共洗脫物質(zhì)會(huì)影響分析物的離子化，這種現(xiàn)象稱為基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)分為離子抑制和離子增強(qiáng)，離子抑制使分析物的質(zhì)譜響應(yīng)降低，而離子增強(qiáng)則使分析物的質(zhì)譜響應(yīng)增加。一般而言，離子抑制較離子增強(qiáng)更易發(fā)生?；|(zhì)效應(yīng)會(huì)影響分析物的檢出限、定量限、線性、準(zhǔn)確度和精密度，嚴(yán)重干擾了生物樣品的定量分析。因此，在建立LC-MS/MS生物分析方法時(shí)，應(yīng)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，并采取適宜的方法消除或減少基質(zhì)效應(yīng)的影響，從而確保數(shù)據(jù)的可靠性。

本工作根據(jù)課題組近年來從事藥代動(dòng)力學(xué)研究的經(jīng)驗(yàn)，綜述LC-MS/MS分析測(cè)定中基質(zhì)效應(yīng)的來源、評(píng)估方法、克服基質(zhì)效應(yīng)的策略，并通過研究實(shí)例加以闡述，希望為克服LC-MS/MS生物分析方法的基質(zhì)效應(yīng)提供參考。

1 基質(zhì)效應(yīng)的來源和評(píng)估方法

采用LC-MS/MS分析測(cè)定時(shí)，生物樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)或外源性物質(zhì)會(huì)影響分析物的離子化或去溶劑化過程，使分析物的質(zhì)譜響應(yīng)增加或降低，從而產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)源性物質(zhì)是樣品基質(zhì)的一部分，如蛋白質(zhì)、磷脂、鹽類等；外源性物質(zhì)可能是色譜系統(tǒng)中的一部分，如緩沖液，或在樣品預(yù)處理過程中引入的物質(zhì)，如塑化劑[1]。研究發(fā)現(xiàn)，磷脂是產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)的主要內(nèi)源性物質(zhì)，它能夠嚴(yán)重抑制許多化合物的質(zhì)譜響應(yīng)，且較難從生物樣品中去除[2-4]。在生物基質(zhì)中，主要有甘油磷脂和鞘磷脂兩種類型的磷脂，前者包括卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺等，在不同受試者和不同采樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)，它們的濃度差別很大。在大部分人的血漿和尿液中，最常見的磷脂類型為卵磷脂[5]。

檢測(cè)和評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)主要有提取后添加法和柱后灌注法。提取后添加法以內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子定量基質(zhì)效應(yīng)，在相同濃度下，通過計(jì)算存在基質(zhì)時(shí)(由空白基質(zhì)提取后加入分析物)與不含基質(zhì)時(shí)(分析物的純?nèi)芤?分析物信號(hào)的比值來獲得基質(zhì)因子。若基質(zhì)因子大于1，說明存在離子增強(qiáng)；若基質(zhì)因子小于1，說明存在離子抑制。用分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子來計(jì)算內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子[6]。柱后灌注法主要用于定性評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，具體流程示于圖1[7]。通過注射泵將分析物的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入，然后經(jīng)T形管引入到色譜柱流出液中；將空白基質(zhì)樣品注入系統(tǒng)(同時(shí)連續(xù)灌注分析物)，并使用開發(fā)的分析方法在色譜柱上分離空白基質(zhì)樣品；若分析物的基線信號(hào)下降(信號(hào)抑制)或升高(信號(hào)增強(qiáng))，說明存在基質(zhì)干擾。

圖1 柱后灌注實(shí)驗(yàn)的設(shè)置示意圖Fig.1 Schematic of the set-up of a post-column infusion experiment

2 克服基質(zhì)效應(yīng)的策略

2.1使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)

內(nèi)標(biāo)與分析物暴露在相同的基質(zhì)成分中，使用分析物與內(nèi)標(biāo)的響應(yīng)比值進(jìn)行定量可以校正可能存在的基質(zhì)效應(yīng)，減少分析過程中基質(zhì)效應(yīng)的影響。對(duì)于LC-MS/MS法而言，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)(SIL-IS)是最合適的。SIL-IS是由分析物分子中的原子被它們的穩(wěn)定同位素，如2H、13C、15N、18O取代后獲得的。SIL-IS在樣品預(yù)處理、色譜分離、質(zhì)譜離子化和裂解過程中，與分析物幾乎一致。因?yàn)镾IL-IS與分析物的保留時(shí)間很接近，基質(zhì)對(duì)它們的影響是相同的，所以使用SIL-IS是克服基質(zhì)效應(yīng)最簡便的方法。但合成SIL-IS的難度較大，尤其是對(duì)多個(gè)分析物同時(shí)定量時(shí)，需要多個(gè)相應(yīng)的SIL-IS。

選擇合適的SIL-IS的主要標(biāo)準(zhǔn)有：1) 該同位素異構(gòu)體與生物樣品提取物中天然存在的同位素異構(gòu)體重疊最?。?) 內(nèi)標(biāo)的同位素純度盡可能高[8]。

本課題組使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的LC-MS/MS生物分析方法進(jìn)行的部分分析實(shí)例列于表1[9-23]，其中SIL-IS既可通過商業(yè)途徑購買，也可自行合成。經(jīng)驗(yàn)表明，使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)是校正基質(zhì)效應(yīng)最有效的手段。

2.2將強(qiáng)極性藥物衍生化

極性藥物結(jié)構(gòu)中一般含有強(qiáng)極性基團(tuán)，如胍基、核苷、氨基酸、糖和膦酸，它們?cè)诔Ｓ玫姆聪嗌V柱中保留較差。使用ESI離子源時(shí)，分析物可能會(huì)與內(nèi)源性物質(zhì)一起流出，造成嚴(yán)重的基質(zhì)效應(yīng)，并降低靈敏度[24]。因此，需要改善極性藥物在色譜柱上的保留，將分析物與內(nèi)源性物質(zhì)分離。柱前衍生化是分析極性藥物的重要手段，通過衍生化可以改善極性藥物的色譜行為和質(zhì)譜響應(yīng)。本課題組開發(fā)的柱前衍生化LC-MS/MS生物分析方法列于表2。

具有雙膦酸結(jié)構(gòu)的抗骨質(zhì)疏松藥物，如阿侖膦酸、米諾膦酸等廣泛應(yīng)用在臨床上。這類藥物的極性非常強(qiáng)，在液相色譜柱上不保留，所以在LC-MS/MS分析前須進(jìn)行衍生化。阿侖膦酸與三甲基硅烷化重氮甲烷(TMS-DAM)的衍生化反應(yīng)示于圖2a[13]，其中，TMS-DAM是衍生化試劑，甲醇作為催化劑。衍生化產(chǎn)物包括六甲基化衍生物和七甲基化衍生物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，使得反應(yīng)主要生成七甲基化衍生物。通過測(cè)試一系列衍生化溫度和反應(yīng)時(shí)間，最終確定衍生化條件為室溫下反應(yīng)30 min。需要注意的是，極性藥物容易發(fā)生不可逆吸附。阿侖膦酸的衍生物在玻璃表面也會(huì)發(fā)生吸附，所以樣品預(yù)處理中使用的玻璃器皿需要提前使用六甲基二硅氮烷進(jìn)行硅烷化。通過衍生化改善了阿侖膦酸的色譜行為，且衍生化后的結(jié)構(gòu)中含有季銨陽離子，大大提高了質(zhì)譜響應(yīng)。

米諾膦酸(MA)是高效的含氮二膦酸鹽，給藥劑量低、血藥峰濃度低。由于米諾膦酸含有強(qiáng)極性的磷酸基團(tuán)，建立定量下限為ng/L水平的分析方法具有挑戰(zhàn)性。采用固相萃取將米諾膦酸與內(nèi)源性成分分離后，再使用衍生化試劑TMS-DAM將其衍生化，生成五甲基化米諾膦酸(PMMA)，獲得定量下限為10 ng/L的LC-MS/MS分析方法[14]。米諾膦酸與TMS-DAM的衍生化反應(yīng)示于圖2b，其中，TMS-DAM作為衍生化試劑，水作為催化劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)d4-米諾膦酸的衍生化效率比米諾膦酸低，且差異較大，方法的線性和重復(fù)性較差。實(shí)驗(yàn)通過延長米諾膦酸和內(nèi)標(biāo)與衍生化試劑在固相萃取柱上的暴露時(shí)間，提高了d4-米諾膦酸的衍生化效率。通過優(yōu)化衍生化條件，可使PMMA和d4-PMMA衍生化反應(yīng)的產(chǎn)率接近100%。EDTA可以防止米諾膦酸與內(nèi)源性金屬離子形成復(fù)合物，使用EDTA作為抗凝劑時(shí)，可以促進(jìn)衍生化并提高重現(xiàn)性。

圖2 阿侖膦酸(a)、米諾膦酸(b)與三甲基硅烷化重氮甲烷的衍生化反應(yīng)Fig.2 Derivative reactions of alendronate acid (a) and minodronic acid (b) with trimethylsilyldiazomethane

三七素是非蛋白氨基酸，衍生化后可以顯著增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，并增加其在色譜柱上的保留時(shí)間，從而避免基質(zhì)效應(yīng)的影響[25]。三七素與甲醇的酯化反應(yīng)示于圖3，其中，甲醇作為衍生化試劑，鹽酸作為催化劑。反應(yīng)生成單甲酯衍生物或雙甲酯衍生物，雙甲酯衍生物的質(zhì)譜響應(yīng)比單甲酯衍生物高。實(shí)驗(yàn)考察了反應(yīng)溫度(65 ℃和70 ℃)和反應(yīng)時(shí)間(10、20、30 min)對(duì)衍生化效率的影響。結(jié)果表明，升高溫度和延長反應(yīng)時(shí)間都能促進(jìn)雙甲酯衍生物的生成。結(jié)合三七素的穩(wěn)定性，最終確定反應(yīng)條件為70 ℃下反應(yīng)20 min。通過衍生化，三七素的信號(hào)強(qiáng)度增加了50倍。

厄多司坦在臨床上用作黏痰溶解劑，其結(jié)構(gòu)上有巰基內(nèi)酯環(huán)，在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝生成含有游離巰基的活性代謝物M1，從而發(fā)揮抗氧化活性[26]。游離巰基極易被氧化，形成二硫鍵。代謝物M1分子極性大，較難在普通的反相柱上保留，基質(zhì)效應(yīng)大。因此采用還原劑二硫蘇糖醇(DTT) 與血漿樣品進(jìn)行孵化，游離出M1分子內(nèi)巰基，再用2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(MPB)衍生化試劑對(duì)游離巰基進(jìn)行衍生化，反應(yīng)示于圖4[27]。實(shí)驗(yàn)對(duì)衍生化溫度、時(shí)間、反應(yīng)pH值、DTT和MPB用量等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，通過對(duì)M1進(jìn)行衍生化，可改善其在色譜上的保留，克服基質(zhì)效應(yīng)的影響。

抗腫瘤藥奧替拉西在ESI-模式下具有良好的質(zhì)譜響應(yīng)，但是色譜峰的峰形和對(duì)稱性較差，因此使用化學(xué)衍生化方法改善其色譜行為[22]。奧替拉西的衍生化反應(yīng)示于圖5。奧替拉西先與鹽酸在60 ℃孵化20 min，以脫去羧酸；隨后與衍生化試劑4-溴乙基-7-甲氧基香豆素在60 ℃孵化1 h。經(jīng)過衍生化，降低了奧替拉西的極性，改善了色譜行為。由于衍生化產(chǎn)物包含了奧替拉西的大部分結(jié)構(gòu)，使得質(zhì)譜檢測(cè)具有特異性，降低了內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

圖3 三七素與甲醇的衍生化反應(yīng)Fig.3 Derivative reaction of dencichine with methanol

圖4 厄多司坦代謝物M1與2-溴-3’-甲氧基苯乙酮的衍生化反應(yīng)Fig.4 Derivative reaction of erdosteine metabolite M1 with 2-bromine-3’-methoxyacetophenone

圖5 奧替拉西脫羧后使用4-溴乙基-7-甲氧基香豆素進(jìn)行衍生化Fig.5 Derivative reaction of oxonic acid decarboxylation product with 4-bromomethyl-7-methoxycoumarin

2.3沉淀蛋白后稀釋上清液

在LC-MS/MS生物分析中，蛋白沉淀法(PPT)具有簡便快速的特點(diǎn)，PPT結(jié)合96孔板可以實(shí)現(xiàn)高通量和自動(dòng)化的樣品預(yù)處理。然而，PPT不能去除鹽類及其他內(nèi)源性物質(zhì)，如脂類、磷脂和脂肪酸，因此有較明顯的基質(zhì)效應(yīng)[28]。稀釋是最基本的樣品預(yù)處理方法，適用于對(duì)樣品稀釋后，分析物響應(yīng)降低幅度低于基質(zhì)效應(yīng)降低幅度的情況，一般用于分析方法對(duì)檢測(cè)限要求較低或分析物濃度較高的情況。為了減少基質(zhì)效應(yīng)，可以將PPT與稀釋相結(jié)合，以獲得更干凈的樣品提取物。

采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中阿帕替尼和4個(gè)主要代謝物時(shí)，使用乙腈沉淀蛋白后，取上清液與流動(dòng)相按體積比1∶2進(jìn)行稀釋[29]。采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中氟馬替尼和2個(gè)主要代謝物時(shí)，使用甲醇沉淀蛋白后，將上清液與流動(dòng)相按體積比3∶2進(jìn)行稀釋[30]。采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中雷諾嗪及3個(gè)主要代謝物時(shí)，使用乙腈沉淀蛋白后，將上清液與水按體積比1∶2進(jìn)行稀釋[31]。此外，在頭孢他啶和他唑巴坦[32]、拉米夫定[33]的LC-MS/MS分析方法中，也采用沉淀蛋白后稀釋上清液的預(yù)處理方法。

2.4其他策略

2.4.1優(yōu)化預(yù)處理方法 樣品預(yù)處理的目的主要包括：將分析物與基質(zhì)成分分離，對(duì)分析物進(jìn)行預(yù)濃縮，使樣品溶液與LC-MS/MS系統(tǒng)兼容。傳統(tǒng)上，液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)和蛋白沉淀法(PPT)是生物分析中最常見的3種樣品預(yù)處理技術(shù)。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)較為明顯時(shí)，優(yōu)先選擇LLE，其次為SPE，因?yàn)檫@兩種預(yù)處理技術(shù)能夠獲得較為干凈的提取物。

磷脂去除板是較新的樣品預(yù)處理方法，其結(jié)合了沉淀蛋白及固相萃取技術(shù)，能夠選擇性地沉淀蛋白，并去除磷脂。市場(chǎng)上已有一些不同類型的磷脂去除板，如沃特世的Ostro 96孔磷脂去除板、菲羅門的Phree 96孔磷脂去除板、安捷倫的Captiva ND 過濾板、西格瑪奧德里奇的混合型固相萃取96孔板等。與蛋白沉淀相比，這些板可以有效地除去樣品中的磷脂[34]。

2.4.2優(yōu)化色譜條件 優(yōu)化色譜條件是為了將分析物與干擾物質(zhì)分離，從而降低或減少基質(zhì)效應(yīng)。對(duì)于強(qiáng)極性化合物的生物分析，除了采用衍生化方法外，還可以通過優(yōu)化色譜條件來減少或避免基質(zhì)效應(yīng)。親水相互作用色譜(HILIC)是一種以極性材料為固定相(硅膠或衍生化硅膠)，高比例有機(jī)相和低比例水相為流動(dòng)相體系的色譜，分析物的保留時(shí)間隨著極性的增強(qiáng)而增加。因此，可以使用HILIC定量分析血漿樣品中內(nèi)源性物質(zhì)和藥物，HILIC色譜柱的選擇及樣品預(yù)處理已有詳細(xì)的報(bào)道[35]。

除了改變色譜柱的類型外，還可以通過降低液相色譜洗脫液的流速、改變洗脫液的組成、利用梯度洗脫將分析物與干擾物質(zhì)分離以及將兩種不同類型的色譜柱串聯(lián)等方法來克服基質(zhì)效應(yīng)的影響[8]。

2.4.3優(yōu)化質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)是LC-MS/MS分析方法中應(yīng)用最為廣泛的離子化技術(shù)，由于不同離子源的離子化原理不同，它們受基質(zhì)干擾的程度也不同。一般認(rèn)為，ESI較大氣壓化學(xué)電離(APCI)和大氣壓光電離(APPI)更容易受基質(zhì)效應(yīng)的干擾。

降低離子源的進(jìn)樣速度能夠顯著地降低基質(zhì)效應(yīng)，在低流速條件下，離子化效率顯著提高，減少了干擾物質(zhì)進(jìn)入離子源，從而減少了化學(xué)背景[36]。

3 應(yīng)用實(shí)例

3.1LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中阿托伐他汀及其代謝物

阿托伐他汀(AT)能夠降低膽固醇和低密度脂蛋白，臨床上用于高脂血癥病人預(yù)防心血管疾病，在體內(nèi)主要由肝臟的CYP3A4酶代謝為鄰羥基阿托伐他汀(o-OAT)和對(duì)羥基阿托伐他汀(p-OAT)兩個(gè)活性代謝產(chǎn)物[37]，其結(jié)構(gòu)式示于圖6。

為了克服基質(zhì)效應(yīng)，對(duì)樣品預(yù)處理方法進(jìn)行優(yōu)化，最終確定為鹽析輔助液-液萃取(SALLE)。結(jié)合穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)d5-AT、d5-o-OAT、d5-p-OAT的使用，建立了同時(shí)定量測(cè)定人血漿中AT、o-OAT和p-OAT的分析方法，其定量下限分別為0.020 0、0.020 0和0.010 0 μg/L[9]。

在優(yōu)化樣品預(yù)處理?xiàng)l件時(shí)主要考慮兩個(gè)因素：1) 樣品預(yù)處理方法需簡單快速，因?yàn)樗☆愃幬镌隗w內(nèi)外會(huì)發(fā)生羥基酸和內(nèi)酯的相互轉(zhuǎn)化，從而影響定量的準(zhǔn)確性；2) 需要使用選擇性較高的預(yù)處理方法，從而減少基質(zhì)效應(yīng)。

PPT具有簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，但是選擇性差，需要較長的色譜分離時(shí)間除去內(nèi)源性干擾。LLE和SPE能夠提供較為干凈的提取物，但是操作較為復(fù)雜、耗時(shí)，他汀類藥物容易發(fā)生羥基酸和內(nèi)酯的相互轉(zhuǎn)化。SALLE與LLE和SPE相比，具有操作步驟更少、萃取時(shí)間更短、回收率更高等優(yōu)點(diǎn)。此外，使用SALLE能夠獲得與LLE和SPE同等干凈的提取物，減少了基質(zhì)效應(yīng)的影響。該方法具有簡便、靈敏、高效的特點(diǎn)，已成功地應(yīng)用于阿托伐他汀的生物等效性研究。24名健康志愿者單次口服20 mg參比試劑和受試試劑后，AT、o-OAT和p-OAT的平均藥時(shí)曲線示于圖7[9]。

3.2LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中奧硝唑及其主要代謝物

奧硝唑是5-硝基咪唑衍生物，從20世紀(jì)70年代開始應(yīng)用于預(yù)防和治療厭氧菌感染[38]。奧硝唑在人體內(nèi)的主要代謝物有2’,3’-環(huán)氧奧硝唑(M3)、2’,3’-二羥基奧硝唑(M6)和奧硝唑葡糖醛酸化物(M16-1和M16-2)，其中，M3和M6是活性代謝物，M16-1和M16-2是非對(duì)映異構(gòu)體。葡糖醛酸化是奧硝唑的主要代謝途徑，也是造成對(duì)映體選擇性藥代動(dòng)力學(xué)的主要原因[39]。因此，需要對(duì)人血漿中奧硝唑及代謝物M3、M6、M16-1和M16-2進(jìn)行同時(shí)定量分析。

圖6 阿托伐他汀、鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀的結(jié)構(gòu)式Fig.6 Chemical structures of atorvastatin, o-hydroxyatorvastatin and p-hydroxyatorvastatin

注：數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)差圖7 24名健康志愿者單次口服20 mg參比試劑和受試試劑后，阿托伐他汀、鄰羥基阿托伐他汀和對(duì)羥基阿托伐他汀的平均藥時(shí)曲線Fig.7 Mean plasma concentration-time curves of AT, o-OAT, p-OAT after 20 mg oral administration of test formulation and a reference formulation to 24 healthy volunteers

在LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中奧硝唑及其主要代謝產(chǎn)物(M3、M6、M16-1、M16-2)時(shí)，采用簡單的蛋白沉淀法，使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行校正，獲得奧硝唑、M3、M6、M16-1和M16-2的定量下限分別為100、10、5、3、3 μg/L。分析物和內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)式，以及推測(cè)的裂解途徑示于圖8[17]。

對(duì)于LC-MS/MS分析方法而言，穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)是克服基質(zhì)效應(yīng)的首選方法。奧硝唑、M3、M6分別有相應(yīng)的氘代內(nèi)標(biāo)d5-奧硝唑、d5-M3、d5-M6；而M16-1和M16-2的氘代內(nèi)標(biāo)難以制備，無法獲得，但由于d5-奧硝唑的線性較好，因此可將其用作M16-1和M16-2的內(nèi)標(biāo)。氘代內(nèi)標(biāo)中的氫原子被氘原子取代后，降低了其與色譜柱之間的相互作用，保留時(shí)間較未氘代分析物提前。實(shí)驗(yàn)中，奧硝唑、d5-奧硝唑、 M3、d5-M3、M6、d5-M6的色譜保留時(shí)間分別為3.73、3.65、2.61、2.56、1.64、1.61 min。因此，需仔細(xì)評(píng)估分析物及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)對(duì)6個(gè)不同來源的空白血漿進(jìn)行考察，所有分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均在98.7%～104%之間，不同來源的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子的精密度小于13.5%，說明所有分析物的基質(zhì)效應(yīng)可以忽略不計(jì)。

圖8 奧硝唑、2’,3’-環(huán)氧奧硝唑、2’,3’-二羥基奧硝唑及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的結(jié)構(gòu)和質(zhì)譜裂解途徑Fig.8 Structures and fragmentation pathways of ornidazole, 2’,3’-epoxy ornidazole, 2’,3’-dihydrodiol ornidazole and their stable deuterium-labeled ISs

經(jīng)驗(yàn)證后的LC-MS/MS分析方法成功地應(yīng)用于6名中國健康志愿者單次口服1 000 mg奧硝唑的藥代動(dòng)力學(xué)研究，其藥時(shí)曲線示于圖9[18]。

注：誤差線代表平均濃度值和標(biāo)準(zhǔn)差圖9 6名中國健康志愿者單次口服1 000 mg奧硝唑后，奧硝唑及其代謝物M3、M6、M16-1和M16-2的藥時(shí)曲線圖Fig.9 Typical plasma concentration-time profiles of ornidazole, M3, M6, M16-1 and M16-2 after oral administration of 1 000 mg ornidazole to six healthy Chinese volunteers

4 結(jié)論與展望

綜上，目前克服基質(zhì)效應(yīng)的主要策略包括：使用穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)、對(duì)強(qiáng)極性藥物進(jìn)行柱前衍生化、沉淀蛋白后稀釋上清液。此外，針對(duì)不同藥物的特點(diǎn)，通過液-液提取等手段進(jìn)行生物樣品預(yù)處理，用APCI取代ESI電離方式，推遲色譜出峰時(shí)間等，都是可以嘗試的方法。隨著質(zhì)譜儀器靈敏度的提高，即使采用蛋白沉淀方法處理樣品，如果對(duì)生物樣品進(jìn)行大幅度稀釋(如稀釋20倍以上)，也可能克服基質(zhì)效應(yīng)。近年來，出現(xiàn)了用于生物樣品預(yù)處理的新型濾膜以除去血漿樣品中的磷脂，從而避免基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)是LC-MS/MS分析方法中所特有的問題，因此克服或減少基質(zhì)效應(yīng)是十分重要的。在生物分析方法開發(fā)和應(yīng)用中，有必要對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行仔細(xì)評(píng)估，確定其是否會(huì)影響分析物定量的重現(xiàn)性。

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MatrixEffectsandCountermeasureofLiquidChromatography-TandemMassSpectrometryinBioanalysis

LIU Xiao-yun, CHEN Xiao-yan, ZHONG Da-fang

(CenterforDrugMetabolismandPharmacokinetics,ShanghaiInstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofSciences,Shanghai201203,China)

Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has the characteristics of high sensitivity, high selectivity and high throughput, and has become the mainstream approach for bioanalytical assays. It is widely used for the quantitative analysis of new drug entities (NCEs) and their metabolites in the discovery and development of new drugs. However, due to the complex composition of the biological sample matrix, the co-eluting material affects the ionization of the analyte, result in increases or decreases the mass spectral response of the analyte, thus affecting the accuracy and precision of the LC-MS/MS analysis method. In general, ion suppression is more common than ion enhancement. When the analytical method is established, if the ion suppression is not evaluated and corrected, the sensitivity of the analytical method will be seriously affected. Therefore, it is important to assess the matrix effect and use different strategies to eliminate or reduce the impact of matrix effects. In this paper, an overview was provided, including how matrix effect occurs, outline the methodologies used to assess the matrix effect in biological sample analysis and discuss the strategy of overcoming the matrix effect. Substances that cause matrix effects include endogenous substances and exogenous substances. Endogenous substances include phospholipid, salts, urea, metabolites and so on. Exogenous substances such as excipients, anticoagulants, stationary phase release materials and degradation products. At present, there are mainly two method to assess the matrix effect, one is post-extraction spike, the other is post-column infusion. The strategies to overcome the matrix effect including the use of stable-isotope labeled internal standard, derivatization of polar drugs, dilute the supernatant after precipitation of the protein, optimize sample pretreatment method, the chromatographic conditions and the mass spectrometry conditions. This paper provides examples of the application of our laboratory, focusing on the difficulties encountered and solutions in the establishment of LC-MS/MS analysis methods.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); pharmacokinetics; matrix effect

2016-12-31;

2017-03-07

國家自然科學(xué)基金(81373479, 81521005)資助

劉曉云(1992—)，女(漢族)，福建人，碩士研究生，藥物分析專業(yè)。E-mail: 201528012342040@simm.ac.cn

鐘大放(1957—)，男(漢族)，吉林人，研究員，從事藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究。E-mail: dfzhong@simm.ac.cn

O657.63

：A

：1004-2997(2017)04-0388-12

10.7538/zpxb.2016.0214