王興達(dá)+曹英昆+霸婉玉+張奇+王小瑞+沈慶洲+張鐵

摘 要：為了研究不同環(huán)境因子對(duì)草履蟲種群生長(zhǎng)的影響，培養(yǎng)出優(yōu)質(zhì)的草履蟲，分別在pH梯度為：6.0、65、7.0、7.5、8.0，光照梯度為：0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx條件下培養(yǎng)草履蟲，結(jié)果表明，小白菜培養(yǎng)液培養(yǎng)草履蟲的最適pH值為7.0，并且相比于弱酸性環(huán)境，草履蟲更適宜在弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)。在光照為0 lx條件下，草履蟲數(shù)量在第4天時(shí)達(dá)到最大值4 073 ind/100 mL，在光照為500～1 500 lx條件下，隨著光照度的增加，草履蟲的種群數(shù)量也隨之增加。

關(guān)鍵詞：草履蟲；pH值；光照；種群密度

1 引言

1.1 研究背景

大草履蟲（Paramecium caudatum）屬原生動(dòng)物門， 纖毛亞門， 纖毛綱，體長(zhǎng)只有80～300 μm，由一個(gè)單細(xì)胞組成，是動(dòng)物學(xué)教學(xué)常用的實(shí)驗(yàn)材料，也是實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的重要材料[1]。它除了應(yīng)激迅速外，還具有分布廣泛，繁殖速度快，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，便于采集培養(yǎng)以及觀察的特點(diǎn)，在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)、仿生學(xué)等研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用， 同時(shí)也是環(huán)境保護(hù)科學(xué)用來(lái)進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)和水質(zhì)凈化的活性生物材料[2～3]。本文旨在探討pH值和光照對(duì)草履蟲種群密度的影響， 從而為實(shí)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)室條件下，短時(shí)間內(nèi)大量培養(yǎng)出純度高、性狀穩(wěn)定的草履蟲，以及為草履蟲在水體環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1.2 研究進(jìn)展

草履蟲是原生動(dòng)物門的代表動(dòng)物，對(duì)其采集、純化及培養(yǎng)方面的研究，隨著科研的進(jìn)步，實(shí)驗(yàn)條件及設(shè)備的改進(jìn)而不斷發(fā)展?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，23～27 ℃時(shí)大草履蟲的分裂生殖最為旺盛，25 ℃為最適溫度，低于10 ℃時(shí)不利于草履蟲的繁殖[4]。當(dāng)培養(yǎng)液酸性較強(qiáng)時(shí)（pH值為3.0和4.0），草履蟲均死亡，草履蟲僅能在弱酸性條件下正常生長(zhǎng)，對(duì)酸的耐受范圍在pH值5.0～7.0。當(dāng)pH值高于9.0時(shí)，草履蟲不能正常生長(zhǎng)，草履蟲只能在弱堿性條件下正常生長(zhǎng)，對(duì)堿的耐受范圍在pH值7.0～9.0。

2 材料及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料燒杯、量筒、0～50 μL移液槍、紗布和皮筋若干、漏斗、載玻片，光學(xué)顯微鏡、電子天平、pH計(jì)、照度計(jì)等；新鮮的小白菜、氫氧化鈉、濃鹽酸等。

2.2 草履蟲的采集和純化

草履蟲通常生活在水流速度不大，深度較淺的水溝、池塘和稻田中， 并且大多積聚在有機(jī)質(zhì)豐富、光線充足的水面附近。當(dāng)水溫在24～27 ℃時(shí)， 繁殖最旺盛， 數(shù)目最多。草履蟲的這些習(xí)性， 是確定采集地點(diǎn)和方法的重要依據(jù)[5]。采集時(shí)到附近的水溝、池塘邊， 選擇沒有污染的地方， 用清潔的大燒杯沿水面采集水樣， 這樣的水中往往含有許多草履蟲，并且在距根部 10 cm處剪下并拔出處于生長(zhǎng)狀態(tài)的蘆葦，拔出時(shí)帶有少量的泥土， 將此蘆葦根部再剪成 2～3 cm小段放于燒杯中，注入清水，放在溫暖明亮處。一周以后， 用顯微鏡檢查可見許多草履蟲。

上述采集到的草履蟲，往往含有許多其它的小型生物以及雜質(zhì)，要想獲得純度較高的草履蟲，就必須經(jīng)過(guò)分離純化。具體采用微量分離法，即用50 μL移液槍吸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的培養(yǎng)液10 μL于干凈載玻片上，在4倍顯微鏡下鏡檢，如發(fā)現(xiàn)草履蟲及其它一些小型生物，將之轉(zhuǎn)吸到另一塊干凈載玻片上，加10 μL小白菜培養(yǎng)液（小白菜培養(yǎng)液制作過(guò)程見2.3）按照1∶1比例稀釋變成20 μL，用移液槍在同一塊載玻片上再將其分成2滴，每滴10 μL，然后鏡檢，將含有草履蟲的那一滴再加10 μL小白菜培養(yǎng)液再次按1∶1比例稀釋變成20 μL，如此重復(fù)稀釋3～5次后，直到在10倍鏡下鏡檢確認(rèn)已無(wú)其他生物為止。最后，將只含有草履蟲的10 μL培養(yǎng)液吸入500 mL小白菜培養(yǎng)液中（在吸取時(shí)注意更換槍頭以免混入其它生物），放于25 ℃光照培養(yǎng)箱中純化培養(yǎng)1周，即可得到濃度較高的草履蟲。若除草履蟲外仍有較多其他生物及雜質(zhì)，可重復(fù)用上述微量分離方法再次進(jìn)行分離純化。

2.3 培養(yǎng)液的制備

本實(shí)驗(yàn)主要采用小白菜培養(yǎng)液，取新鮮潔凈的小白菜，用剪刀剪碎，按照2 g小白菜搭配自來(lái)水1 000 mL的比例， 將小白菜和自來(lái)水放入燒杯中， 加熱煮沸10～15 min，停止加熱。待冷卻至室溫，先后用雙層紗布、濾紙各過(guò)濾一次，以免一些雜質(zhì)混入培養(yǎng)液妨礙草履蟲的計(jì)數(shù)觀察。為了防止空氣中其它原生動(dòng)物的包囊落入以及蚊蟲產(chǎn)卵， 燒杯口要用雙層紗布包好， 然后放置在溫暖明亮處進(jìn)行細(xì)菌繁殖。經(jīng)過(guò)24 h后，小白菜培養(yǎng)液即可用于接種使用。

2.4 接種

接種是指將擴(kuò)大提純后的草履蟲轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)液的過(guò)程。按照上述分離提純時(shí)所用的方法，接種時(shí)， 先將含有草履蟲的液滴吸到干凈的載玻片上，置于低倍顯微鏡下鏡檢， 如果發(fā)現(xiàn)液滴內(nèi)只有草履蟲， 可用移液槍將草履蟲吸入到盛有小白菜培養(yǎng)液的250 mL小燒杯中進(jìn)行繁殖。如果液滴內(nèi)除了草履蟲還有其它小型生物，可按照1∶1比例重復(fù)稀釋3～5次后，直到液滴內(nèi)只含有草履蟲，才可用于接種。

2.5 培養(yǎng)

2.5.1 不同pH梯度下的培養(yǎng)

取100 mL小白菜培養(yǎng)液于250 mL小燒杯中，按以下pH值梯度：5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 （用鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)液到相應(yīng)pH值）， 配制5種培養(yǎng)液， 每種設(shè)3個(gè)重復(fù)組。在每瓶培養(yǎng)液中接種10個(gè)草履蟲， 瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2天開始每隔24 h進(jìn)行取樣計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)完成后調(diào)節(jié)培養(yǎng)液到相應(yīng)的pH值。

2.5.2 不同光照度下的培養(yǎng)

取100 mL小白菜培養(yǎng)液于250 mL小燒杯中，設(shè)置光照梯度分別在0 lx、500 lx、1 000 lx、1 500 lx，每個(gè)光照設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)接種10個(gè)草履蟲，瓶口上方加蓋雙層潔凈紗布，放入25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從第2天開始，每隔24 h進(jìn)行取樣計(jì)數(shù)。

2.6 觀察計(jì)數(shù)

取樣時(shí)，先把小燒杯搖勻，然后隨機(jī)取9份樣液，每份樣液10 μL，滴在干凈的載玻片上，用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，即每次每組pH和光照條件下，同組3瓶各觀察9份樣液，共27份。當(dāng)蟲體數(shù)量較多時(shí)，草履蟲的運(yùn)動(dòng)速度快，不便于計(jì)數(shù)觀察，可采用擦鏡紙纖維阻攔法，在一定程度上限制草履蟲的運(yùn)動(dòng)。擦鏡紙本身呈細(xì)密網(wǎng)絡(luò)狀， 質(zhì)地薄而均勻，能很好地限制草履蟲的運(yùn)動(dòng)， 觀察效果極為理想。方法如下：把擦鏡紙剪成與蓋玻片等大（或略大于蓋玻片）的小方塊， 放在載玻片上， 然后將草履蟲培養(yǎng)液滴到擦鏡紙上（不可太多， 以培養(yǎng)液正好能濕潤(rùn)擦鏡紙為宜）， 然后蓋上蓋玻片觀察[6]。鏡檢所有液滴內(nèi)的蟲數(shù)， 把每一瓶?jī)?nèi)9滴培養(yǎng)液的蟲數(shù)相加即為90 μL的總數(shù)， 然后再計(jì)算出100 mL培養(yǎng)液中草履蟲的個(gè)數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同pH值對(duì)草履蟲種群密度的影響

pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的5組草履蟲的數(shù)量見表1、圖1，其中，pH7.0組草履蟲生長(zhǎng)最好，在第3天種群數(shù)量達(dá)到最大值。第3天后，弱堿性條件下2個(gè)組（pH值分別為7.5和80）草履蟲的種群數(shù)量明顯高于弱酸性條件下2個(gè)組（pH值分別為6.0和6.5）。從第2天開始，5個(gè)組的草履蟲種群密度都在飛速上升，其中以pH值7.0組上升趨勢(shì)最快，第3天達(dá)到最大值5 555 ind/100 mL，由此可知草履蟲生長(zhǎng)所需的最適pH值為7.0。5個(gè)組草履蟲基本上到第2～3天種群密度達(dá)到最大值，弱堿性條件下的2個(gè)組（pH值分別為7.5和8.0）在第2天開始種群增長(zhǎng)速度要高于弱酸性條件下的2個(gè)組（pH值分別為6.0和6.5），并且在以后持續(xù)幾天內(nèi)，數(shù)量變化趨勢(shì)相對(duì)平穩(wěn)，由此可知，草履蟲更適于生長(zhǎng)在中性及弱堿性的水體環(huán)境中。

通過(guò)方差分析可得 pH值為6.0與6.5組間草履蟲的種群密度差異不顯著（P>0.05），但與其它3組差異顯著（P<0.05）；pH值7.0、7.5、80組間差異不顯著（P>0.05），pH值7.0組增長(zhǎng)最快。

3.2 不同光照度對(duì)草履蟲種群密度的影響

草履蟲體內(nèi)不含有葉綠體，不能進(jìn)行光合作用，目前沒有光照與草履蟲種群數(shù)量變化關(guān)系方面的相關(guān)研究。作者認(rèn)為光照可能會(huì)在某一程度上影響草履蟲的晝夜活動(dòng)規(guī)律以及營(yíng)養(yǎng)攝食。本試驗(yàn)中4種不同光照下各組草履蟲的具體統(tǒng)計(jì)數(shù)量及變化見表2、圖2。在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長(zhǎng)勢(shì)良好，從第2天開始草履蟲的種群密度快速上升，并在第5天時(shí)達(dá)到最大值5 184 ind/100 mL。與有光照條件的其它3個(gè)組比較，無(wú)光照條件下的草履蟲生長(zhǎng)狀況良好，并在第5天達(dá)到所有組的最大值，可見，光照的有無(wú)并不是制約草履蟲生長(zhǎng)繁殖的必要條件。在有光照的條件下， 1 500 lx組的草履蟲數(shù)量在第3天為1 581 ind/100 mL，低于其它兩組，但從第3天開始，草履蟲大量分裂生殖，到第4天達(dá)到最大值4 073 ind/100 mL，其后兩天均高于1 000 lx與500 lx 組。1 000 lx組與500 lx組相比無(wú)明顯差異，但在第4天兩組草履蟲數(shù)量都達(dá)到最大值2 962 ind/100 mL以后， 1 000 lx組草履蟲數(shù)量下降趨勢(shì)平穩(wěn)，表明1 000 lx比500 lx更有利于草履蟲生長(zhǎng)，在500～1 500 lx條件下，草履蟲的種群密度隨著光照的增強(qiáng)而增大。

通過(guò)方差分析可得，500 lx、1 000 lx和1 500 lx組間均無(wú)顯著性差異（P>0.05）；0 lx與1 500 lx組間無(wú)顯著性差異（P>0.05），但與其他三組差異顯著（P<0.05）。在弱光條件下（低于1 500lx），草履蟲的種群密度隨光照的增強(qiáng)而增大；0 lx與500 lx，1 000 lx，1 500 lx三組相比差異顯著（P<0.05），在無(wú)光條件（0 lx）下，草履蟲的長(zhǎng)勢(shì)良好，最早達(dá)到最大生長(zhǎng)密度。

4 討論

pH值對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)有很大影響。何新華、張秋平等人在研究pH值對(duì)南美白對(duì)蝦蝦苗成活率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)pH值對(duì)白對(duì)蝦蝦苗影響非常大。水體環(huán)境的pH值為7.0～9.0時(shí)，蝦苗的應(yīng)激性較小，蝦苗的存活率較高，為蝦苗的適宜環(huán)境。在pH值為7.0以下及9.0以上時(shí)，蝦苗的應(yīng)激性非常大，蝦苗不適應(yīng)此環(huán)境[7]。不同動(dòng)植物對(duì)pH值的耐受范圍存在差異。有的生物對(duì)pH值的適應(yīng)范圍非常廣，有的相對(duì)較窄，只適宜生活在特定的酸堿度下。甘志凱、張燕[8]認(rèn)為在相當(dāng)大的pH范圍內(nèi)（5.0～10.0）草履蟲均能正常生長(zhǎng)， 由此可見草履蟲對(duì)酸堿的耐受范圍很大、耐受性較強(qiáng)， 能夠適應(yīng)較為惡劣的生存環(huán)境；黃正一和蔣正揆[9]認(rèn)為草履蟲適宜在微堿性環(huán)境中生長(zhǎng)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明，草履蟲在pH值為7.0的條件下長(zhǎng)勢(shì)最好，并且相對(duì)于弱酸性條件（pH 6.0～7.0），草履蟲更適宜在弱堿性條件（pH 7.0～8.0）下生長(zhǎng)。

在水生動(dòng)物生存的環(huán)境中，光是一個(gè)復(fù)雜的生態(tài)因子，它有多方面的生態(tài)作用，直接或間接地影響動(dòng)物的趨光性、晝夜活動(dòng)節(jié)律、群集活動(dòng)、攝食以及生長(zhǎng)發(fā)育等[10]。草履蟲在數(shù)量較少時(shí)有一定的趨光性，即吸一滴帶有草履蟲的培養(yǎng)液于載玻片上，草履蟲會(huì)趨于水滴向光的邊緣帶運(yùn)動(dòng)。草履蟲體內(nèi)不含有葉綠體，不能進(jìn)行光合作用。作者認(rèn)為光照不是影響草履蟲種群生長(zhǎng)的主要因素，但可能會(huì)在晝夜活動(dòng)節(jié)律以及營(yíng)養(yǎng)攝食等方面起到一些限制作用。所以作者設(shè)置4種光照條件，初步探索光照與草履蟲種群生長(zhǎng)的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在光照為0 lx的條件下，草履蟲的長(zhǎng)勢(shì)良好，在弱光條件下（低于1 500 lx），草履蟲的種群密度隨著光照的增強(qiáng)而增大。

參考文獻(xiàn)：

[1] 袁聿軍.草履蟲的采集、培養(yǎng)與活體觀察方法研究[J].實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2010，13（01）：139-141

[2] 楊春英，李娜.培養(yǎng)液及其濃度和pH值對(duì)草履蟲種群增長(zhǎng)的影響[J].微生物學(xué)雜志，2007， 27（4）：70

[3] Michaela C Strüder-Kypke， André-Denis G Wright， Sergei Fokin， et al.Phylogenetic Relationships of the Genus Paramecium Infered from Small Subunit rRNA Gene Sequences[J] .Molecular Phylogenetics and Evolution， 2000 ， 14（1）：122-130

[4] 許人和.溫度對(duì)大草履蟲（Parameciu mcaudatum Ehrenb.）分裂生殖速率的影響[J].新鄉(xiāng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，1982（03）：111-115

[5] 龔軍輝.草履蟲的采集、培養(yǎng)和觀察方法[J].高等函授學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003， 16（1）：41-43

[6] 張葉軍.草履蟲培養(yǎng)和觀察實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)[J].科技視界，2013，10：132

[7] 何新華，張秋平，潘娟.pH值對(duì)南美白對(duì)蝦蝦苗成活率的影響[J].河北漁業(yè)，2015，12（002）：06

[8] 甘志凱，張燕.實(shí)驗(yàn)草履蟲對(duì)酸堿耐受限度的測(cè)定[J].江西化工，2009，04（001）：131-134

[9] 黃正一，蔣正揆.動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法[M].上?？萍汲霭嫔?，1981：8-10

[10] 舒建英.淺議環(huán)境因子對(duì)水生動(dòng)物的影響[J].寧夏農(nóng)林科技.2009（06）：169-170

（收稿日期：2017-03-01；修回日期：2017-07-04）

Abstract：In order to study the influence of different environmental factors on the paramecium population growth， and provide a theoretical basis for the acquisition paramecium culture and environment monitoring， respectively， at pH gradient： 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0， light gradient： 0 lx， 500 Training under lx， 1 000 lx， 1 500 lx paramecium condition， results showed that cabbage broth culture paramecium optimum pH of 7.0， as compared to the acidic environment， paramecium more suitable for growing in a weak alkaline environment . In the light of the conditions under 0 Lx， Paramecium quantity in 4 days to reach a maximum 4 073 ind/100 mL， in the 500～1 500 lx illu mination conditions， light intensity increases， the number of paramecium population also increases.

Key words：paramecium； pH； light；population density