尹寶重 劉博燕 劉盼 張?jiān)鲁??

摘要：從蘋果樹皮中分離出1株對(duì)蘋果腐爛病病菌具有較好拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌——B5014。該菌株對(duì)腐爛病病菌的抑菌率達(dá)55.59%，顯著高于其他菌株；通過對(duì)菌株B5014發(fā)酵濾液進(jìn)行不同濃度稀釋后發(fā)現(xiàn)，隨著濃度的不斷降低，菌株B5014發(fā)酵濾液對(duì)腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)的抑制率不斷下降；田間試驗(yàn)表明，在接種時(shí)間較短（10 d）時(shí)，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理可以與生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液防效基本持平，但到接種20 d時(shí)，防效低于常規(guī)化學(xué)防治方法。

關(guān)鍵詞：蘋果樹；腐爛??；內(nèi)生細(xì)菌；防效

中圖分類號(hào)： S436.611.1+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0084-02

河北省是我國(guó)最重要的蘋果產(chǎn)區(qū)之一，蘋果樹種植已是當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一。近年來(lái)，隨著氣候、環(huán)境、生產(chǎn)方式的變化，蘋果腐爛病在河北省蘋果種植區(qū)發(fā)生日趨嚴(yán)重，已經(jīng)嚴(yán)重影響到當(dāng)?shù)靥O果產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展[1]?，F(xiàn)階段蘋果腐爛病的防治主要以化學(xué)防治為主，不但污染環(huán)境，而且容易引起農(nóng)藥殘留超標(biāo)，影響果實(shí)品質(zhì)。再加上很多地方對(duì)腐爛病的防治并沒有統(tǒng)一的規(guī)范，隨意加大藥量和用藥頻率的問題突出，導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng)，形成惡性循環(huán)。因此，篩選經(jīng)濟(jì)高效、環(huán)境友好的拮抗菌，對(duì)進(jìn)一步促進(jìn)“低毒高效”的蘋果腐爛病防控模式的構(gòu)建，推進(jìn)河北省草莓產(chǎn)業(yè)良性、健康發(fā)展都具有重要意義。

有關(guān)蘋果腐爛病菌拮抗菌的篩選研究，前人進(jìn)行過一些。比如，高克祥研究表明，內(nèi)生螺旋毛殼菌ND35產(chǎn)生的抗生素能有效抑制蘋果樹腐爛病病菌的生長(zhǎng)，且它產(chǎn)生的發(fā)酵液有助于愈傷組織的形成[2]；原犇犇也證明，灰色鏈霉菌的1個(gè)變種對(duì)蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)有抑制作用[3]；展麗然提出，某些土壤中有一種放線菌，對(duì)腐爛病病菌具有拮抗作用[4]。類似的研究還有很多，但這些技術(shù)的篩選過程都比較長(zhǎng)，而且拮抗效果往往不夠穩(wěn)定。內(nèi)生真菌作為普遍存在于寄主植物中的真菌，能產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，可以起到抵御外來(lái)病原菌入侵的作用。本研究擬通過組織分離法和平板對(duì)峙試驗(yàn)從蘋果樹皮中分離和篩選內(nèi)生細(xì)菌，研究其對(duì)蘋果樹腐爛病病菌的抑菌作用，為蘋果腐爛病生物防治技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化提供新的參考。

1材料與方法

[HTK]1.1供試材料[HT]

（1）供試病原菌：蘋果腐爛病病菌，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

（2）供試植物材料：于2015年12月，從山東省煙臺(tái)市、河北省石家莊市、甘肅省慶陽(yáng)市等地選擇100株10～15年生，腐爛病發(fā)生嚴(yán)重的植株，在它們健康的主干、主枝、側(cè)枝、小枝、木質(zhì)部等部位的樹皮上采集獲得。蘋果品種為富士。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法

1.2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

采用組織分離方法[5]，將采集的樹皮用水洗凈，剪至0.2 cm2左右，用75%乙醇、4%次氯酸鈉充分消毒后，無(wú)菌水清洗。將徹底消毒的樹皮研磨成勻漿，無(wú)菌水稀釋，均勻涂抹在PDA培養(yǎng)基平面上，長(zhǎng)出菌落后采用劃線法純化培養(yǎng)。將純化后獲得的菌株采用對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選，將打好的直徑為4 mm的蘋果樹腐爛病病菌菌餅放于PDA平板2側(cè)，用接菌環(huán)蘸取待測(cè)細(xì)菌懸浮液在平板中央劃線，放于培養(yǎng)箱中27 ℃黑暗培養(yǎng)4 d。統(tǒng)計(jì)抑菌帶寬度，選取抑菌帶最寬的5種細(xì)菌，分別測(cè)量病原菌向拮抗菌方向生長(zhǎng)的長(zhǎng)度和對(duì)照中病原菌生長(zhǎng)的半徑，以抑制率表示拮抗作用，選取抑制率最高的細(xì)菌進(jìn)行室內(nèi)和田間生物測(cè)定。抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.2.2B5014菌株對(duì)蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果

發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果：挑取B5014接入NB液體培養(yǎng)基中，30 ℃搖床培養(yǎng)24 h（濃度約為8×109 CFU/mL），5 000 r、20 min離心2次，收集上清液去除雜菌，得無(wú)菌濾液。在48 ℃下，將無(wú)菌發(fā)酵濾液混入滅菌PDA培養(yǎng)基中，混勻后倒平板。平板中央接種蘋果樹腐爛病病菌菌餅，27 ℃培養(yǎng)48 h后測(cè)量菌落直徑。PDA培養(yǎng)基中，無(wú)菌濾液的最終稀釋倍數(shù)分別為20、100、200、1 000倍，以加滅菌蒸餾水的處理為對(duì)照[6-7]。發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病病菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果：取20 μL病原菌分生孢子懸浮液置于無(wú)菌載玻片上，再量取20 μL上述過濾液滴入載玻片上的分生孢子懸浮液滴中[8]。保濕條件下25 ℃靜置，分別于5、13 h后，以PD培養(yǎng)液作為對(duì)照，觀察病原菌分生孢子萌發(fā)情況。每個(gè)處理4次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.2.3田間防效試驗(yàn)

試驗(yàn)于2012年5月10日在河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果試驗(yàn)基地進(jìn)行，供試樹種為紅富士，樹齡8年，株行距3 m×4 m。土壤pH值為7.2，有機(jī)質(zhì)含量為1.28%，水肥條件良好。選取其中10年生、長(zhǎng)勢(shì)相近的蘋果樹，在主枝上用6 mm打孔器打孔并接種旺盛生長(zhǎng)的鏈格孢屬內(nèi)生真菌菌餅，用保鮮膜包裹保濕，3 d后去掉菌餅，再接種腐爛病菌菌餅，保濕1周后去掉保鮮膜，記作處理A；以80%代森錳鋅800倍液作為對(duì)照處理，在接種腐爛病菌菌柄的部位涂抹80%代森錳鋅800倍液，用量為20 mL/m2，記作處理B；以不接內(nèi)生真菌的處理為空白對(duì)照（CK），每個(gè)處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)8棵樹。記錄蘋果樹腐爛病的發(fā)生情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑面積。發(fā)病率=病株數(shù)/總株數(shù)×100%；病斑面積=1/4×π×長(zhǎng)徑×短徑。

2結(jié)果與分析

2.1內(nèi)生細(xì)菌的分離與篩選

通過對(duì)峙試驗(yàn)的篩選，共獲得125株細(xì)菌，其中抑制率較高的有7種，所選的7種抑菌效果較好菌株的抑菌帶寬度均在12 mm以上（表1）。其中，抑菌帶最寬的是B5014，達(dá) 16.4 mm，顯著高于其他菌株。菌株B5014菌落半徑僅為131 mm，顯著低于其他菌株。從抑制率來(lái)看，所選7個(gè)菌株的抑制率均超過了40%，其中菌株B5014最高，達(dá)5559%，且在0.05水平上顯著高于其他菌株。

2.2內(nèi)生細(xì)菌B5014對(duì)蘋果樹腐爛病病菌的抑菌效果

由表2可知，B5014發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有明顯的抑制效果，且這種抑制效果隨著發(fā)酵濾液濃度的降低而降低。從B5014不同濃度發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病病菌菌絲抑制情況來(lái)看，隨著發(fā)酵濾液濃度降低，腐爛病病菌菌落直徑不斷增大，到稀釋500倍時(shí)，其菌落直徑已達(dá)到23.1 mm，與對(duì)照差異不顯著；稀釋20倍時(shí)，B5014發(fā)酵濾液對(duì)腐爛病病菌菌絲抑制率最高，達(dá) 85.1%，顯著高于其他濃度梯度。從B5014不同濃度發(fā)酵濾液對(duì)蘋果樹腐爛病孢子萌發(fā)情況來(lái)看，稀釋500倍時(shí)，發(fā)酵濾液對(duì)病原菌孢子的抑制作用已經(jīng)很弱，孢子萌發(fā)率已經(jīng)達(dá)到618%，與對(duì)照無(wú)顯著差異。發(fā)酵液稀釋20倍時(shí)，對(duì)病原菌孢子的抑制作用非常強(qiáng)，抑制率為100%，顯著高于其他處理。

2.3內(nèi)生細(xì)菌B5014防治蘋果樹腐爛病的田間試驗(yàn)結(jié)果

表3是內(nèi)生細(xì)菌B5014防治蘋果樹腐爛病的田間藥效試驗(yàn)結(jié)果。由表3可知，在2個(gè)時(shí)間段的觀測(cè)中，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理的病斑面積均顯著低于空白對(duì)照，且接種腐爛病菌10 d時(shí)與80%代森錳鋅800倍液處理差異不顯著。從防效來(lái)看，在接種腐爛病菌10、20 d時(shí)，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理的防效分別可達(dá)79.4%、77.5%。由此可知，在接種時(shí)間較短的時(shí)候，B5014細(xì)菌懸浮液原液處理可以與生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液防效基本持平，但隨著病菌接種時(shí)間的延長(zhǎng)，防效則低于常規(guī)化學(xué)防治方法。[FL）]

3結(jié)論與討論

蘋果樹腐爛病是目前蘋果生產(chǎn)中非常嚴(yán)重的病害之一，針對(duì)腐爛病的防治問題也一直屬于蘋果生產(chǎn)中的熱點(diǎn)問題。但由于目前生產(chǎn)中大量采用化學(xué)方法進(jìn)行防治，導(dǎo)致果實(shí)中農(nóng)藥殘留高，環(huán)境也因此受到很大影響。所以，開發(fā)一些環(huán)境友好型的技術(shù)、方法就成為目前蘋果樹腐爛病防治中的重要研究方向。本研究在蘋果樹皮中篩選出對(duì)蘋果樹腐爛病具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌B5014，經(jīng)過對(duì)它的發(fā)酵濾液進(jìn)行不同濃度梯度稀釋后發(fā)現(xiàn)，不同稀釋倍數(shù)的發(fā)酵濾液對(duì)腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的抑制作用有顯著差異。這為進(jìn)一步研究該菌株的抑菌機(jī)制及作相關(guān)鑒定都提供了一定的參考。同時(shí)，田間試驗(yàn)也表明，應(yīng)用B5014細(xì)菌懸浮液，對(duì)蘋果樹腐爛病的防效比生產(chǎn)中常規(guī)使用的80%代森錳鋅800倍液要低一些。推測(cè)這可能與未將B5014菌株加工成劑型，影響其功能的有效發(fā)揮有關(guān)。因此，接下來(lái)將進(jìn)一步對(duì)B5014的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以使其更好地在蘋果樹腐爛病防治中發(fā)揮功效。

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