傅鑫森，李秀華，王凱，霍乃蕊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.陽泉市農(nóng)業(yè)委員會，山西陽泉045000；3.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

高短肽得率羊骨酶解物的制備及其體外抗氧化活性

傅鑫森1，李秀華2，王凱3，霍乃蕊1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，山西太谷030801；2.陽泉市農(nóng)業(yè)委員會，山西陽泉045000；3.山西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801）

以短肽得率為指標，響應面法優(yōu)化羊骨堿性蛋白酶水解工藝，對酶解物的抗氧化活性進行研究，為羊骨的高值利用奠定基礎。結果表明，以所得最優(yōu)工藝即骨粉濃度8.24%，pH值9，加酶量4.35%，46℃水解5 h制備酶解物，短肽得率達71.19%；酶解物對3種自由基的清除率隨濃度的增加而增加，對3種活性氧的清除能力為DPPH·＞O2-·＞·OH；0.3 mg/mL酶解物對DPPH·，O2-·，·OH的清除率分別為46.21%，29.82%和24.16%。由此可見，以最優(yōu)工藝制備的、富含短肽的羊骨堿性蛋白酶解物具有體外抗氧化活性，有望應用于飼料、食品、醫(yī)藥等領域。

羊骨；堿性蛋白酶；活性氧；自由基；抗氧化活性

我國現(xiàn)階段利用羊骨的方式比較單一，食品上主要生產(chǎn)骨蛋白粉、骨精湯料等[1]；在畜牧業(yè)中被加工成骨粉，用于非反芻動物飼料的生產(chǎn)。因此，如何充分利用羊骨資源，提高其經(jīng)濟價值，意義重大。羊骨蛋白質含量約25%，其中90%以上為分子量大于30 kDa、不易被機體直接吸收的膠原蛋白，但經(jīng)酶解制成多肽后，膠原蛋白的營養(yǎng)價值和生理功能顯著提高[2]，具有了抗菌、抗氧化、增強免疫力、防治骨質疏松、抑制血管緊張素轉移酶活性等作用[3-7]。水解羊骨使用的酶有中性蛋白酶[4]、胃蛋白酶[5]和木瓜蛋白酶[6-7]等，關于其他酶種的報道極少。多肽的分子量越小，生理活性越強[8]，而多肽的分子量分布情況又受酶解條件的影響[9]。堿性蛋白酶對羊骨粉的水解效果優(yōu)于中性蛋白酶等其他7種單酶[10]。本研究將以短肽得率為指標，利用響應面分析法優(yōu)化羊骨的堿性蛋白酶水解條件，制備富含膠原短肽的羊骨酶解物，并對其體外抗氧化活性進行研究，旨在為羊骨的高值利用和相關產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

新鮮羊骨經(jīng)高壓、脫脂、干燥、粉碎制成骨粉。堿性蛋白酶（活性≥200 000 U/g）購于太原科谷儀誠商貿(mào)有限公司；2，2-二苯基-1-苦味肼基自由基（DPPH）為Sigma公司產(chǎn)品，硫辛酸（純度99%）購自常熟富士萊醫(yī)藥化工有限公司。三氯乙酸（TCA）、無水乙醇等其他試劑均為分析純。丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器設備

高速萬能粉碎機（廣州雷邁機械）；722G可見分光光度計（上海精密儀器有限公司）；臺式高速冷凍離心機（Neofuge23R，上海力申科學儀器有限公司）等。

1.3 短肽得率的測定

三氯乙酸可溶性氮法（TCA法）：將15%三氯乙酸與酶解液按體積比1∶1混合均勻，靜置10 min，5 000 r/min離心15 min，福林-酚法測定上清液中的可溶性氮含量，短肽得率計算公式如下。

式中，TCA-NSI表示三氯乙酸可溶性氮得率（%）；N1表示在15%TCA中的可溶性氮含量（mg）；N2表示原料中的總氮含量（mg），用凱氏定氮法測定。

1.4 單因素試驗

依次考察骨粉濃度（4%，6%，8%，10%，12%）、溫度（40，45，50，55℃）、加酶量（2%，3%，4%，5%）、酶解時間（3，4，5，6 h）和pH值（8.0，8.5，9.0，9.5，10.0）對短肽得率的影響。首先稱取2，3，4，5，6 g羊骨粉分別與50 mL蒸餾水混合，調節(jié)pH值至8.0，酶添加量為4%，50℃酶解5 h，高溫加熱終止反應，離心，取上清液測定短肽得率。

1.5 響應面分析

利用Box-Behnken實驗設計原理，采用4因素3水平響應面分析法，以短肽得率（Y）為響應值對水解條件進行優(yōu)化。各因素的-1，0，+1水平分別為骨粉濃度（A）6%，8%，10%，溫度（B）40，45，50℃，發(fā)酵時間（C）4，5，6 h，加酶量（D）3%，4%，5%。試驗設計如表1所示。為了驗證試驗的參數(shù)條件水解羊骨粉，酶解液經(jīng)過離心、濃縮后真空冷凍干燥備用。

1.6 體外抗氧化能力測定

1.6.1 DPPH·清除能力用無水乙醇配制0.1 mmol/L的DPPH溶液。試管1中加1.5 mL DPPH溶液和等體積蒸餾水，試管2中加1.5 mL DPPH溶液和等體積酶解液，試管3中加1.5 mL無水乙醇和等體積的酶解物溶液，混合均勻后室溫避光反應30 min，517 nm處測吸光度值。試管1，2，3的讀數(shù)分別記作A0，A1，A2。

1.6.2 ·OH清除能力采用水楊酸法進行測定。試管1中加入等體積（1 mL）的6 mmol/L的FeSO4溶液（A），H2O2溶液（B），水楊酸溶液（C）和蒸餾水；試管2中加入A，B，C和酶解液；試管3加入A，B和蒸餾水、酶解液。試管1，2，3的吸光度值依次記錄為A0，A1和A2。對·OH清除能力的計算公式同公式（2）。

1.6.3 O2-·清除能力其采用鄰苯三酚法進行測定。3支具塞比色管中均加入4.5 mL 0.05 mol/L的Tris-HCl（pH值8.2）和2.0 mL無水乙醇，混勻后25℃水浴20 min。試管1加入0.3 mL經(jīng)過25℃預熱的3 mmol/L鄰苯三酚，試管2同試管1一樣加入鄰苯三酚外，再加入經(jīng)過25℃預熱的0.2 mL酶解物；試管3加入0.2 mL酶解物；每個試管混勻后均置于室溫準確反應4 min，然后立即用1.5 mL的HCl溶液（10 mmol/L）終止反應，于321 nm處測定吸光度值，試管1，2，3的讀數(shù)分別記錄為A0，A1，A2，按照1.6.1中的公式（2）計算清除率。

1.7 統(tǒng)計分析

對響應面試驗中的各組試驗數(shù)據(jù)采用Design-Expert軟件進行回歸擬合分析；抗氧化能力分析中的數(shù)據(jù)均用平均值±標準誤表示，差異顯著性分析使用Statistix 8.1軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

從圖1可以看出，各因素在不同水平下，短肽得率都經(jīng)歷了一個先增加后減少或趨于平緩的過程。pH值、骨粉濃度、溫度、加酶量、酶解時間分別在9，8%，45℃，4%，5 h時短肽得率達到峰值。隨著各因素的逐個優(yōu)化，短肽得率逐步增加，說明工藝還可進一步優(yōu)化。

2.2 響應面試驗結果

對表1中的數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得到回歸方程Y＝＋70.04＋2.90A＋5.47B－0.49C＋3.81D－1.08AB＋4.59AC＋1.94AD＋1.07BC－1.93BD－2.87CD-13.41A2－11.86B2－12.81C2－5.37D2。

表1 堿性蛋白酶水解羊骨的響應面試驗設計及結果

表2 回歸方程的方差分析結果

由表2可知，模型極顯著，失擬項不顯著，表明試驗數(shù)據(jù)與模型的相互擬合程度非常好，可用來進行參數(shù)優(yōu)化、分析和預測堿性蛋白酶水解羊骨粉的工藝。模型的一次項對短肽得率的影響依次為溫度＞加酶量＞骨粉濃度，而酶解時間對短肽得率無影響。說明延長水解時間并不能獲得更多的短肽，這對生產(chǎn)實踐有指導意義。模型的所有二次項對短肽得率影響極顯著，AC項影響顯著，其他不顯著，表明各因素對短肽得率的影響是非線性關系[11]。

回歸模型的相關系數(shù)R2為0.967 3，表明短肽得率的實際值和預測值之間有很好的擬合度，模型調整相關系數(shù)R2adj為0.934 6，因此，模型可以解釋93.46%的響應值變化。說明所建立的二次模型能夠擬合實際的試驗結果，且誤差小。

2.3 響應面分析

根據(jù)2.2中所得的回歸方程，繪制三維曲面及等高線圖（圖2），可見骨粉濃度和溫度、骨粉濃度和水解時間、溫度和水解時間之間的交互對短肽得率的影響表現(xiàn)為先上升后下降；對短肽得率的影響，溫度大于加酶量，加酶量大于骨粉濃度，骨粉濃度大于水解時間；骨粉濃度和水解時間之間的交互作用極顯著，其他交互作用不顯著。

2.4 最優(yōu)參數(shù)及模型驗證試驗

利用Design-Expert軟件計算得到酶解物最佳制備參數(shù)為：骨粉濃度8.24%，溫度45.98℃，加酶量4.35%，水解時間4.97 h，短肽得率的預測值為71.42%。為檢驗響應面法所得結果的可靠性，驗證試驗時將參數(shù)調整為：骨粉濃度8.24%，溫度46℃，水解時間5 h，加酶量4.35%，實際短肽得率為71.19%，與預測值接近，進一步說明該模型可靠。

2.5 體外抗氧化試驗結果

由表3可知，酶解物對·OH，DPPH·和O2-·的清除率隨酶解物質量濃度的增加而增強，呈劑量反應關系，對3種活性氧的清除能力為DPPH·＞O2-·＞·OH。0.3 mg/mL酶解物對DPPH·，O2-·，·OH的清除率分別為46.21%，29.82%和24.16%。

表3 羊骨堿性蛋白酶解物的自由基清除能力

3 討論

蛋白酶種類繁多，酶種不同，作用于肽鍵的專一性不同，得到的多肽生物活性也不相同[12]。山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院畜骨資源利用課題組前期比較了7種蛋白酶對羊骨粉的水解效果，證實堿性蛋白酶水解度最高[13]，詹萍等[14]也研究證實，受試的6種酶中，堿性蛋白酶對羊骨粉的水解度最大。在制備水產(chǎn)品來源的膠原多肽時，研究者們也比較了多種酶的水解活性，均表明堿性蛋白酶是活性很強的酶種[15]，而且堿性蛋白酶水解物的抗氧化能力最強[16-17]。因此，堿性蛋白酶水解羊骨膠原及其他來源的膠原蛋白時，不僅水解度大，且膠原多肽的抗氧化活性等生理活性亦強。

自由基是引起人體衰老和慢性疾病的主要原因之一[18]，對皮膚和骨骼健康產(chǎn)生顯著負面影響[3]。自由基具未配對電子，氧化能力很強。長期高能膳食及高能代謝可使自由基的生成量大于清除量，從而引起氧化應激和氧化損傷。體內(nèi)抗氧化劑的耗竭將進一步導致機體抗氧化能力降低和細胞功能受損，使更多自由基在體內(nèi)積累，造成惡性循環(huán)。

本研究制備的羊骨酶解物對3種活性氧自由基均具有清除能力，該酶解物除具有抗氧化作用外，已經(jīng)證明還具有促進骨生長和抑制骨吸收的作用，可能還有免疫增強作用、神經(jīng)內(nèi)分泌調節(jié)作用，從而對機體的健康具有全面維護作用。

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Preparation and Antioxidative Activity of Sheep Bone Hydrolysate with High Yield of Short Peptides

FUXinsen1，LI Xiuhua2，WANGKai3，HUONairui1
（1.College ofAnimal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Agricultural Committee ofYangquan City，Yangquan 045000，China；3.College ofFood Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Optimizing the sheep bone alcalase hydrolyzing parameters via responsive surface methodology and evaluating the antioxidative activity ofthe resulted enzymatic hydrolysate was carried out in this paper for the future high-value utilization ofsheep bone. The result showed that short peptides obtaining rate reached to 71.19%under the resulted optimized condition,that was,8.24%bone powder,4.35%alcalase,46℃for 5 h at pH 9.In vivo study suggested that the higer concentration of hydrolysates,lipoic acid and Vc, the stronger their ability to scavenge the tested three free radicals.The hydrolysates showed higher efficient in clearing DPPH·than clearing O2-·and·OH.0.3 mg/mLhydrolysates demonstrated 46.21%,29.82%and 24.16%scavenging ability for DPPH·,O2-·and·OH. It can be concluded that the prepared sheep bone hydrolysate riched in short collagen peptides has in vitro antioxidative activity,which can be used in the field offood,feed and medicine industry and other areas.

sheep bone;alcalase;reactive oxygen species;free radical;antioxidative ability

S879.9

：A

：1002-2481（2017）07-1157-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.29

2017-02-15

國家自然科學基金項目（31201347）；山西省回國留學人員科研資助項目（2014-042）

付鑫森（1996-），男，山西太谷人，在讀本科，研究方向：動物檢疫。霍乃蕊為通信作者。