周新尚，逄飛，竇少華*，任楠楠，張慶芳

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

海洋生淀粉酶菌株發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

周新尚1，2，逄飛1，2，竇少華1，2*，任楠楠1，2，張慶芳1，2

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

生淀粉酶是催化淀粉直接水解的酶類，其可廣泛應(yīng)用于食品、工業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。該研究首先利用單因素試驗研究發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度，發(fā)酵初始pH、裝液量、接種量對生淀粉酶活的影響，并在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法設(shè)計試驗，優(yōu)化了海洋生淀粉酶菌株ZXS-1的發(fā)酵條件。結(jié)果表明，其最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間38 h，發(fā)酵溫度25℃，初始pH 7。在此最佳發(fā)酵條件下，生淀粉酶酶活可達(dá)445.2 U/mL，較優(yōu)化前提高25.6%。

生淀粉酶；發(fā)酵條件優(yōu)化；響應(yīng)面法

生淀粉酶是指對不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒能夠表現(xiàn)出水解活性的酶類[1]。由于生淀粉酶能將未經(jīng)蒸煮糊化的生淀粉直接轉(zhuǎn)化成葡萄糖等可發(fā)酵性糖供微生物生長與代謝，其比傳統(tǒng)的高溫蒸煮糖化節(jié)約25%～30%的能耗。如果將其應(yīng)用于無蒸煮的酒精發(fā)酵[2]，可節(jié)約總能耗的30%～40%。也可以利用生淀粉酶酶解生淀粉生成多孔淀粉[3]，正是由于生淀粉酶具有的潛在的工業(yè)應(yīng)用價值和某些特殊用途，因此一直受到國內(nèi)外許多研究人員的關(guān)注。日本三得利公司酶解未糊化的玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精；姚衛(wèi)蓉等[4]利用生淀粉酶酶解生淀粉生成多孔淀粉，將其作為微膠囊、芯材、吸附劑等。目前，國內(nèi)外研究大部分是基于陸地環(huán)境生淀粉酶菌株的篩選、酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[5-9]，從海洋篩選生淀粉酶菌株少見于報道。若能充分研究并分析海洋生淀粉酶的性質(zhì)，將為社會帶來巨大的科研和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。

本研究對大連黃海海泥中分離出一株生淀粉酶高產(chǎn)菌假單胞桿菌（Pseudomonassp.）ZXS-1，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計試驗優(yōu)化其發(fā)酵條件[10-11]，首先基于Plackett-Burman（P-B）試驗設(shè)計找出重要影響因子，然后經(jīng)Design-Expert.V8.0.6軟件中響應(yīng)面Box-Behnken試驗設(shè)計對響應(yīng)過程變量進(jìn)行數(shù)學(xué)建模及分析，進(jìn)一步優(yōu)化響應(yīng)因子，確定最優(yōu)發(fā)酵條件[12-13]，目的是提高生淀粉酶的活力，從而為該海洋生淀粉酶更深入研究及中試實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株ZXS-1：分離自大連黃海海泥；蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、磷酸氫二鉀、生玉米淀粉、牛肉膏、葡萄糖、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸鎂、瓊脂粉：生物工程上海股份有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱、DK-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；DHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：龍尼柯儀器有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海審安醫(yī)療器械廠；GRX-02A干熱滅菌箱：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：蛋白胨12 g/L，酵母膏6 g/L，葡萄糖2 g/L，K2HPO42 g/L，pH 7.0。1×105Pa滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米淀粉12 g/L（160℃干熱滅菌2 h），蛋白胨5 g/L，牛肉膏6 g/L，NaCl 15 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 7.0；1×105Pa滅菌30 min。

1.3.2 培養(yǎng)方法

將斜面保藏菌種活化，將處于對數(shù)期菌種按2%的接種量轉(zhuǎn)接至裝液量為150 mL/500 mL的三角瓶中，于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)32 h。

1.3.3 生淀粉酶粗酶液制備

將上述于25℃、150 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)32 h的發(fā)酵液于4℃、8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。

1.3.4 生淀粉酶酶活測定方法

生淀粉酶酶活測定參照OKOLO B N等[14]的方法。反應(yīng)體系如下：2%的生淀粉溶液2.0 mL加入25 mL具塞比色管，添加pH6.4檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液2mL，30℃預(yù)熱10 min，加入1.0 mL酶液，于30℃恒溫振蕩（180 r/min）反應(yīng)10 min后，加入3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）試劑2 mL終止反應(yīng)；搖勻，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20 mL。以滅活的酶液管作為空白調(diào)零點，在波長520 nm處比色測定吸光度值。生淀粉酶酶活單位定義：在分析條件下，1 min釋放1 μg的還原糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）。還原糖以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用DNS法進(jìn)行測定[15]。

1.3.5 單因素試驗

在發(fā)酵培養(yǎng)基一致的條件下，控制發(fā)酵時間分別為4h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h、42 h、48 h、54 h、66 h，發(fā)酵溫度分別為4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，培養(yǎng)基初始pH分別為3.0、4.0、5.0、5.4、6.0、6.4、7.0、8.0，裝液量分別為75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL、175 mL/250 mL、200 mL/ 250mL，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，測定生淀粉酶活力，研究發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、初始pH、裝液量及接種量對菌株產(chǎn)生淀粉酶的影響[16]。

1.3.6 發(fā)酵條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以生淀粉酶酶活（Y）為響應(yīng)值，選取對其影響顯著的因素以及因素較好的水平區(qū)間，根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)發(fā)酵條件組成。每組試驗重復(fù)3次，結(jié)果取其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

圖1 發(fā)酵時間對酶活的影響Fig.1 Effect of fermentation time on enzyme activity

由圖1可知，發(fā)酵時間在0～24 h時，生淀粉酶活快速增加；發(fā)酵時間在36 h時，酶活達(dá)到最大，為449 U/mL；發(fā)酵時間＞36h之后，生淀粉酶活有所下降。這可能與底物消耗和有害物質(zhì)的積累產(chǎn)生的負(fù)面影響有關(guān)，所以選擇36 h為最優(yōu)發(fā)酵時間。

2.1.2 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶的影響

圖2 發(fā)酵溫度對酶活的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

由圖2可知，發(fā)酵溫度在5～15℃時，生淀粉酶的酶活隨發(fā)酵溫度的升高迅速增加；發(fā)酵溫度在25℃時，其生淀粉酶酶活性最高，為442 U/mL；發(fā)酵溫度＞25℃之后，隨著溫度的增加酶活性開始下降，這主要是由于菌體在溫度過高過低時都不利于其生長及產(chǎn)酶。因此選擇發(fā)酵溫度為25℃。

2.1.3 發(fā)酵初始pH對產(chǎn)酶的影響

由圖3可知，在初始pH值3～5的酸性范圍內(nèi)，酶活性隨初始pH值的增加而增加，但酶活性較低，可能是因為菌株本身不耐酸，也可能是在發(fā)酵過程中其自身也產(chǎn)生酸加劇的酸性環(huán)境導(dǎo)致不利于產(chǎn)酶和酶活性。初始pH值在5～7范圍內(nèi)，酶活性迅速增加；初始pH值為7時，酶活性達(dá)到最大，為437 U/mL；初始pH值＞7之后，隨初始pH的增加酶活降低。因此pH值為7是最優(yōu)發(fā)酵初始pH。

圖3 初始pH對酶活的影響Fig.3 Effect of initial pH on enzyme activity

2.1.4 裝液量對產(chǎn)酶的影響

圖4 裝液量對酶活的影響Fig.4 Effect of loaded volume on enzyme activity

由圖4可知，裝液量為（75～125）mL/500mL時，生淀粉酶酶活隨著裝液量增加而增高；裝液量為125mL/500mL時，發(fā)酵酶活最高，為425U/mL；裝液量＞125mL/500mL之后，通氣量逐漸減少，生淀粉酶酶活呈下降趨勢。因此選擇裝液量為125 mL/500 mL。

2.1.5 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖5 接種量對酶活的影響Fig.5 Effect of inoculum size on enzyme activity

由圖5可知，接種量在接1%～2%的種子液時，酶活隨接種量增加而較快地增加；當(dāng)接種2%～4%種子液時，酶活增加速度相對減慢；當(dāng)接種量達(dá)到4%時，酶活性最大，為424 U/mL；接種量＞4%之后，隨著接種量的增加，酶活緩慢開始下降，可能是因為通氣量和底物等因素的限制，發(fā)酵液中的菌體數(shù)量不宜過多。因此確定4%為最佳發(fā)酵接種量。2.2 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果

響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵工藝是目前優(yōu)化反應(yīng)條件和加工工藝參數(shù)最常用的方法，而且在很多試驗中取得了顯著的效果[17-18]。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用N=8的Plackett-Burman設(shè)計對生淀粉酶發(fā)酵條件中的5個因素的顯著性進(jìn)行考察，試驗因素與水平見表1，設(shè)計及結(jié)果表2，利用Design-Expert V8.0.6軟件進(jìn)行主效應(yīng)分析，結(jié)果見表3。由表3中的P值和貢獻(xiàn)值可見，發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH對酶活貢獻(xiàn)最大，其對酶活的貢獻(xiàn)大小為發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間＞發(fā)酵初始pH，而裝液量和接種量對酶活貢獻(xiàn)相對較小。因此選發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵初始pH為評價因素設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

表1 Plackett-Burman試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

表2 Plackett-Burman試驗結(jié)果Table 2 Results of Plackett-Burman experiments

表3 各因素主效應(yīng)分析Table 3 Main effects analysis of each factor

2.3 最陡爬坡試驗研究最大響應(yīng)區(qū)域

在PB試驗基礎(chǔ)上，將發(fā)酵時間和溫度的值按照步長依次增大，pH按照步長逐步減小進(jìn)行最都爬坡試驗設(shè)計，試驗設(shè)計和結(jié)果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設(shè)計結(jié)果Table 4 Results of the steepest ascent experimental design

由表4可知，第2組試驗，當(dāng)發(fā)酵時間為36 h，發(fā)酵初始pH值為7，發(fā)酵溫度為25℃時，酶活最大。所以選擇以第2組試驗作為中心組合試驗的中心點，進(jìn)行中心組合試驗設(shè)計。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計分析結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken試驗設(shè)計

表5 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

運用Design-Expert V8.0.6軟件，以酶活（Y）為響應(yīng)值，對X1發(fā)酵時間、X2pH和X3發(fā)酵溫度這3個最顯著因素進(jìn)行3因素3水平的中心組合試驗設(shè)計，設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)值見表5。

2.4.2 回歸模型建立與方差分析

運用Design-Expert V8.0.6軟件對中心組合試驗數(shù)據(jù)（見表5）進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表6。對各因素進(jìn)行二次多項式回歸擬合后，得到回歸方程：

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

由表6可知，該回歸模型的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），其自變量X1，X3，X2X3，X12，X22，X32對響應(yīng)值影響顯著（P＜0.05），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項表示所用模型與試驗的擬合程度，該設(shè)計失擬項P值為0.460 8＞0.05，因而無失擬因素存在?；貧w方程的決定系數(shù)R2= 0.989 7＞0.9，校正決定系數(shù)R2（Adj）為0.971 2＞0.9，表明響應(yīng)值變化有98.97%來源于所選變量，說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結(jié)果進(jìn)行初步分析和預(yù)測。

2.5 響應(yīng)面最優(yōu)結(jié)果分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量間的交換作用以及確定最優(yōu)點，通過Design-Expert V8.0.6軟件繪制響應(yīng)面曲線圖進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖6。3組以生淀粉酶酶活為響應(yīng)值的趨勢圖，其等高線圖可直觀反應(yīng)出兩變量交互作用的顯著程度，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形與之相反。圖6A，圖6B等高線均呈橢圓形，表明兩因素交互作用均顯著，圖6C等高線接近圓形，交互作用不顯著；并且發(fā)酵時間與發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間與pH的交互作用最強(qiáng)。

由圖6可知，響應(yīng)值存在最大值，經(jīng)軟件分析獲得酶活預(yù)測值最大時對應(yīng)的發(fā)酵條件為：發(fā)酵時間37.9 h，發(fā)酵溫度25.2℃，pH 7.1，軟件分析預(yù)測最大酶活為450.4U/mL。為方便實際操作，修改最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時間38h，發(fā)酵溫度25℃，pH7，重復(fù)3次驗證試驗，平均酶活為445.2U/mL，與理論值符合良好，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳條件準(zhǔn)確可靠。

圖6 發(fā)酵時間、初始pH與發(fā)酵溫度交互作用對酶活的響應(yīng)曲面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between fermentation time,initial pH and fermentation temperature

3 結(jié)論

以單因素試驗為基礎(chǔ)采用響應(yīng)面法對生淀粉酶菌株ZXS-1發(fā)酵條件進(jìn)行研究，得到最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵時間38h，發(fā)酵溫度25℃，pH7。在此最佳發(fā)酵條件下，生淀粉酶酶活達(dá)到445.2 U/mL，比優(yōu)化之前提高了25.6%。

假單胞桿菌（Pseudomonassp.）ZXS-1最適生長溫度為25℃，根據(jù)MORITA R Y[19]對低溫微生物的定義，該菌株屬于耐冷菌，發(fā)酵粗酶液最適作用溫度為25℃，屬于低溫酶。海洋環(huán)境低溫、高鹽、高壓，菌株ZXS-1與其他國內(nèi)外篩選的生淀粉酶的菌株相比[20]，具有適應(yīng)低溫環(huán)境（25℃），耐鹽性極好，耐高壓等優(yōu)良特征。海洋生淀粉酶對無蒸煮的酒精發(fā)酵和性質(zhì)不穩(wěn)定的多孔淀粉制備更具有優(yōu)勢。因此，對該菌株發(fā)酵條件的研究，可為其進(jìn)一步發(fā)酵放大乃至工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions of marine raw starch amylase strains by response surface method

ZHOU Xinshang1,2,PANG Fei1,2,DOU Shaohua1,2*,REN Nannan1,2,ZHANG Qingfang1,2
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Technology of Marine Microbiological Engineering Research Center,Dalian 116622,China)

Raw starch amylase is an enzyme that catalyzes starch directly,which is widely used in food,industry,medicine and other fields.In this study,the effects of fermentation time,temperature,initial pH,loaded volume and inoculum on the activity of raw starch amylase were researched by single factor experiments.On the basis of this,the fermentation conditions of the marine raw starch amylase strain ZXS-1 were optimized by response surface method.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:fermentation time 38 h,temperature 25℃and initial pH 7.Under the conditions,the activity of raw starch amylase was up to 445.2 U/ml,which was 25.6%higher than that of before the optimization.

raw starch amylase;optimization of fermentation conditions;response surface method

TQ920.6

0254-5071（2017）07-0080-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.018

2016-12-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（No.2014AA093512）；遼寧省自然科學(xué)基金項目（No.2014020134）

周新尚（1990-），男，碩士研究生，研究方向為微生物工程及酶工程。

*通訊作者：竇少華（1979-），男，副教授，博士，研究方向為微生物工程及酶工程。