徐佳+劉瀅+于淼

[摘要] 目的 分析口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗在小鼠腸道局部的表達(dá)情況。方法 用脂質(zhì)體包裹pCDNA3.1+/Ag85A DNA質(zhì)粒制成口服疫苗。對(duì)照組雌性C57BL/6小鼠5只用生理鹽水灌胃，實(shí)驗(yàn)組雌性C57BL/6小鼠5只用脂質(zhì)體包裹的Ag85A DNA疫苗灌胃。共免疫3次，每次間隔14 d。免疫結(jié)束后14 d處死小鼠，取小腸組織固定于4%多聚甲醛中備用。采用免疫熒光和免疫組化方法檢測(cè)兩組小鼠小腸派氏淋巴結(jié)、派氏淋巴結(jié)內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞和小腸黏膜上皮細(xì)胞中Ag85A的表達(dá)情況。結(jié)果 在實(shí)驗(yàn)組小鼠的小腸黏膜上皮細(xì)胞、派氏淋巴結(jié)以及派氏淋巴結(jié)內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞中均檢測(cè)到重組pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的表達(dá)，而且不同部位的小腸黏膜上皮細(xì)胞中Ag85A的表達(dá)強(qiáng)度不同，靠近固有層的小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)Ag85A的表達(dá)強(qiáng)度比靠近腸腔側(cè)的小腸黏膜上皮細(xì)胞高（P<0.05）。在對(duì)照組小鼠上述部位無(wú)重組DNA疫苗的表達(dá)。結(jié)論 脂質(zhì)體包裹的口服DNA疫苗能夠被小鼠腸道吸收，同時(shí)可誘導(dǎo)特異性黏膜免疫反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]Ag85A；DNA疫苗；脂質(zhì)體；上皮細(xì)胞；樹(shù)突狀細(xì)胞；小鼠

[中圖分類(lèi)號(hào)] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）06（c）-0004-04

[Abstract]Objective To analyze the expression of oral pCDNA3.1+/Ag85A DNA vaccine in the intestinal tract of mice.Methods Oral vaccine was made using liposomes to parcel pCDNA3.1+/Ag85A DNA plasmid.5 female C57BL/6 mice in control group were given saline water for gavage while 5 female C57BL/6 mice in experimental group were given liposome encapsulated Ag85A DNA vaccine for gavage.The mice were immunized three times with 14 days interval between each time.In the fourteenth day after immunization，cervical dislocation executed in mice and the small intestine was fixed with 4% paraformaldehyde to be prepared to detect the expression of Ag85A in the intestinal Peyer patches，the dendritic cells in Peyer patches and intestinal epithelial cells with immunofluorescence and immunohistochemistry methods.Results Oral vaccine pCDNA3.1+/Ag85A DNA was expressed in intestinal Peyer patches，the dendritic cells in Peyer patches and the intestinal epithelial cells of mice in the experimental group，and in different parts of the intestinal epithelial cells in mice of the experimental group，the expression intensity of Ag85A was different.The expression intensity of Ag85A was higher near the lamina propria than near the lumen of intestinal epithelial cells （P<0.05）.It was not expressed in above parts of mice in the control group.Conclusion Oral DNA vaccine parceled with liposomes can be absorbed by intestinal tract of mice and induce specific mucosal immune response.

[Key words]Ag85A；DNA vaccine；Liposomes；Epithelial cells；Dendritic cells；Mice

Ag85A是結(jié)核分枝桿菌的一種外分泌蛋白，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，包括體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答?？ń槊纾˙CG）也包含編碼Ag85A的基因。研究表明，裸DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射后，其目的基因表達(dá)在肌細(xì)胞內(nèi)而且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答[1-2]，該裸DNA疫苗經(jīng)肌內(nèi)注射后主要引起Th1免疫應(yīng)答，而經(jīng)基因槍注射后主要引起Th2免疫應(yīng)答，同時(shí)相應(yīng)的抗體產(chǎn)生水平升高[3-4]。然而，目前還沒(méi)有口服DNA疫苗在消化道局部表達(dá)的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗的基因表達(dá)產(chǎn)物在C57BL/6小鼠腸道局部的表達(dá)，為臨床經(jīng)口服用DNA疫苗提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

脂質(zhì)體包裹的口服pCDNA3.1+/Ag85A DNA疫苗為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室制備，其中的LipofectamineTM 2000購(gòu)于Invitrogen公司；6～8周齡的雌性C57BL/6小鼠由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：中科動(dòng)管第005號(hào)；無(wú)內(nèi)毒素超純質(zhì)粒DNA提取、純化試劑盒購(gòu)于Promega公司；Jackson ImmunoResearch Laboratories提供Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG；Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c購(gòu)于BD Pharmingen公司；FITC-goat-anti-chicken IgY和HRP-goat-anti-chicken IgY二抗購(gòu)于Gene公司；chicken anti-Ag85A IgY一抗購(gòu)于Prosci公司；DAB顯色試劑盒和牛血清蛋白（BSA）購(gòu)自北京中杉公司。

1.2疫苗制備

將Ag85A基因序列全長(zhǎng)擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序、同源性分析后，插入pCDNA3.1+真核表達(dá)載體，經(jīng)鑒定正確后轉(zhuǎn)化入DH5α擴(kuò)增，無(wú)內(nèi)毒試劑盒提取、純化質(zhì)粒pCDNA3.1+/Ag85A，灌胃前將脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000與質(zhì)粒充分混勻，4℃靜置20 min，待脂質(zhì)體充分包裹后制成口服DNA疫苗[5]。

1.3動(dòng)物分組及免疫

將10只雌性6～8周齡的C57BL/6小鼠隨機(jī)分成兩組，免疫前2 h禁食水。用7.5% NaHCO3和Hank液按1∶4比例混合制備胃酸中和液，每只鼠灌胃300 μl胃酸中和液中和胃酸，30 min后灌胃免疫。實(shí)驗(yàn)組小鼠灌胃100 μg脂質(zhì)體包裹的重組pCDNA3.1+/Ag85A質(zhì)粒DNA疫苗，對(duì)照組小鼠灌胃等量的生理鹽水。每組小鼠免疫3次，每次間隔14 d[6]。

1.4免疫組化技術(shù)檢測(cè)小鼠腸道局部Ag85A的表達(dá)

在口服疫苗免疫結(jié)束后14 d處死小鼠，PBS沖洗小腸組織，將含有派氏淋巴結(jié)的小腸組織置入4%多聚甲醛備用。標(biāo)本經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋、切片。標(biāo)本經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，加3% H2O2封閉10 min?？乖迯?fù)后用5% BSA封閉。chicken anti-Ag85A IgY（1∶400） 4℃過(guò)夜后再用HRP-goat-anti-chicken IgY（1∶200）37℃孵育30 min。DAB顯色、蘇木精染色、0.5%～1%鹽酸乙醇分化后，再經(jīng)梯度乙醇脫水和二甲苯透明?？贵w孵育、染色等操作后均用PBS洗3次，5 min/次。中性樹(shù)膠封片后用普通光學(xué)顯微鏡觀察Ag85A在小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞、派氏淋巴結(jié)和派氏淋巴結(jié)內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞中的表達(dá)。

1.5免疫熒光技術(shù)檢測(cè)小鼠腸道局部Ag85A的表達(dá)

將4%多聚甲醛固定24 h后的小鼠小腸組織置于30%蔗糖溶液中4℃過(guò)夜，待組織標(biāo)本沉至蔗糖溶液底部后取出，OTC包埋，冰凍切片，厚度約5 μm。晾干后的標(biāo)本分別用3% H2O2和5% BSA 37℃封閉30 min后，同時(shí)加chicken anti-Ag85A IgY一抗（1∶400）和Purified Armenian Hamster-anti-mouse CD11c（1∶20）一抗4℃過(guò)夜，F(xiàn)ITC-goat-anti-chicken IgY二抗（1∶200）和Texas Red conjugated Goat Anti-Armenian Hamster IgG（1∶75）同時(shí)37℃避光孵育30 min，甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察Ag85A在小鼠腸黏膜上皮細(xì)胞、派氏淋巴結(jié)和派氏淋巴結(jié)內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1兩組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞及派氏淋巴結(jié)中Ag85A表達(dá)的比較

免疫組化和免疫熒光結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞和派氏淋巴結(jié)中均有Ag85A廣泛表達(dá)，而對(duì)照組小鼠上述部位無(wú)Ag85A表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)組小鼠不同部位的小腸黏膜上皮細(xì)胞中，Ag85A的表達(dá)強(qiáng)度不同。在相同平均光密度和平均灰度值的條件下，靠近固有層的小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)Ag85A的平均積分光密度為17.4416±5.5412，總平均灰度值為15 167.1800±326.8648，而靠近腸腔側(cè)的小腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)Ag85A的平均積分光密度為7.4114±1.8510（t=3.750，P=0.020），總平均灰度值為7165.3120±158.6779（t=53.369，P=0.000），表明靠近固有層的小腸黏膜上皮細(xì)胞中Ag85A的表達(dá)強(qiáng)度比靠近腸腔側(cè)的小腸黏膜上皮細(xì)胞高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1、2）。

2.2 Ag85A在兩組小鼠小腸派氏淋巴結(jié)內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞中表達(dá)的比較

免疫熒光結(jié)果顯示，Ag85A在實(shí)驗(yàn)組小鼠小腸派氏淋巴結(jié)內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞中也有表達(dá)，但表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量較少，而在對(duì)照組小鼠上述部位無(wú)表達(dá)（圖3）。

3討論

研究表明，DNA疫苗可以用于治療感染、腫瘤和超敏反應(yīng)以及器官移植[7]，而口服疫苗是一種被廣泛接受的給藥方法，具有許多優(yōu)點(diǎn)[8]。腸道是接觸抗原物質(zhì)最多的器官，因此被認(rèn)為是人體最大的免疫器官。腸道相關(guān)淋巴組織，包括腸系膜淋巴結(jié)和派氏淋巴結(jié)，通常被認(rèn)為是發(fā)生免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所，而發(fā)揮免疫效應(yīng)的細(xì)胞則遍布于腸黏膜內(nèi)[9-10]。盡管正常個(gè)體可能會(huì)在腸道甚至在血清中對(duì)這些無(wú)害性抗原產(chǎn)生低水平的抗體反應(yīng)[11]，但是在生理環(huán)境中活躍的T細(xì)胞反應(yīng)通常不會(huì)發(fā)生。在某些病理?xiàng)l件下，上述免疫反應(yīng)可導(dǎo)致腸絞痛和克羅恩病等腸道疾病的發(fā)生[12-13]。腸道對(duì)無(wú)害性抗原的免疫低反應(yīng)狀態(tài)被稱(chēng)為口服耐受。口服耐受在維護(hù)機(jī)體正常生理功能中發(fā)揮重要作用，但也對(duì)口服疫苗的有效性提供了一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。

M細(xì)胞被認(rèn)為是腸道內(nèi)最有效的將抗原從腸腔轉(zhuǎn)運(yùn)到腸道相關(guān)淋巴組織的細(xì)胞[14]，是黏膜疫苗作用的關(guān)鍵，也是很多病毒和細(xì)菌侵入機(jī)體致病的關(guān)鍵[15-16]。研究表明，M 細(xì)胞可以攝取經(jīng)脂質(zhì)體包裹的DNA 疫苗，從而啟動(dòng)腸道黏膜免疫應(yīng)答[5]。還有報(bào)道稱(chēng)小腸黏膜內(nèi)的樹(shù)突狀細(xì)胞也可以攝取抗原物質(zhì)[17-18]。本研究在實(shí)驗(yàn)組小鼠小腸派氏淋巴結(jié)內(nèi)部分樹(shù)突狀細(xì)胞中觀察到了Ag85A DNA疫苗的表達(dá)，而在小腸黏膜內(nèi)樹(shù)突狀細(xì)胞中未見(jiàn)疫苗編碼蛋白的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞和小腸內(nèi)派氏淋巴結(jié)中均有Ag85A的表達(dá)。不同部位的小腸黏膜上皮細(xì)胞中Ag85A的表達(dá)強(qiáng)度不同，靠近固有層的小腸黏膜上皮細(xì)胞比靠近腸腔側(cè)的小腸黏膜上皮細(xì)胞高，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-01-23 本文編輯：許俊琴）