梁澤智++黃潔平

[摘要]目的 探討蟲草素（Cordycepin）對高糖介導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞p38MAPK通路及TGF-β1表達(dá)的影響。方法 體外培養(yǎng)大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞株（NRK52E細(xì)胞株），分為正常對照組（NG組）、高糖組（HG組）、高糖+蟲草素組（HG+C組）。應(yīng)用定量RT-PCR測定NRK52E p38MAPK及TGF-β1 mRNA的表達(dá)；采用Western印跡方法檢測不同時間點(diǎn)p-p38MAPK、TGF-β1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 與NG組比較，HG組NRK52E細(xì)胞的p38MAPK、TGF-β1 mRNA表達(dá)增多（P<0.01）；p-p38MAPK蛋白、TGF-β1蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)趨勢一致（P<0.05）；而蟲草素可以顯著抑制高糖介導(dǎo)的NRK52E細(xì)胞p38MAPK的活化及TGF-β1的表達(dá)。結(jié)論 蟲草素可以抑制高糖介導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞p38MAPK活化及TGF-β1表達(dá)。

[關(guān)鍵詞]p38MAPK；蟲草素；TGF-β1；葡萄糖

[中圖分類號] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）06（b）-0004-04

[Abstract]Objective To investigate effect of cordycepin on p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Methods NRK52E cells were cultured in the mediun with normal glucose concentration （group NG），high glucose concentration （group HG） and high glucose concentration+cordycepin （group HG+C）.The expression of p38MAPK and TGF-β1 mRNA was measured by quantitative RT-PCR；the expression level of p-p38MAPK and TGF-β1 protein was detected by Western blot.Results The p38MAPK and TGF-β1 mRNA in NRK52E cells were highly expressed in group HG compared with group NG （P<0.01）；the tendency of p-p38MAPK and TGF-β1 protein expressed was accordance with expression of mRNA.However，cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.Conclusion Cordycepin can significantly inhibit the activation of p38MAPK pathway and TGF-β1 express in NRK52E cells stimulated by high glucose.

[Key words]P38MAPK；Cordycepin；TGF-β1；Glucose

糖尿病腎?。╠iabetc nephropathy，DN）是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）最常見的原因之一[1]，小管間質(zhì)纖維化是其重要的臨床表現(xiàn)[2]。多種因素參與了糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展[3]，包括高糖、細(xì)胞通路的激活[4]等。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是MAPK家族的一個亞族，可被高糖等因素激活，激活后可通過上調(diào)TGF-β/Smad等多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5]最終導(dǎo)致了腎小球的纖維化[6]。TGF-β1是公認(rèn)的致纖維化因子，在腎纖維化過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1和p38MAPK存在相互串話[7]，共同導(dǎo)致了腎臟的纖維化。蟲草素是中國名貴草藥冬蟲夏草的主要成分之一，在腎臟中具有重要保護(hù)作用，但是機(jī)制尚未明確，本實驗通過體外培養(yǎng)NRK52E細(xì)胞，觀察蟲草素對高糖介導(dǎo)的NRK52E細(xì)胞p38MAPK通路及TGF-β1表達(dá)的影響，探討蟲草素對腎臟保護(hù)作用的機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 NRK52E細(xì)胞（腎小管上皮細(xì)胞，中山大學(xué)余學(xué)清教授惠贈），蟲草素（Sigma公司，貨號：C3394-10MG），葡萄糖（Sigma公司，貨號：G7021-100G），TRizol試劑（Invitrogen公司，貨號：15596026），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（SuperScriptRⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR kits，Invitrogen公司），PCR擴(kuò)增試劑盒（SYBRRSelect Master Mix，Invitrogen公司），胎牛血清（美國Gibco BRL，貨號：16000-044），兔抗大鼠p-p38MAPK多克隆抗體（英國New England Biolabs），小鼠抗大鼠TGF-β1單克隆抗體（美國Abcam）等。

1.1.2儀器設(shè)備 恒溫CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；倒置熒光顯微鏡：美國AXJOVERT公司；PCR擴(kuò)增儀PCT-200：美國Thermo公司；熒光定量PCR儀：Applied Biosystems；超微量分光光度計 NANODROP-2000：美國Thermo公司；顯微鏡及成像系統(tǒng)：OLYMPUS BX51；凝膠成像系統(tǒng)：法國BIO-UISON100；超聲波細(xì)胞粉碎儀：SCIENTZ公司；定量酶標(biāo)儀：美國MRX2；電泳儀：美國Bio-RAD公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用低糖DEME完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁60%～80%，改用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行同步培養(yǎng)，將細(xì)胞按照設(shè)計進(jìn)行分組并加入不同濃度葡萄糖：正常對照組（5.5 mmol/L）、高糖組（30 mmol/L）、高糖+蟲草素組（30 mmol/L，蟲草素濃度10 μg/ml），高糖+蟲草素組使用蟲草素進(jìn)行預(yù)先干預(yù)2 h。

1.2.2 qRT-PCR 待細(xì)胞培養(yǎng)足夠時間，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞的總RNA。然后對RNA進(jìn)行OD值及濃度測定。取1 μg的總RNA按照試劑盒說明書的方法進(jìn)行合成cDNA，然后再對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增。采用primer 5.0軟件設(shè)計目的基因引物序列，由北京華大基因公司合成，所得引物用DEPC水稀釋后放于-20℃?zhèn)溆?，各基因引物序列見?。反應(yīng)體系：SYBR 10 μl；Forward 0.16 μl；Reverse 0.16 μl；ddH2O 4.68 μl；cDNA 5 μl；反應(yīng)條件及步驟：①預(yù)變性：采取95℃進(jìn)行2 min；②變性：95℃的溫度進(jìn)行15 s；③退火：58℃進(jìn)行30 s；④延伸：72℃延伸30 s；⑤循環(huán)：總共經(jīng)過40個循環(huán)，再充分延伸10 min。將所合成的指標(biāo)（p38MAPK、TGF-β1）與內(nèi)參（GAPDH）的Ct值采取取對數(shù)的方式進(jìn)行比較，其比值表示待測指標(biāo)的mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3 Western blot 按設(shè)計分組培養(yǎng)細(xì)胞并加入不同的刺激，15 min、30 min、60 min、12 h、24 h、48 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行超聲破碎，接著采用BCA定量法對蛋白進(jìn)行測定其濃度。采用8% SDS-PAGE分離膠上樣，電泳時先采用80 V，待樣品蛋白到達(dá)分離膠后，改成120 V，繼之在340 mA下轉(zhuǎn)膜2.5～3 h，使用5%脫脂牛奶封閉2 h，一抗采用濃度為：（p-p38MAPK，1∶3000；TGF-β1，1∶2000）過夜，使用脫脂牛奶洗滌加二抗（1∶5000～1∶10 000），暗室曝光、顯影，最后進(jìn)行灰度分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同時間點(diǎn)NRK52E細(xì)胞的p38MAPK mRNA表達(dá)情況

高糖刺激后，不同時間點(diǎn)的p38MAPK mRNA的表達(dá)明顯升高，并且在15 min、24 h兩個時間段出現(xiàn)高峰；高糖+蟲草素組的p38MAPK mRNA表達(dá)較高糖組明顯降低，較正常對照組升高（P<0.01）（圖1）。

2.2不同時間點(diǎn)NRK52E細(xì)胞的TGF-β1 mRNA表達(dá)情況

在高糖的刺激下，不同時間點(diǎn)的TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯升高，并且在呈時間依賴性增加；高糖+蟲草素組的TGF-β1 mRNA較高糖組明顯降低，較正常對照組升高（P<0.01）（圖2）。

2.3不同時間點(diǎn)p38MAPK蛋白的表達(dá)情況

在高糖的刺激下，不同時間點(diǎn)的p-p38MAPK蛋白的表達(dá)明顯升高，并且在15 min、24 h兩個時間段出現(xiàn)高峰；高糖+蟲草素組的p-p38MAPK蛋白表達(dá)較高糖組明顯降低，較正常對照組升高（P<0.01）（圖3）。

2.4不同時間點(diǎn)NRK52E細(xì)胞的TGF-β1蛋白表達(dá)情況

在高糖的刺激下，不同時間點(diǎn)的TGF-β1蛋白的表達(dá)呈時間依賴性地升高；高糖+蟲草素組的TGF-β1蛋白表達(dá)較高糖組明顯降低，較正常對照組明顯升高（P<0.01）（圖4）。

3討論

糖尿病腎病是以腎小球系膜細(xì)胞增殖、肥大以及細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，最終導(dǎo)致腎臟纖維化。多種因素及細(xì)胞通路參與糖尿病腎病腎臟纖維化的發(fā)生及發(fā)展，包括TGF-β/Smad通路、p38MAPK通路[8]等。

TGF-β是公認(rèn)的導(dǎo)致腎臟細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積和纖維化的最重要的因子，在糖尿病腎病患者的發(fā)展中起著核心作用[9]。Zeisberg等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激后，人近端腎小管上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞表型E-cadherin，獲得了肌成纖維細(xì)胞的表型α-SMA，并導(dǎo)致了細(xì)胞外基質(zhì)成分產(chǎn)生增加。有研究表明，在糖尿病腎病中，TGF-β可以通過激活TGF-β依賴的Smad信號通路，也可以激活非TGF-β依賴的信號通路，如p38MAPK，最終促進(jìn)ECM的合成、EMT的發(fā)生[11-12]，最終引發(fā)腎間質(zhì)纖維化。

p38MAPK是各種細(xì)胞外信號刺激細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的共同通路，它可以被多種因素激活。Lv等[13]發(fā)現(xiàn)，高糖能夠?qū)е履I小管上皮細(xì)胞p38MAPK通路的激活，參與了EMT的發(fā)生；在糖尿病腎病中，p38MAPK 的活化可以直接調(diào)節(jié)α-SMA蛋白的合成[14]，同時間接的活化Smad通路，參與了TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生[15]。Tzeng等[16]用乙醇提取的金銀花可以抑制p38 MAPK的活化延緩了STZ誘導(dǎo)的糖尿病腎病的發(fā)生及發(fā)展。

冬蟲夏草是我國傳統(tǒng)的名貴中草藥，具有“益肺腎﹑補(bǔ)精髓”之功效。蟲草素是從其分離出來的單體，是一種核苷類似物。周巧玲等[17-18]的研究發(fā)現(xiàn)，冬蟲夏草可下調(diào)糖尿病腎病腎組織TGF-β1、CTGF及Ⅳ型膠原的表達(dá)，減輕糖尿病腎病腎纖維化。除此外蟲草素還可以抑制嘌呤合成，誘導(dǎo)凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯、減少炎癥介質(zhì)釋放等藥理作用[19-20]。

本實驗研究顯示，高糖介導(dǎo)下，不同時間點(diǎn)的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高，蟲草素干預(yù)后，高糖介導(dǎo)下的p38MAPK、TGF-β1 mRNA及其蛋白高表達(dá)均明顯下調(diào)，提示蟲草素可以抑制高糖介導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞p38MAPK通路活化及TGF-β1表達(dá)。因此，本研究推測，蟲草素可能通過抑制p38MAPK通路活化從而下調(diào)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕糖尿病腎病腎臟纖維化。本研究組下一步將檢測蟲草素對p38MAPK、TGF-β/Smad通路活化后下游相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響，明確蟲草素對糖尿病腎病防治機(jī)制，為糖尿病腎病的治療提供新的認(rèn)識和理論依據(jù)。

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（收稿日期：2017-04-25 本文編輯：任 念）