張志強(qiáng)+李思思+李輝+梁魁景+劉言+王婷婷+由明揚(yáng)

摘要：為篩選淀粉酶高產(chǎn)菌株，通過(guò)比較水解圈與菌落的直徑比及3，5-二硝基水楊酸（DNS）顯色法所測(cè)酶活性高低，篩選得到高產(chǎn)淀粉酶能力的菌株WB-4。通過(guò)單因素試驗(yàn)，得到該菌株的最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨。利用Plackett-Burman進(jìn)行顯著因素篩選，發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度為顯著因素。利用響應(yīng)面法對(duì)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，得到菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件為可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，溫度 31.12 ℃，淀粉酶活性 365.12 U/mL，酶活性提高了1.33倍。

關(guān)鍵詞：高產(chǎn)淀粉酶菌株；響應(yīng)面法；Plackett-Burman因素篩選；發(fā)酵條件優(yōu)化；工業(yè)化應(yīng)用

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0221-03

淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一類酶的總稱[1]。淀粉酶來(lái)源極其廣泛，不僅動(dòng)物的唾液、胰臟富含淀粉酶，植物體內(nèi)也含有豐富的淀粉酶，但是，目前商業(yè)化生產(chǎn)的淀粉酶主要由微生物發(fā)酵提煉所得[2]。自從19世紀(jì)初德國(guó)科學(xué)家Kirchhoff發(fā)現(xiàn)淀粉酶以來(lái)，有關(guān)淀粉酶的研究報(bào)道逐年增加，淀粉酶的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。特別是在釀造工業(yè)、紡織、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)保、洗滌劑等方面得到了廣泛的應(yīng)用[3]。近年來(lái)，雖然我國(guó)淀粉酶的品種、產(chǎn)量不斷增加，但是與國(guó)外相比，我國(guó)的淀粉酶品種相對(duì)偏少、產(chǎn)量偏低[4]。為了適應(yīng)經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展對(duì)淀粉酶的需求，本試驗(yàn)對(duì)河北省衡水市周邊采集到的樣品進(jìn)行分離篩選，并利用響應(yīng)面法進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，以期為淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用提供支持。

1材料與方法

1.1樣品

試驗(yàn)所用樣品采集地點(diǎn)為河北省衡水市某面粉廠、某食品加工廠、某學(xué)校食堂。

1.2培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，3 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，2 g/L 可溶性淀粉，20 g/L瓊脂，加蒸餾水至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：除不加瓊脂外，其他成分同篩選培養(yǎng)[LL]基。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選初篩：取1 g不同地點(diǎn)采集的樣品溶解于9 mL滅菌蒸餾水中，然后進(jìn)行梯度稀釋，直到10-7稀釋度為止。取0.1 mL不同稀釋倍數(shù)的樣液涂布到篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)數(shù)天，劃線純化，直到獲得單菌落為止。將得到的單菌落接種到篩選培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，經(jīng)碘液染色后根據(jù)水解圈的大小，初步篩選出產(chǎn)淀粉酶的菌株。

復(fù)篩：將初篩到的菌株接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上，30 ℃、120 r/min搖床培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵液于5 000 r/min離心 10 min，取上清液測(cè)定酶活性，選取酶活性較高的菌株作為試驗(yàn)菌種。

1.3.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.3.2.1單因素試驗(yàn)在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別加入05%不同碳源（麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖、甘油、乳糖）替換其碳源成分，進(jìn)行碳源優(yōu)化試驗(yàn)。在最優(yōu)碳源的基礎(chǔ)上，分別以不同氮源（硝酸銨、尿素、硫酸銨、胰蛋白、牛肉膏、蛋白胨）替換培養(yǎng)基中氮源成分，進(jìn)行氮源優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.2.2篩選顯著因素用Design Expert 7.0軟件中的Plackett-Burman對(duì)可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、牛肉膏含量、溫度、轉(zhuǎn)速、裝液量、初始pH值等7個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，每個(gè)因素分別按低水平（-1）、高水平（+1）進(jìn)行設(shè)計(jì)（表1），

1.3.2.3響應(yīng)面法優(yōu)化以“1.3.2.2”節(jié)篩選到的顯著因素為基礎(chǔ)，利用中心組合設(shè)計(jì)原理，對(duì)選取的顯著因素從5個(gè)水平進(jìn)行考察，確定最優(yōu)條件，并驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。

1.3.3淀粉酶活性測(cè)定淀粉酶活性測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）法[5]。酶活性單位定義：1 U（單位酶活）表示在試驗(yàn)條件下1 min釋放出1 μmol還原糖需要的酶量。

2結(jié)果與分析

2.1菌株的篩選

樣品經(jīng)涂布及多次純化后，將得到的單菌落接種到篩選培養(yǎng)基上，進(jìn)行淀粉酶水解圈試驗(yàn)。經(jīng)初步篩選共有32株菌株產(chǎn)生了透明圈，其中水解圈/菌落直徑比（即D/d值）大于2的菌株共有8株，分別命名為WB-1、WB-2、WB-3、WB-4、WB-5、WB-6、WB-7、WB-8；D/d值最大的為 WB-3，其次為WB-4，再次為WB-2（表2）。因此，初步篩選這3株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

將初篩得到的3個(gè)菌株WB-2、WB-3、WB-4接種到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)一定時(shí)間后，進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果顯示，WB-2、WB-3、WB-4的酶活性分別為126.4、137.3、156.5 U/mL。水解圈的大小在一定程度上可以反映酶活性的高低，但是卻不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱，其原因可能是不同菌株在生長(zhǎng)、產(chǎn)酶速度上存在差異、菌苔的大小及其在平板上的堆積情況存在差異，此外，還有可能是由于固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件存在差異等[6]。因此，在選擇菌株時(shí)不能以水解圈的大小作為唯一標(biāo)準(zhǔn)。雖然WB-4的 D/d 值小于WB-3，本試驗(yàn)綜合考慮水解圈大小及產(chǎn)酶能力的高低，最終選擇WB-4作為目的菌株。

2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1單因素試驗(yàn)用6種不同碳源替換搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定上清液淀粉酶活性。從圖1可以看出，以可溶性淀粉作為碳源時(shí)，酶活性最高，乳糖次之，甘油最低，因此選擇可溶性淀粉作為碳源。

用6種不同氮源替換搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，于 30 ℃、120 r/min培養(yǎng)48 h，測(cè)定上清液淀粉酶活性。從圖2可以看出，以蛋白胨作為氮源時(shí)，淀粉酶活性最高，以牛肉膏作為氮源時(shí)也能取得較好的效果。而以硫酸銨、硝酸銨、尿素等無(wú)機(jī)物質(zhì)作為氮源，產(chǎn)酶效果較差。因此，本試驗(yàn)選擇蛋白胨作為氮源。

2.2.2顯著因素的篩選利用Design Expert 7.0軟件中的Plackett-Burman對(duì)7個(gè)因素進(jìn)行設(shè)計(jì)，具體方案及結(jié)果見(jiàn)表3、表4。一般認(rèn)為P值>F值小于0.05，說(shuō)明該因素為顯著因素。由表4可以看出，可溶性淀粉含量、蛋白胨含量及溫度的P值>F值的值分別為0.006 2、0.046 1、0.015 0，說(shuō)明這3個(gè)因素為顯著因素，因此選擇可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2.4驗(yàn)證模型的可靠性通過(guò)該模型擬合得出生產(chǎn)淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件：可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，溫度31.12 ℃，預(yù)測(cè)最高淀粉酶活性為 371.89 U/mL。在最佳培養(yǎng)條件下得到的淀粉酶活性為 365.12 U/mL，與預(yù)測(cè)的最佳淀粉酶活性相差很小，說(shuō)明該模型可用于淀粉酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。

3結(jié)論

筆者所在課題組對(duì)河北省衡水市周邊采集到的樣品進(jìn)行篩選。在綜合考慮初篩及復(fù)篩的結(jié)果后，決定將WB-4作為

目的菌株進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。對(duì)菌株進(jìn)行單因素優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最優(yōu)碳源為可溶性淀粉，最優(yōu)氮源為蛋白胨。在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用Plackett-Burman確定了可溶性淀粉含量、蛋白胨含量、溫度為顯著因素。利用響應(yīng)面法對(duì)3個(gè)顯著因素進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)分析顯著因素與酶活性之間的關(guān)系，建立了兩者之間的數(shù)學(xué)模型，通過(guò)響應(yīng)面法的分析得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為可溶性淀粉含量18.81 g/L，蛋白胨含量10.02 g/L，培養(yǎng)溫度 31.12 ℃，預(yù)測(cè)最高酶活性為371.89 U/mL，實(shí)測(cè)值為 365.12 U/mL，相差較小，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可信。通過(guò)優(yōu)化使得淀粉酶活性由最初的156.5 U/mL提高到365.12 U/mL，提高了1.33倍，效果明顯，為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用提供了有力的支持。

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[2]易征璇，趙彤，師旋，等. 高溫淀粉酶高產(chǎn)菌株篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2014（7）：240-243.

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江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年第45卷第10期

[SQ*5]

[HT6F]施磊，扶教龍，吳晨奇，等. 產(chǎn)輔酶Q10根瘤土壤桿菌的紫外誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（10）：224-228.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2017.10.062

產(chǎn)輔酶Q10根瘤土壤桿菌的紫外誘變選育及其發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

施磊， 扶教龍， 吳晨奇， 錢(qián)大偉， 徐敏強(qiáng)， 鞠鑫， 李良智

（蘇州科技學(xué)院化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009）

摘要：以根瘤土壤桿菌作為出發(fā)菌株，經(jīng)過(guò)紫外誘變、平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終獲得1株輔酶Q10高產(chǎn)菌株 Q-6，其輔酶Q10產(chǎn)量為11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高92.57%，且其遺傳性穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步研究。然后在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析方法，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到生產(chǎn)輔酶Q10的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方（葡萄糖35.46 g/L、酵母浸膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4·7H2O 0.39 g/L），在此培養(yǎng)基下輔酶Q10產(chǎn)量最高，為1132 mg/L，較單因素試驗(yàn)最高值提高8.53%。

關(guān)鍵詞：根瘤土壤桿菌；輔酶Q10；紫外誘變；響應(yīng)面分析法；發(fā)酵培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)： Q935文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0224-05

輔酶Q10（coenzyme Q10，CoQ10）別稱癸烯醌、泛醌，它是人類生命不可缺少的重要元素之一，能激活人體細(xì)胞，同時(shí)還能提高人體免疫力并增強(qiáng)人體活力，現(xiàn)在醫(yī)學(xué)上廣泛用于心血管系統(tǒng)疾病的治療[1]，除此之外，輔酶Q10還具有抗氧化性、延緩衰老和增強(qiáng)人體活力等功能，所以現(xiàn)在它已經(jīng)在食品和化妝品領(lǐng)域得到大量應(yīng)用。輔酶Q10的制備有化學(xué)法、動(dòng)植物組織提取法和微生物發(fā)酵法3種方法[2-4]。因?yàn)槭褂们?種方法合成輔酶Q10時(shí)的成本較高，并且會(huì)產(chǎn)生光學(xué)異構(gòu)體，生物學(xué)活性也不是很高，所以現(xiàn)在微生物發(fā)酵法被認(rèn)為是最具有前途的一種生產(chǎn)方式。本試驗(yàn)選擇根瘤土壤桿菌為出發(fā)菌株，該菌是目前研究CoQ10生物發(fā)酵法較常用的菌種[5-7]。通過(guò)紫外照射誘導(dǎo)變異和平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩相結(jié)合的方法，以期獲得CoQ10高產(chǎn)菌，為提高CoQ10工業(yè)生產(chǎn)效率打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種與試劑

根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens 1.1701）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），保藏于筆者所在試驗(yàn)室。輔酶Q10標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma 公司），分析純。其他藥品和試劑，均為分析純或化學(xué)純。

1.1.2培養(yǎng)基

（1）平板培養(yǎng)基。葡萄糖5 g/L，酵母膏 5 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（2）斜面培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂20 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（3）種子培養(yǎng)基。葡萄糖10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。（4）發(fā)酵培養(yǎng)基。葡萄糖20 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，Na2HPO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，pH值7.2，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3試驗(yàn)設(shè)備

紫外分光光度計(jì)（UV-2450，日本島津）；可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化器械株式會(huì)社）；恒溫調(diào)速回轉(zhuǎn)式搖床（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；數(shù)顯pH計(jì)（上海天達(dá)儀器有限公司）；生物傳感分析儀等。

1.2方法

1.2.1菌種活化

將保存的原始菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，將接種后的斜面試管置于恒溫培養(yǎng)箱中，30 ℃下培養(yǎng)48 h，之后再進(jìn)行第2、第3次傳代培養(yǎng)，放入冰箱冷藏待用。

1.2.2種子液培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面培養(yǎng)基中接1環(huán)菌種于種子培養(yǎng)基中，將接好種的三角瓶放入搖床中，在30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，種子培養(yǎng)基為250 mL錐形三角瓶中裝入50 mL培養(yǎng)基。

1.2.3搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)是將培養(yǎng)好種子培養(yǎng)液按10%（體積分?jǐn)?shù)）接種量的接入裝有50 mL發(fā)酵液的 250 mL 三角瓶中，在30 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行相關(guān)參數(shù)測(cè)定。

1.2.4皂化法提取輔酶Q10

將菌體移入250 mL磨口錐形瓶?jī)?nèi)，在錐形瓶中加入2.5 g KOH、0.7 g焦性沒(méi)食子酸、19 mL 甲醇、7mL蒸餾水，然后混勻，在90 ℃水浴鍋中回流 30 min，用自來(lái)水迅速冷卻到常溫，倒入分液漏斗中，在分液漏斗中加入40 mL石油醚，劇烈振蕩5 min，進(jìn)行輔酶Q10的萃取，連續(xù)萃取2次，最后把萃取液合并，用蒸餾水洗滌到中性；然后加入5 g無(wú)水硫酸鈉，干燥并使液體澄清；再用50 ℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，并且完全揮發(fā)，再加入5 mL無(wú)水乙醇，放入冰箱中冷凍，使膽固醇等雜質(zhì)析出，過(guò)濾，濾液定容至 10 mL，進(jìn)行測(cè)量。

1.2.5輔酶Q10產(chǎn)量的測(cè)定

參照紫外分光光度法[8]。

1.2.6菌株生長(zhǎng)曲線的繪制

進(jìn)行紫外誘變時(shí)，通常在細(xì)胞對(duì)數(shù)期進(jìn)行紫外照射導(dǎo)致發(fā)生突變的概率較大，因此須要確定出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線。吸取5 mL生理鹽水注入活化好的根瘤土壤桿菌斜面種子中，用竹簽或接種針將菌落刮下，將菌懸液轉(zhuǎn)移至空試管中用振蕩器混勻，從中吸取1 mL菌懸液（按2%接種量）接種到50 mL種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min 條件下?lián)u床培養(yǎng)，每間隔2 h 取9 mL種子液于事先已稱好的10 mL離心管中，于4 000 r/min下離心15 min。洗滌后離心，重復(fù)2次，烘干測(cè)干質(zhì)量，并且計(jì)算菌體濃度。將各時(shí)段的菌體濃度作為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間作為橫坐標(biāo)，繪制出發(fā)菌株的生長(zhǎng)曲線。

1.2.7紫外誘變方法

1.2.7.1菌懸液的制備

取10 mL處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（培養(yǎng)12 h）的發(fā)酵液，加入進(jìn)無(wú)菌離心管中，10 000 r/min下離心20 min，去除上清液，收集菌體，菌體用10 mL生理鹽水洗滌離心3次，然后重新懸于10 mL無(wú)菌生理鹽水中，備用。使用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為“億個(gè)/mL”。

1.2.7.2紫外誘變

開(kāi)啟20 W的紫外線燈預(yù)熱10～15 min，取3 mL制備好的菌懸液，置于1個(gè)直徑為6 cm的空培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放在離紫外燈30 cm的地方，分別振蕩照射0、30、60、90、120、150、180 s，然后在黑暗中分別取0.1 mL處理菌液涂布于平板培養(yǎng)基上，用黑紙包好，30 ℃下倒置培養(yǎng)48 h，計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線。同時(shí)，作對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照組菌懸液不進(jìn)行紫外照射，其他操作相同。致死率[9]計(jì)算公式為：致死率=（對(duì)照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)）/對(duì)照菌落數(shù)×100%。在正式試驗(yàn)時(shí)，選取致死率為80%的處理時(shí)間進(jìn)行誘變，其余操作同上。

1.2.7.3初篩

根據(jù)致死率曲線，將誘變后的菌液涂布于篩選平板培養(yǎng)基上，30 ℃下培養(yǎng)48 h；挑取生長(zhǎng)快、菌落大的單菌落，接入斜面，30 ℃培養(yǎng)48 h，置于4 ℃冰箱保藏，以備復(fù)篩。

1.2.7.4復(fù)篩

將初篩得到的突變株菌株逐個(gè)接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min搖床中培養(yǎng)24 h，然后按10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)72 h，離心收集菌體，利用醇?jí)A皂化法提取輔酶Q10，測(cè)定菌體生物量及輔酶Q10產(chǎn)量。

1.2.7.5突變株穩(wěn)定性試驗(yàn)

利用斜面培劃線接種進(jìn)行傳代試驗(yàn)，30 ℃下培養(yǎng)48 h；分別測(cè)定第2、第4、第6代的輔酶Q10產(chǎn)量，比較其產(chǎn)輔酶Q10的穩(wěn)定性。

1.2.8發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.8.1發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)選擇培養(yǎng)基中對(duì)發(fā)酵影響最大的葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 等4種成分，分別考察其不同濃度對(duì)誘變菌株發(fā)酵產(chǎn)輔酶Q10的影響。其中，葡萄糖濃度為10、20、30、40、50 g/L，酵母膏濃度為5、7.5、10、12.5、15 g/L，Na2HPO4濃度為1.3、1.4、1.5、1.6、1.7 g/L，MgSO4·7H2O濃度為0.3、0.4、0.5、06、0.7 g/L。

1.2.8.2發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的響應(yīng)面分析試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4·7H2O為考察因素，采用Design-Expert軟件[10]中的中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD），設(shè)計(jì)4因素5水平的響應(yīng)面分析[11]試驗(yàn)，其試驗(yàn)因子和編碼水平見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1生長(zhǎng)曲線

從圖1可以看出，出發(fā)菌株在4 h后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18 h 后進(jìn)入穩(wěn)定期。處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞中DNA復(fù)制較為活躍，對(duì)各種理化刺激較為敏感，出現(xiàn)突變的概率較大，因此選取4～18 h的細(xì)菌培養(yǎng)液進(jìn)行紫外誘變出現(xiàn)變異的概率較大。

2.2紫外照射致死率曲線

從圖2可以看出，當(dāng)輻照時(shí)間為120 s時(shí)，約97%的根瘤土壤桿菌致死。這幾年通過(guò)對(duì)紫外線誘變效應(yīng)的研究發(fā)現(xiàn)，提高產(chǎn)量的正向突變較多地出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)突變則較多地出現(xiàn)在偏高的劑量中[12]。因此，本研究選取的誘變劑量為紫外線照射60～90 s，致死率約為70%～83%，此時(shí)發(fā)生正向突變的概率較大。

2.3紫外誘變菌株篩選結(jié)果

將經(jīng)過(guò)紫外誘變[13]處理后的菌懸液直接涂布于平板上，在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，從平板上挑取27株生長(zhǎng)良好的單菌落，對(duì)這27株菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，測(cè)定輔酶Q10產(chǎn)量，篩選結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，有7株突變株輔酶Q10的產(chǎn)量有所提高，正突變率約為26%。其中，6號(hào)突變株Q-6表現(xiàn)最突出，輔酶Q10的產(chǎn)量達(dá)到11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高了9251%，誘變結(jié)果最好，所以選擇突變株Q-6進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性研究。

2.5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.5.1葡萄糖濃度對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖4可以看出，隨葡萄糖濃度的增加，輔酶Q10產(chǎn)量增大，當(dāng)葡萄糖濃度達(dá)到30 g/L時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到最大，為（10.05±0.301 5）g/L；當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)加大時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量反而下降，這可能是由于在發(fā)酵過(guò)程中添加過(guò)多葡萄糖而引起的“葡萄糖效應(yīng)”，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的形成。因此，確定本試驗(yàn)葡萄糖濃度為30 g/L。

2.5.2酵母膏濃度對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖5可以看出，當(dāng)酵母膏濃度低于12.5 g/L時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量不斷增大；當(dāng)酵母膏濃度達(dá)到12.5 g/L時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到最大，產(chǎn)量為（10.42±0.312 6）g/L；當(dāng)葡萄糖濃度繼續(xù)加大時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量反而下降，這可能是由于酵母膏成分復(fù)雜，在發(fā)酵后期底物消耗不完，某些成分抑制菌體生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成。所以，酵母膏濃度定為12.5 g/L。

2.5.3Na2HPO4濃度對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖6可以看出，當(dāng)Na2HPO4濃度為1.6 g/L時(shí)，產(chǎn)量達(dá)到最大，此時(shí)輔酶Q10產(chǎn)量為（10.43±0.312 9）g/L；但繼續(xù)加大Na2HPO4濃度時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量逐漸下降，這表明過(guò)多的Na2HPO4并不利于提高輔酶Q10產(chǎn)量，只有適宜的Na2HPO4濃度才有利于輔酶Q10的形成。所以，在本試驗(yàn)考察范圍內(nèi)，Na2HPO4最佳濃度為1.6 g/L。

2.5.4MgSO4· 7H2O濃度對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量的影響

從圖7可以看出，輔酶Q10產(chǎn)量隨MgSO4·7H2O濃度的升高，先升高后降低，并當(dāng)MgSO4·7H2O濃度達(dá)到0.4 g/L時(shí)，輔酶Q10產(chǎn)量達(dá)到最大，此時(shí)產(chǎn)量為（10.23±0.306 9）g/L。這可能是由于較低濃度的Mg2+能夠促進(jìn)輔酶Q10的形成，而當(dāng)濃度達(dá)到一定高度時(shí)，又會(huì)抑制輔酶Q10的形成。所以，本試驗(yàn)可把MgSO4·7H2O濃度定為0.4 g/L。

2.5.5響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基組成

2.5.5.1模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)單因素結(jié)果，采用Design-Expert軟件對(duì)葡萄糖、酵母膏、Na2HPO4、MgSO4· 7H2O的濃度進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

用Design-Expert軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，可以得到輔酶Q10

[FK（W+45mm][TPSL77.tif]

產(chǎn)量（Y）對(duì)葡萄糖濃度（A）、酵母膏濃度（B）、Na2HPO4濃度（C）、[CM（23*2]MgSO4· 7H2O濃度（D）的回歸方程為：Y=-49.20+

0.50A+2.60B+32.82C+49.17D+5.20AB-0.07AC-003AD+0.29BC-0.23BD-2.67CD-5.50A2-012B2-10.43C2-52.85D2，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果如表4所示。

對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)D（MgSO4· 7H2O濃度），交互項(xiàng)AC、BC對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量影響顯著，平方項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)輔酶Q10產(chǎn)量影響極顯著。模型P值<0.000 1，是極顯著的，而失擬項(xiàng)的P值=0.789 2，是不顯著的，說(shuō)明該方程的擬合度較好；模型的決定系數(shù)R2=0.976 1，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)發(fā)酵培養(yǎng)基組分與輔酶Q10產(chǎn)量的關(guān)系；模型的調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0953 7，表明方程模型可信度較高，能夠較好地描述試驗(yàn)結(jié)果。

2.5.5.2響應(yīng)面優(yōu)化及分析

根據(jù)CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果作出三維響應(yīng)面（圖8至圖13），它們分別反映了葡萄糖濃度（A）、酵母膏濃度（B）、Na2HPO4濃度（C）、MgSO4· 7H2O濃度（D）這4個(gè)因素的兩兩交互作用對(duì)產(chǎn)量的影響。

2.5.5.3優(yōu)化培養(yǎng)基的驗(yàn)證

根據(jù)所得的模型，由響應(yīng)面分析法求得優(yōu)化后4種成分的最佳濃度為：葡萄糖35.46 g/L、酵母膏12.33 g/L、Na2HPO4 1.58 g/L、MgSO4· 7H2O 0.39 g/L，預(yù)測(cè)得到輔酶Q10最高產(chǎn)量為11.28 mg/L。為了證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，按上述最終培養(yǎng)基參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次重復(fù)試驗(yàn)的輔酶Q10產(chǎn)量的平均值為11.32 mg/L，與預(yù)測(cè)值接近，表明模型是可行有效的，具有一定的實(shí)踐價(jià)值。

[BT1-*8][STHZ]3結(jié)論

采用紫外誘變，經(jīng)過(guò)平板初篩和搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，最終獲得1株輔酶Q10高產(chǎn)菌株Q-6，其輔酶Q10產(chǎn)量為11.92 mg/L，較出發(fā)菌株提高92.57%，且其遺傳性穩(wěn)定。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，得到生產(chǎn)輔酶Q10的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖35.46 g/L、酵

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