任藝慈， 劉 潔， 李 茂， 陳 晨，孫小玲

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院，天津 300384)

在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧數(shù)量劇增，作為應(yīng)激反應(yīng)，抗氧化酶活性和抗氧化劑含量會(huì)迅速升高，以清除氧自由基，維持細(xì)胞內(nèi)氧自由基的平衡。植株內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)包括兩類：酶促清除系統(tǒng)和非酶促清除系統(tǒng)，酶促清除系統(tǒng)包括抗氧化酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、過氧化物酶(peroxidase，POD)和抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)等；非酶促系統(tǒng)即抗氧化劑，包括抗壞血酸(ascorbic acid, AsA)、類胡蘿卜素和一些含巰基的低分子化合物，如谷胱甘肽等(reduced glutathione, GSH)。而在長(zhǎng)期或重度的遮陰脅迫條件下，這種平衡會(huì)被破壞，抗氧化酶活性和抗氧化劑含量不再隨著脅迫程度的加重而增加，抗氧化系統(tǒng)清除活性氧的能力下降，導(dǎo)致活性氧積累，對(duì)細(xì)胞造成傷害。如在遮陰初期，Arid3高羊茅(Festucaarundinacea)和沿階草(Ophiopogonjaponicus)體內(nèi)MDA含量和抗氧化酶活性(SOD，POD和CAT)均迅速增加，而隨著遮陰時(shí)間的延長(zhǎng)，抗氧化酶活性則又開始降低[5-6]。經(jīng)過3到4個(gè)月的遮陰脅迫處理后，不同遮陰強(qiáng)度的假儉草(Eremochloaophiuroides)抗氧化酶活性均顯著降低[7-8]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以Spark野牛草和Texoka野牛草為試驗(yàn)材料，種子由北京綠冠集團(tuán)提供。2015年5月14日播種在直徑18 cm，高15 cm的花盆中，基質(zhì)為草炭：蛭石=1:1。2016年3月15日選出長(zhǎng)勢(shì)良好的野牛草進(jìn)行遮陰處理，遮陰梯度包括中光(40%遮陰)、低光 (80%遮陰)以及全光照(無遮陰處理)。試驗(yàn)過程中，定期澆水，保證植物不受水分脅迫。每周澆15 mL的全能Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 (4.373 g NH4NO3·L-1, 2.063 g NaH2PO4·L-1和2.876 g KCl·L-1)，保證植物對(duì)養(yǎng)分的基本需求[12]。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

H2O2含量的測(cè)定參考蔡永萍[13]的方法稍加修改，稱取0.2 g新鮮的野牛草葉片，加入5 mL 4℃預(yù)冷的丙酮和少許石英砂研磨成勻漿，3000 r·min-1離心10 min，取1 mL上清液加入0.1 mL 5%的硫酸鈦和0.2 mL濃氨水，再以3000 r·min-1離心10 min，棄上清液，沉淀加入5 mL 2 mol·L-1的硫酸，待完全溶解后在415 nm下比色。

MDA和AsA含量，以及SOD、POD和CAT 活性的測(cè)定均參考陳建勛和王曉峰[15]的方法并稍加修改。

MDA含量的測(cè)定：稱取0.5 g新鮮葉片，加入2 mL 5%的三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)研磨勻漿，在3000 r·min-1離心10 min，取上清液2 mL(對(duì)照用2 mL蒸餾水)，再加入3 mL 0.5%的硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，混勻后在沸水浴中反應(yīng)30 min，迅速冷卻后離心，取上清液分別于532 nm，600 nm及450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。MDA含量用如下公式計(jì)算：MDA濃度(μmol·L-1)=6.46×(OD532-OD600)-0.56×OD450

AsA含量的測(cè)定：稱取0.5 g新鮮葉片，加入15 mL 5%的TCA研磨勻漿，在15000 r·min-1離心10 min，取上清液定容至5 mL。取上清液0.2 mL，分別加入0.2 mL 150 mmol·L-1的NaH2PO4(pH 7.4)，0.2 mL H2O，混合均勻，1 min后加入0.4 mL 10%的TCA，0.4 mL 44%的H3PO4，0.4 mL 4%的2,2-二聯(lián)吡啶溶液，和0.2 mL 3%的FeCl3。混合后37℃中水浴保溫1 h，最后測(cè)得525 nm處的吸光度值酶液制備：稱取0.5 g葉片加入2.5 mL 50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸緩沖液(含0.1 mmol·L-1EDTA)，冰浴研磨勻漿，4℃ 8000 r·min-1離心20 min，取上清液用于SOD，POD和CAT活性的測(cè)定。

SOD活性測(cè)定：3 mL反應(yīng)體系中含1.5 mL 50 mmol·L-1pH 7.8的磷酸緩沖液，0.3 mL 130 mmol·L-1甲硫氨酸，0.3 mL 750 μmol·L-1氯化硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium, NBT)，0.3 mL 100 μmol·L-1EDTA-Na2，0.3 mL 20 μmol·L-1核黃素，H2O 0.2 mL，最后加入0.1 mL酶液搖勻，在日光燈下反應(yīng)30 min，測(cè)定560 nm處的吸光度值。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示。

POD活性測(cè)定：3 mL反應(yīng)混合液中含0.3%的H2O21 mL， 0.2%愈創(chuàng)木酚0.95 mL，50 mmol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液1 mL, 酶液0.05 mL啟動(dòng)反應(yīng)，記錄1 min內(nèi)470 nm下光吸收值的變化，POD活性單位以每分鐘光密度增加0.01定義為1個(gè)活力單位。

CAT活性測(cè)定：3 mL反應(yīng)混合液中含0.3%的H2O21 mL，H2O 1.95 mL，最后加入0.05 mL酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，記錄3 min內(nèi)240 nm下光吸收值的變化，CAT活性單位以每分鐘光密度減少0.01定義為1個(gè)活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性差異水平P<0.05，所有測(cè)定值均表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。由于該試驗(yàn)持續(xù)了34天，從3月到4月溫度等外部條件變化較大，因此統(tǒng)一以全光照對(duì)照為分母，采用相對(duì)含量、相對(duì)產(chǎn)生速率和相對(duì)活性的表示方法。最后以Sigma Plot 10.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遮蔭脅迫對(duì)兩種野牛草葉片MDA和H2O2的相對(duì)含量及相對(duì)產(chǎn)生速率的影響

MDA是衡量膜脂過氧化損傷的重要指標(biāo)。由圖1可知，在遮陰處理第5天時(shí)，低光處理Texoka和Spark野牛草MDA的相對(duì)含量均迅速增加為對(duì)照的5.17和5.69倍。中光處理的Texoka和Spark野牛草MDA含量分別為對(duì)照的2.71和2.79倍。遮陰處理10天時(shí)，低光和中光處理的Spark野牛草的MDA含量回落至對(duì)照的2.47和1.84倍，之后便無顯著變化；而低光和中光處理的Texoka野牛草在遮陰處理15天后MDA含量又再次達(dá)到一個(gè)新的更高峰，分別為對(duì)照的10倍和4.8倍，遮陰處理20天又回落至對(duì)照的1.83和1.66倍，之后則無顯著變化。

圖1 遮陰脅迫下Texoka和Spark野牛草MDA(A)和H2O2(B)的相對(duì)含量以及的相對(duì)產(chǎn)生速率Fig.1 The relative content of MDA (A) and H2O2 (B), and the relative production rate of (C) in leaves of Texoka and Spark buffalograss under shading stress

2.2 遮蔭脅迫對(duì)兩種野牛草葉片SOD，POD，CAT活性和AsA含量的影響

POD和CAT同為清除H2O2的關(guān)鍵酶。低光和中光處理的Spark野牛草POD的相對(duì)活性在遮陰過程中出現(xiàn)了兩次高峰，第一次是遮陰處理第15天時(shí)，分別為對(duì)照3.91和2.41倍；第二個(gè)高峰出現(xiàn)在遮陰處理第27天時(shí)，峰值不及第一次高峰(圖2)。Texoka野牛草POD的相對(duì)活性第一個(gè)高峰出現(xiàn)的時(shí)間與Spark野牛草相似，低光處理的Texoka野牛草POD的峰值稍高于低光處理的Spark野牛草(圖2)。同SOD相似，Spark野牛草CAT的相對(duì)活性出現(xiàn)高峰的時(shí)間比Texoka野牛草更遲。如圖2所示，低光和中光處理的Texoka野牛草在遮陰處理第10天時(shí)CAT的相對(duì)活性達(dá)到頂峰，分別為對(duì)照的4.12和3.81倍。低光和中光處理的Spark野牛草CAT的相對(duì)活性分別在遮陰處理第15天和20天時(shí)達(dá)到頂峰，分別為對(duì)照的4.94和3.52倍。

圖2 遮陰脅迫下Texoka和Spark野牛草的SOD(A)，POD(B)和CAT(C)的相對(duì)活性及AsA(D)的相對(duì)含量Fig.2 The relative activities of SOD(A), POD(B), CAT(C), and the relative content of AsA (D) in leaves of Texoka and Spark buffalograss under shading stress

3 討論與結(jié)論

3.1 野牛草抗氧化反應(yīng)系統(tǒng)的特點(diǎn)

植物受到逆境脅迫時(shí)，內(nèi)源H2O2含量會(huì)迅速升高，促使植物體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)活性增強(qiáng)以抵御逆境脅迫[16]。在本研究中，低光和中光處理的Spark野牛草H2O2的相對(duì)含量出現(xiàn)高峰的時(shí)間比Texoka野牛草更遲，但峰值更高(圖1B)，這一響應(yīng)與SOD、CAT和AsA的響應(yīng)相似(圖2)，說明在Spark野牛草中H2O2含量的增高有效的促進(jìn)了抗氧化酶(SOD和CAT)活性的增高和抗氧化物(AsA)含量的增加。Spark野牛草H2O2的相對(duì)含量峰值雖然稍高于Texoka野牛草，但H2O2還有一個(gè)作用是需要在生長(zhǎng)素信號(hào)通道和氧化還原作用的信號(hào)通道之間做出靈活的響應(yīng)，因此不能簡(jiǎn)單的以H2O2的濃度判斷植物受脅迫的程度[17]，且有報(bào)道表明，植物可以耐受高濃度的H2O2(102～2×105μmol·L-1)[18]?？梢娭参锟寡趸磻?yīng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)的目的是為了控制細(xì)胞氧化還原電位的狀態(tài)，而不是將H2O2完全清除。

抗氧化酶系統(tǒng)是一個(gè)容易隨外界變化而改變的復(fù)雜系統(tǒng)，一般呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，因?yàn)槌黾?xì)胞的承受能力之后，環(huán)境脅迫的時(shí)間延長(zhǎng)和強(qiáng)度加大造成細(xì)胞膜脂過氧化程度的加深和細(xì)胞傷害增強(qiáng)，影響了細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等物質(zhì)的合成，導(dǎo)致抗氧化酶活性降低[10]。在本研究中其活性變化也是非線性的，除了“先升后降”的變化趨勢(shì)之外，后續(xù)還會(huì)出現(xiàn)幾個(gè)小高峰(圖2A，2B，2C)。這是因?yàn)橹参飳?duì)逆境的應(yīng)答不止包括抗氧化系統(tǒng)，還與植物的其它系統(tǒng)和分子應(yīng)答機(jī)制相關(guān)聯(lián)。如熱休克應(yīng)答對(duì)抗氧化酶的保護(hù)作用，在高溫和重金屬脅迫條件下，熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯增強(qiáng)，作為分子伴侶其可以防止蛋白聚集，對(duì)抗正常的細(xì)胞死亡，因此才會(huì)出現(xiàn)抗氧化酶活性下降又上升的情況[4]。

Spark野牛草POD活性的峰值出現(xiàn)在遮陰處理第15和27天(圖2B)，CAT活性的峰值出現(xiàn)在遮陰處理第15和20天(圖2C)，AsA含量的峰值出現(xiàn)在遮陰處理第15和34天(圖2D)。CAT和POD為清除H2O2的抗氧化酶，而AsA是植物體內(nèi)清除H2O2重要的非酶促系統(tǒng)。在一定強(qiáng)度的環(huán)境脅迫下，這些酶促和非酶促系統(tǒng)之間的互補(bǔ)作用可以保證無論H2O2濃度高低，都可以高效將其清除[19]。

3.2 Spark野牛草的耐陰性優(yōu)于Texoka野牛草

在長(zhǎng)達(dá)34天的遮陰脅迫處理下，Spark野牛草的表現(xiàn)優(yōu)于Texoka野牛草。無論中光還是低光處理，Spark野牛草MDA的相對(duì)含量均較低。如前所述抗氧化系統(tǒng)一般呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，因此可以通過脅迫處理過程中抗氧化酶活性或抗氧化劑含量拐點(diǎn)的脅迫條件推測(cè)植物耐受脅迫的時(shí)間和能力[10]。Spark野牛草SOD，CAT活性和AsA含量最高峰出現(xiàn)的時(shí)間均比Texoka野牛草推遲5～10天，而峰值則高于相同遮陰梯度處理的Texoka野牛草。這些結(jié)果說明Spark野牛草可以通過提高抗氧化酶活性和抗氧化劑含量的方式減少膜脂過氧化的傷害，其耐陰性要優(yōu)于Texoka野牛草。

3.3 Spark野牛草較高的AsA含量幫助其對(duì)抗遮陰脅迫

APX主要存在于葉綠體基質(zhì)中，是清除葉綠體中抗壞血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循環(huán)所產(chǎn)生的H2O2的關(guān)鍵酶。且APX與H2O2的親和力較強(qiáng)，而AsA是APX專一的電子供體。除此之外，AsA還是植物體內(nèi)主要的抗氧化劑，存在于所有組織中，尤其以光合細(xì)胞葉綠體周圍濃度最高。外源AsA可緩解環(huán)境脅迫對(duì)植物的傷害，例如外源AsA可減緩鎘對(duì)蒜(Alliumsatvium)根生長(zhǎng)的毒害[21]。AsA可以自身合成，也可以通過AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)再生。抗壞血酸有3種存在形式，還原型抗壞血酸(AsA)，單脫氫抗壞血酸(monodehydroascorbate, MDHA)和脫氫抗壞血酸(dehydroascorbate, DHA)，但由于DHA不穩(wěn)定，90%以上的抗壞血酸以AsA的形式存在[22]。AsA的氧化還原狀態(tài)反映了植物受脅迫的情況，例如適度的干旱脅迫時(shí)蘋果樹(Malusdomestica)葉片內(nèi)AsA含量升高，而重度的干旱脅迫時(shí)AsA含量下降[23]。低光處理的Texoka野牛草只在遮陰處理第10天時(shí)AsA的相對(duì)含量有一個(gè)高峰，也僅為對(duì)照的5.16倍，此后便降為對(duì)照的1.32倍，且再無顯著的增長(zhǎng)，再次說明低光處理對(duì)Texoka野牛草造成了不可逆轉(zhuǎn)的傷害。低光處理的Spark野牛草在遮陰處理第34天時(shí)AsA含量增長(zhǎng)為對(duì)照的8.28倍(圖2D)，H2O2含量也隨即回落到對(duì)照的1.12倍水平(圖1B)。因此我們認(rèn)為相對(duì)于Texoka野牛草，Spark野牛草中的AsA無論是作為抗氧化劑，還是作為APX的電子供體，維持APX活性，都是清除H2O2的重要物質(zhì)，在保護(hù)膜系統(tǒng)方面起了關(guān)鍵性的作用。