黎克純，盧建芳,2,3,*，周菊英,2,3，許海棠,2,3，趙彥芝,2,3

具有菲環(huán)骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯(lián)聚集體

黎克純1，盧建芳1,2,3,*，周菊英1,2,3，許海棠1,2,3，趙彥芝1,2,3

（1.廣西民族大學化學化工學院，廣西 南寧 530006；2.廣西林產(chǎn)化學與工程重點實驗室，廣西 南寧 530006；3.廣西高校協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530006）

用80%異丙醇溶液將淀粉酶沉淀聚集，隨后用戊二醛交聯(lián)制備交聯(lián)淀粉酶聚集體（cross-linked amylase aggregates，CLEAs-A），最后將CLEAs-A共價固定在具有大孔的菲環(huán)骨架的載體上，制備固定化CLEAs-A。探討各種優(yōu)化條件，研究固定化CLEAs-A的酶學性質(zhì)，結(jié)果顯示固定化酶的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性明顯提高，重復反應(yīng)7 批次后，相對活性仍保留63.29%。此外，掃描電子顯微鏡和孔徑測量展現(xiàn)了固定化CLEAs-A的表面和孔徑結(jié)構(gòu)。此法可作為一種通用方法，制備出工業(yè)生產(chǎn)中所需要的具有高生物催化性能的固定化酶。

淀粉酶；交聯(lián)酶淀粉酶聚集體（CLEAs-A）；固定化CLEAs-A；菲環(huán)骨架

固定化酶指在一定的空間范圍內(nèi)起催化作用，并能反復和連續(xù)使用的酶。酶的固定化方法可分為載體固定化和無載體固定化兩類[1-2]。其中載體固定化引入了沒有催化功能的載體（載體約占固定化酶總量的90%～99%），“稀釋”了單位體積的催化活性，酶活性嚴重損失。有些酶運用載體固定，通常酶活性損失超過50%，還有一個顯著的缺陷就是產(chǎn)率低[3-5]。相對載體固定化酶來說，非載體固定化酶技術(shù)尤其是交聯(lián)酶聚集體（cross-linked enzyme aggregates，CLEAs）具有對酶純度要求低、無需載體、酶活性保持率高、操作簡便等優(yōu)點[6-7]，然而，CLEAs本身存在機械強度較差，在反復使用過程中易破碎，造成酶泄漏、回收困難等問題[8-10]。因此，提高固定化酶單位體積活性、機械強度及其操作穩(wěn)定性是當今研究的一個熱點[11-12]。

圖1 固定化CLEAs-A制備過程Fig. 1 Flowchart for the preparation of immobilized CLEAs-A

本研究在CLEAs技術(shù)基礎(chǔ)上進行改進，先將游離淀粉酶通過沉淀劑聚集，再用交聯(lián)劑制成交聯(lián)淀粉酶聚集體（cross-linked amylase aggregates，CLEAs-A），CLEAs-A和菲環(huán)骨架的高分子載體均有—NH2基團，再利用戊二醛的2 個—CHO基團分別與酶和載體的—NH2基團反應(yīng)生成—N=CH—基團，即酶聚集體固定在了載體上（圖1），并對其制備條件、結(jié)構(gòu)特征、酶學性質(zhì)進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淀粉酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸（化學純） 廣東臺山化工廠；可溶性淀粉（分析純） 國藥集團上?；瘜W試劑有限公司；麥芽糖（生物試劑） 上海潤捷化學試劑有限公司；戊二醛（分析純） 天津市大茂化學試劑廠；異丙醇（分析純） 天津市富宇精細化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SYC-15超級恒溫水浴鍋 南京桑力電子設(shè)備廠；SP-752紫外-可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Scientz-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；SUPRA 55 Sapphire場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司；ASAO2010微孔分析儀 美國Micromertics公司。

1.3 方法

1.3.1 CLEAs-A的制備

取2 mL淀粉酶原液（購買后未經(jīng)過任何處理的淀粉酶溶液），置于冰浴中，緩慢加入一定體積的蒸餾水與沉淀劑沉降，酶聚集1 h，8 000 r/min離心20 min，再懸浮于5 mL的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，測定酶聚集體活力，確定聚集條件。

取適當濃度的酶聚集體懸浮液5 mL置于冰水浴中，加入0.05 mol/L CaCl2的溶液若干，以50 r/min的振蕩速率放置1 h，再向其中緩慢滴加一定體積的戊二醛溶液并輕微攪拌，交聯(lián)120 min，6 000 r/min離心10 min，棄去上清液，經(jīng)緩沖液洗滌數(shù)次，得到CLEAs-A[12]，測定酶活力，確定交聯(lián)條件。

1.3.2 固定化CLEAs-A的制備

將1.3.1節(jié)制得的CLEAs-A離心去除上清液，用緩沖液沖洗CLEAs數(shù)次，直到洗液中檢測不到任何的活力，收集沉淀用檸檬酸鈉緩沖液懸浮。加入一定量預處理的具有菲環(huán)結(jié)構(gòu)的松香基樹脂和戊二醛，在0 ℃條件下交聯(lián)2 h，8 000 r/min離心20 min，用10 mL乙醇沖洗2 次，10 mL蒸餾水沖洗2 次，-20 ℃冷凍干燥。

1.3.3 游離酶活力測定

[13]的方法，在1 mL pH 5.6檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入1 mL酶溶液，于（40.0±0.5） ℃恒溫水浴中預熱15 min，加入1 mL 1%淀粉溶液準確反應(yīng)5 min后，迅速加入4 mL 0.4 mol/L NaOH溶液，終止酶反應(yīng)。從混合液中量取2.0 mL溶液，加2.0 mL 3,5-二硝基水楊酸顯色液，顯色反應(yīng)后在波長520 nm處測定吸光度，表示麥芽糖的生成量。用麥芽糖同步作標準曲線，以5 min內(nèi)轉(zhuǎn)化麥芽糖的量表示酶的活力單位/（mg/（mL?5 min））。

1.3.4 固定化酶活力回收率及相對活力測定

參考文獻[13]的方法，分別稱取一定質(zhì)量的固定化淀粉酶于帶過濾膜的反應(yīng)器中，加入檸檬酸鈉緩沖溶液，測定方法與游離酶相同，以1 mg的固定化酶在5 min內(nèi)水解淀粉生成麥芽糖量表示酶活力單位/（mg/（mL?5 min））。固定化酶的活力回收率和相對活力分別按公式（1）、（2）計算。

1.3.5 制備條件的確定

1.3.5.1 交聯(lián)劑濃度對CLEAs的影響

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，聚集3 h。再分別加入不同體積分數(shù)的戊二醛，考察戊二醛體積分數(shù)對CLEAs的酶活力回收率的影響。

1.3.5.2 交聯(lián)時間對CLEAs的影響

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，3 h后加入體積分數(shù)1%的戊二醛，考察不同交聯(lián)時間對CLEAs-A的酶活力回收率的影響。

1.3.5.3 鈣離子濃度對固定化CLEAs-A的影響

向均勻分散淀粉酶聚集體懸浮液中分別加入0.021 8、0.029 2、0.035 3、0.039 6、0.043 8、0.044 7、0.046 4 mol/L CaCl2溶液，50 r/min振蕩1 h，分別測定不同Ca2+濃度下制備的CLEAs-A的酶活力回收率。

1.3.5.4 交聯(lián)劑體積分數(shù)對固定化CLEAs-A的影響

分別選擇0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的交聯(lián)劑（戊二醛），測定戊二醛體積分數(shù)對固定化酶活力的影響。

1.3.5.5 交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響

交聯(lián)時間分別選擇1、2、3、4、5、6 h，考察交聯(lián)時間對固定化酶活力的影響。

1.3.5.6 載體與CLEAs-A質(zhì)量比對固定化酶活力的影響載體與CLEAs-A的質(zhì)量比為0.3∶1、0.8∶1、1.3∶1、1.8∶1，考察其對固定化酶活力的影響。

1.3.6 固定化酶性質(zhì)的測定

1.3.6.1 最適溫度和pH值的測定

分別將固定化酶和游離酶置于30～80 ℃水浴中和pH值為3.0～7.0緩沖溶液中按照1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)進行酶活力檢測。

1.3.6.2 熱穩(wěn)定性的測定

將固定酶和游離酶分別置于60 ℃水浴中，每隔30 min取1 g固定化酶和1 mL游離酶，測其活力。

1.3.6.3 儲存穩(wěn)定性的測定

將固定化酶與游離酶同時放在4 ℃冰箱保存，每隔7 d測定活力，以最高的酶活力為100%。

1.3.6.4 操作穩(wěn)定性的測定

將1 g固定化CLEAs-A放入1 mL pH 7.6的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，于50 ℃恒溫水浴中預熱15 min，加入1%淀粉溶液1 mL準確反應(yīng)5 min后，迅速加入4 mL，0.4 mol/L NaOH溶液，令酶反應(yīng)停止，按1.3.3節(jié)和1.3.4節(jié)方法測定酶活力。考察固定化CLEAs在催化反應(yīng)中的重復使用性。即每次催化完成后，回收固定化酶，用于下一次反應(yīng)，把第1次使用時酶活力定義為100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 聚集條件的確定活力

2.1.1 沉淀劑對CLEAs-A活力的影響

按1.3.1節(jié)的方法，分別加入不同體積分數(shù)的丙酮、硫酸銨、異丙醇、乙醇、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）600聚集酶蛋白，測聚集體的活力和酶活力回收率，結(jié)果見表1。

表1 不同沉淀劑對CLEAs-A活性的影響Table 1 Effects of different precipitators on the activity of CLEAs-A

考察不同沉淀劑對淀粉酶的聚集效果，以最終CLEAs-A酶活力回收率為指標，選擇最優(yōu)沉淀劑。由表1可知，以80%異丙醇為沉淀劑時酶活力回收率最高，為87.61%。通過加入沉淀劑來改變酶溶液或水溶液的靜電參數(shù)，使其形成蛋白質(zhì)沉淀物。這一過程通常伴隨著蛋白質(zhì)分子內(nèi)非共價鍵（如氫鍵）的破壞，造成其空間結(jié)構(gòu)的變形，當這種變形影響到酶分子的活性中心時，酶催化活性降低，表現(xiàn)為完全或部分失活，不同沉淀劑對酶分子三維結(jié)構(gòu)的影響不同，造成的失活程度也有所差異[14-15]。高濃度的沉淀劑能使酶蛋白從溶液中快速聚集并沉淀出來，有助于酶活性中心結(jié)構(gòu)的維持；而濃度越低，聚集沉淀的速率越慢，對酶活性中心的損害就越大。與此同時，沉淀劑濃度過高，也會造成酶空間結(jié)構(gòu)變形，酶活性中心受損，致使酶完全或部分失活[16]。

2.1.2 酶濃度對CLEAs-A活力的影響

以80%異丙醇為沉淀劑，將原酶溶液稀釋不同倍數(shù)，分別考察其對酶活力回收率的影響，結(jié)果見表2。

表2 酶濃度對聚集體活性的影響Table 2 Effects of amylase concentration on the activity of amylase aggregates

由表2可知，將酶溶液稀釋2 倍和原酶液得到的酶活力回收率相差不大，對比原酶液，稀釋后的酶溶液的濃度降低，若要單位體積得到相同的酶活回收率，單位體積原酶液需要更多的沉淀劑，從節(jié)約的角度分析，選用稀釋后的酶溶液更合理。同樣，當沉淀劑量一定時，酶的濃度過大時，酶不能完全沉淀下來，酶活力回收率小，造成浪費。酶濃度過低時，單位量的酶對應(yīng)的沉淀劑量大，沉淀劑沉降酶蛋白分子，這一過程會造成酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，酶分子的活性中心會遭到破壞，酶活力下降。本實驗中酶濃度稀釋2 倍時，酶聚集體酶活力回收率最大。

2.1.3 沉淀時間對CLEAs-A活力的影響

圖2 沉淀時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 2 Effects of aggregation time on the activity of amylase aggregates

將原酶溶液稀釋2 倍，以80%異丙醇為沉淀劑，分別考察沉淀1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h對酶聚集體的酶活力回收率的影響，結(jié)果見圖2。酶蛋白沉淀需要一定的時間，在這個過程中時間越長，沉淀的酶蛋白越多，但與此同時，沉淀劑對酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)又有破壞作用，會引起酶失活，沉淀劑和酶蛋白接觸的時間越長，破壞性越大。由圖2可知，3 h時酶聚集體的酶活力回收率最大。

2.2 交聯(lián)條件的確定

2.2.1 交聯(lián)劑戊二醛體積分數(shù)對CLEAs-A活力的影響

戊二醛與酶分子上的基團發(fā)生化學反應(yīng)時會改變酶的三維空間結(jié)構(gòu)，進而影響到酶的活性中心，使酶活力發(fā)生改變。戊二醛體積分數(shù)較低，酶聚集體交聯(lián)不充分，部分酶聚體重新溶解，活性基團暴露于環(huán)境中，極易受外界因素影響造成酶失活。戊二醛體積分數(shù)過高時，因交聯(lián)劑有更多機會進攻酶的活性位點，也會造成酶活力的降低[17]。由圖3可知，當戊二醛體積分數(shù)為1%時，CLEAs-A的酶活力回收率最大。

圖3 戊二醛體積分數(shù)對CLEAs-A活力的影響Fig. 3 Effect of glutaradehyde concentration on CLEAs-A activity

2.2.2 交聯(lián)時間對CLEAs-A活力的影響

圖4 交聯(lián)時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 4 Effect of cross-linking time on CLEAs-A activity

由圖4可知，5 h前CLEAs-A的酶活力回收率逐漸增加。由于酶聚體與戊二醛發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)需要一定的時間，在這個過程中時間越長交聯(lián)反應(yīng)越徹底，因而交聯(lián)在一起的酶蛋白也越多，酶活力回收率越大。但是，當該反應(yīng)過程超過5 h時，隨著時間的延長，CLEAs-A的酶活力回收率反而降低，由于時間越長過多的戊二醛反而會有更多的機會交聯(lián)酶活性部位致使CLEAs-A活性下降；同時戊二醛不僅是酶的交聯(lián)劑也是一種變性劑，隨著反應(yīng)時間的延長，戊二醛將有更多機會影響酶的活性中心結(jié)構(gòu)，使淀粉酶自身的活性降低。2 個原因共同導致了酶活力回收率的降低[18]。

2.3 固定條件的確定

2.3.1 CaCl2濃度對CLEAs-A活力的影響

圖5 CaCl 2對CLEAs-A活力的影響Fig. 5 Effect of CaCl2 concentration on immobilized CLEAs-A activity

游離淀粉酶生成CLEAs-A后，酶活性基團中的N再與Ca2+發(fā)生配位反應(yīng)。其中Ca2+作為酶活性中心的催化基團起到參與催化反應(yīng)、傳遞電子；連接酶與底物，便于酶與底物作用；穩(wěn)定酶的構(gòu)像；同時可以中和催化反應(yīng)中的陰離子，有效降低反應(yīng)中的靜電斥力的作用。由圖5可知，CaCl2的濃度越低，酶活力回收率越小，是由于低濃度的鈣離子不能激活淀粉酶的活性中心；CaCl2的濃度越高，酶活力回收率也越小，是由于高濃度的鈣離子阻礙酶固定化反應(yīng)的進行，過多的鈣離子周圍形成的電子云團會對酶與底物結(jié)合有影響，同時對酶的結(jié)構(gòu)改變比較大，所以表現(xiàn)為對酶活性有抑制作用[19]。因此當CaCl2的濃度為0.04 mol/L時，交聯(lián)聚集體的酶活力回收率最大。

2.3.2 交聯(lián)劑戊二醛體積分數(shù)對CLEAs-A活力的影響

圖6 戊二醛體積分數(shù)對CLEAs-A活力的影響Fig. 6 Effect of glutaradehyde concentration on immobilized CLEAs-A activity

由圖6可知，隨著戊二醛體積分數(shù)的增加，固定化酶活力先增大后減小，當戊二醛體積分數(shù)為1%時，所得固定化酶活力最高。這是因為交聯(lián)劑濃度較低時，交聯(lián)劑不能將CLEAs-A完全交聯(lián)在載體上，制備的固定化酶活力不高。但是隨著交聯(lián)劑濃度的增大，不僅成功連接了載體與CLEAs-A，而且酶分子內(nèi)部、更多的酶分子與酶分子之間也會發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，因此阻礙了載體與

CLEAs-A的交聯(lián)，使酶活力降低。

2.3.3 交聯(lián)時間對CLEAs-A活力的影響

圖7 交聯(lián)時間對CLEAs-A活力的影響Fig. 7 Effects of cross-linking time on immobilized CLEAs-A activity

由圖7可知，4 h時固定化酶的活力為最大值。這可能是因為固定化時間太短，載體與CLEAs-A結(jié)合還沒有達到飽和狀態(tài)，而固定化時間過長，戊二醛分子將進入酶聚體內(nèi)部并與酶表面基團反應(yīng)，同時，當載體負載的酶量達到過飽和狀態(tài)就加大了CLEAs-A分子之間的擁擠程度，使得它與底物結(jié)合的空間阻礙加大，導致固定化酶活力下降[20-21]。

2.3.4 載體與CLEAs-A質(zhì)量比對固定化酶活力的影響

圖8 CLEAs-A與載體的質(zhì)量比對CLEAs-A活力的影響Fig. 8 Effect of mass ratio of carrier to CLEAs-A on the activity of immobilized CLEAs-A

由圖8可知，當載體與CLEAs-A的質(zhì)量比為1.3∶1時，酶活力回收率最大。當投入過多的交聯(lián)酶時，過多的酶會堆積在載體表面和孔道里將孔道阻塞或封堵，與底物作用不夠充分，此時雖然加入的酶量大但是其酶活力回收率很低，即有效利用的酶量小，不經(jīng)濟環(huán)保[22]。

2.4 固定化酶的性質(zhì)

2.4.1 最適溫度和pH值

圖9 固定化酶和游離酶的最適溫度（a）和pH值（b）Fig. 9 Optimal temperature (a) and pH (b) for free amylase and immobilized CLEAs-A

由圖9a可知，固定化酶的最適溫度比游離酶提高了約10 ℃。可能是因為在較低溫度下，載體沒有舒張開，孔道內(nèi)部酶的活性中心不能完全與底物接觸；而在較高溫度下，CLEAs-A被釋放出；同時載體的框架結(jié)構(gòu)以及酶分子自身的聚集、交聯(lián)可以保護酶分子結(jié)構(gòu)伸展變形，故固定化酶的最適溫度比游離酶的高，耐熱性提高[23]。由圖9b可知，固定酶的最適pH值比游離酶的最適pH值向堿性方向移動1.0 個單位。可能是由于菲環(huán)結(jié)構(gòu)載體上的氨基阻礙氫離子在載體表面及緩沖溶液中的均勻分布，從而使固定化酶和反應(yīng)液之間產(chǎn)生濃度梯度的變化，即酶的微環(huán)境發(fā)生變化，導致最適pH值改變[24]。

圖10 固定化酶和游離酶的熱穩(wěn)定性Fig. 10 Effect of temperature on the activities of free amylase and immobilized CLEAs-A

2.4.2 熱穩(wěn)定性由圖10可知，酶聚集體交聯(lián)以及將其固定在菲環(huán)結(jié)構(gòu)的載體上，都有利于抑制酶分子的折疊和反轉(zhuǎn)，從而減少對酶分子三維結(jié)構(gòu)的破壞作用。增強酶分子結(jié)構(gòu)的剛性，因而抗熱變性能力增加。游離酶在60 ℃條件下保溫，酶活力下降明顯，210 min后殘余活力僅為最初的19.4%。而固定化酶在相同條件下活力下降緩慢，210 min后活力為初始的74%，可見固定化酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.4.3 儲存穩(wěn)定性

圖11 固定化酶和游離酶的儲存穩(wěn)定性Fig. 11 Storage stability of free amylase and immobilized CLEAs-A

由圖11可知，游離酶的活力下降很快，28 d已經(jīng)沒有活性。固定化酶儲存35 d，活力仍保持在63.05%，說明淀粉酶被固定化以后其壽命明顯增長?？赡茉蚴牵?）將CLEAs-A固定在載體上，使酶分子與酶分子多點連接，可防止酶分子伸展變性[25]；2）酶分子交聯(lián)結(jié)合后，由于酶失去了分子間相互作用的機會，從而抑制了酶降解[26]。

2.4.4 操作穩(wěn)定性

由圖12可知，固定化酶連續(xù)使用7 個批次后其相對酶活力仍保持63.29%。固定化酶重要的應(yīng)用優(yōu)勢就是從反應(yīng)媒介中回收方便，重復利用，可以簡化后續(xù)工藝過程，降低耗酶費用。

圖12 固定化酶的操作穩(wěn)定性Fig. 12 Reusability of immobilized CLEAs-A

2.4.5 米氏常數(shù)

米氏常數(shù)表示酶和底物之間的親和能力。配制質(zhì)量分數(shù)分別為1%、2%、3%、4%、5%的底物溶液（可溶性淀粉溶液），同時測定固定化酶與游離酶的活力。以淀粉酶濃度的倒數(shù)（1/S）為橫坐標，以反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/v）為縱坐標，按Linewaver-Burk法作圖求得游離酶的Km為37.2 g/L，固定化酶的Km為44.8 g/L。固定化酶Km偏高可能是由于通過酶分子聚集交聯(lián)，然后再利用戊二醛將其交聯(lián)在具有菲環(huán)骨架的載體上的方法制備固定化酶，酶分子之間高度聚集交聯(lián)，CLEAs-A進入到載體孔徑內(nèi)，不利于底物進出酶的活性作用中心，減弱了其與底物的誘導契合反應(yīng)，親和力降低。

2.4.6 微量熱反應(yīng)

圖13 固定化酶催化反應(yīng)過程中的熱流曲線Fig. 13 Heat flow curve for the catalytic reaction process of immobilized CLEAs-A

298.15 K、pH 6.0條件下，測定固定化酶催化淀粉生成麥芽糖過程中的能量變化。由面積歸一化方法得出每克固定化酶催化反應(yīng)淀粉需吸熱553.819 mJ，由圖13可見，整個催化過程有2 個熱量變化區(qū)域，一個是較強的吸熱區(qū)域，一個是相對較弱的放熱區(qū)域。當固定化酶與底物接觸時，淀粉分子掙脫分子間引力，向固定化酶表面擴散、進出載體孔徑和CLEAs-A內(nèi)部均需要從外界吸收能量轉(zhuǎn)化為動能，而淀粉酶催化淀粉分子轉(zhuǎn)化成麥芽糖，是放熱反應(yīng)[27-28]。歸一化方法外推直線與熱流曲線交叉點為此刻體系吸熱量和放熱量相互抵消。之前放出的熱量數(shù)值上小于吸收的熱量，圖中顯示吸熱峰。此后放出的熱量數(shù)值上大于吸收的熱量，圖中顯示放熱峰。當反應(yīng)達平衡，熱流曲線開始平穩(wěn)，最終得到平穩(wěn)曲線。

2.4.7 物理特性

2.4.7.1 孔徑及比表面積

載體的平均孔徑及比表面積分別為97 nm和3.17 m2/g。同時，固定化酶的平均孔徑減小到32 nm，可能是由于CLEAs-A進入到載體孔道內(nèi)占據(jù)了位置。比表面積增加到3.71 m2/g，可能是因為CLEAs-A尺寸相對較小，但是比表面積大，堆積在載體的表面，增大了固定化酶的比表面積。

2.4.7.2 微球粒徑與粒徑分布

圖14 載體和固定化酶的粒徑分布Fig. 14 Particle size distribution of carrier and immobilized CLEAs-A

任何非均向催化劑在工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用過程中，粒徑大小是一個重要的特性，是因為它能直接影響傳質(zhì)和過濾能力。CLEAs-A的粒徑范圍通常在5～50 μm，由于其相對小的尺寸，批次操作不易過濾[23,29]。由圖14可知，固定化酶的粒徑分布在1 400～4 200 μm，比載體粒徑更大、分布更均一，有利于回收重復使用。

2.4.7.3 掃描電子顯微鏡

圖15 載體（a）和固定化酶（b）的電子顯微鏡圖Fig. 15 SEM images of carrier (a) and immobilized CLEAs-A (b)

由圖15可見，載體表面粗糙，凹凸不平，有大量的孔洞和凹陷，增大了載體的比表面積，有利于酶固定化。相對固定化酶，其表面大部分被CLEAs-A覆蓋，且分布較均勻，表面的孔洞明顯減少，表明通過戊二醛的“手臂”作用將CLEAs-A連接在了載體表面及孔道內(nèi)。由于，酶聚集體粒徑范圍通常在5～50 μm，在這個范圍之內(nèi)粒徑的比表面積較大[30]。通過戊二醛“手臂”將酶聚集體接在載體上，實質(zhì)上是增加了載體的比表面積。

3 結(jié) 論

本研究通過將CLEAs-A固定在具有菲環(huán)結(jié)構(gòu)的載體上，制得固定化CLEAs-A。與游離淀粉酶相比，固定化CLEAs-A顯示出更好的儲存穩(wěn)定性、可重復使用性及耐熱性。此外，粒徑大小、孔隙大小和形態(tài)特征測定結(jié)果表明，固定化CLEAs-A的物理特性發(fā)生了很大的變化，可能促進催化反應(yīng)。研究結(jié)果表明，新開發(fā)的固定化CLEAs-A是一種有效的生物催化劑，同時制備固定化CLEAs-A方法可以作為一般方法，為有效發(fā)展各種基于多孔載體的固定化酶提供借鑒。

參考文獻：

[1] ILLANES A, WILSON L, AGUIRRE C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2009, 157: 98-110. DOI:10.1007/s12010-008-8255-7.

[2] ROESSL U, NAHáLKA J, NIDETZKY B. Carrier-free immobilized enzymes for biocatalysis[J]. Biotechnology Letters, 2010, 32(3): 341-350. DOI:10.1007/s10529-009-0173-4.

[3] TISCHER W, KASCHE V. Immobilized enzymes: crystals or carriers?[J]. Trends in Biotechnology, 1999, 17: 326-327. DOI:10.1016/S0167-7799(99)01322-0.

[4] CAO L Q, van LANGEN L, SHELDON R A. Immobilised enzymes: cartier-bound or carrier-free?[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2003, 14: 387-394. DOI:10.1016/S0958-1669(03)00096-X.

[5] 程仕偉, 王玉芳, 步長平, 等. 交聯(lián)青霉素G?；妇奂w制備及其催化特性研究[J]. 食品與藥品, 2012, 14(2): 77-81.

[6] SHELDON R A. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 92(3): 467-477. DOI:10.1007/ s00253-011-3554-2.

[7] GUPTA M N, RAGHAVA S. Enzyme stabilization via cross-linked enzyme aggregates[J]. Molecular Biology, 2011, 679: 133-145. DOI:10.1007/978-1-60761-895-9-11.

[8] ZHENG J F, CHEN Y, YANG L W, et al. Preparation of cross-linked enzyme aggregates of trehalose synthase via co-aggregation with polyethyleneimine[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 174(6): 2067-2078. DOI:10.1007/s12010-014-1104-y.

[9] JUNG D, PARADISO M, HARTMANN M. Formation of crosslinked glucose oxidase aggregates in mesocellular foams[J]. Journal of Materials Science, 2009, 44: 6747-6753. DOI:10.1007/s10853-009-3917-6.

[10] ZHOU Z, HARTMANN M. Recent progress in biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts[J]. Topics in Catalysis, 2012, 55(16): 1081-1100. DOI:10.1007/s11244-012-9905-0.

[11] HOMAEI A A, SARIRI R, VIANELL F, et al. Enzyme immobilization: an update[J]. Journal of Chemical Biology, 2013, 6(4): 185-205. DOI:10.1007/s12154-013-0102-9.

[12] 李小東. 交聯(lián)淀粉酶聚集體的制備及其在淀粉酒精發(fā)酵中的應(yīng)用研究[D]. 昆明: 云南大學, 2012: 23-26.

[13] 趙亞華, 高向陽. 生物化學實驗技術(shù)教程[M]. 廣州: 華南理工大學出版社, 2008: 49-52.

[14] 陳曉云, 陳穎, 肖辰鵬. 乳化法制備交聯(lián)海藻糖合酶聚集體的研究[J].南開大學學報(自然科學版), 2013(2): 107-112.

[15] 曾偉秀, 田清青, 陳波, 等. 交聯(lián)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶聚集體的制備及性質(zhì)[J]. 應(yīng)用化學, 2013, 30(7): 815-820.

[16] 羅建平, 歐杰, 潘利華. 交聯(lián)β-葡萄糖苷酶聚集體的制備及其性質(zhì)[J].食品科學, 2007, 28(12): 254-257.

[17] CUI J D, SUN L M, LI L L. A simple technique of preparing stable CLEAs of phenylalanine ammonia lyase using co-aggregation with starch and bovine serum albumin[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 170(8): 1827-1837. DOI:10.1007/s12010-013-0317-9.

[18] JIANG Y J, WANG Q, HE Y, et al. Co-aggregation of laccase and nature egg white: a simple method to prepare stable and recyclable biocatalyst[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(5): 2496-2506. DOI:10.1007/s12010-013-0697-x.

[19] 涂楚橋, 梁宏, 王光輝. Hg2+離子與漆樹漆酶相互作用的研究[J].光譜學與光譜分析, 2000, 20(4): 572-574.

[20] 王夢凡, 齊崴, 蘇榮欣, 等. 木瓜蛋白酶交聯(lián)聚體的制備及性質(zhì)[J].高等學?；瘜W學報, 2010, 31(9): 1774-1779.

[21] LIANG G L, LI Z H, WU J M, et al. Functionalization and immobilization of enzymes on functionalized mesoporous molecular sieves SBA-15[J]. Science Technology and Engineering, 2013, 32: 9604-9612.

[22] 王海寧, 張鵬, 陶艷紅, 等. 固定化酶解豬小腸黏膜制備肝素的工藝研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2016(2): 300-306.

[23] HUANG X J, GE D, XU Z K. Preparation and characterization of stable chitosan nanofibrous membrane for lipase immobilization[J]. European Polymer Journal, 2007, 43: 3710-3718. DOI:10.1016/ j.eurpolymj.2007.06.010.

[24] GAO J, WANG Q, JIANG Y J, et al. Formation of nitrile hydratase cross-linked enzyme aggregates in mesoporous onion-like silica: preparation and catalytic properties[J]. Indusrial and Engineering Chemistry Research, 2015, 54: 83-90. DOI:10.1021/ie503018m.

[25] YAN J Y, GUI X H, WANG G L, et al. Improving stability and activity of cross-linked enzyme aggregates based on polyethylenimine in hydrolysis of fish oil for enrichment of polyunsaturated fatty acids[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 166: 925-932. DOI:10.1007/s12010-011-9480-z.

[26] 雷福厚. 功能松香聚合物的合成及應(yīng)用研究[D]. 南京: 南京林業(yè)大學, 2005: 59-60.

[27] 王秀芳, 張洪林, 張剛. 微量熱法研究淀粉酶催化反應(yīng)[J]. 應(yīng)用化學, 2002(8): 812-813.

[28] 陳佳, 李紅梅, 徐斐, 等. 辣根過氧化物酶酶標抗原催化α-萘酚微量熱[J]. 食品科學, 2009, 30(17): 204-207. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2009.17.047.

[29] SHELDON R A. Characteristic features and biotechnological applications of cross-linked enzyme aggregates (CLEAs)[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2011, 92: 467-477. DOI:10.1007/ s00253-011-3554-2.

[30] 張其坤, 康俊清, 楊兵, 等. 可磁力回收Fe3O4納米顆粒負載纖維素酶生物催化劑用于玉米芯降解[J]. 催化學報, 2016(3): 389-397.

Immobilization of Cross-Linked Amylase Aggregates on Polymer Containing Phenanthrene Skeleton

LI Kechun1, LU Jianfang1,2,3,*, ZHOU Juying1,2,3, XU Haitang1,2,3, ZHAO Yanzhi1,2,3
(1. School of Chemistry and Chemical Engineering, Guangxi University for Nationalities, Nanning 530006, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products, Nanning 530006, China; 3. Collaborative Innovation Center in Guangxi, Nanning 530006, China)

Amylase was precipitated with 80% isopropanol followed by cross-linking with glutaraldehyde to obtain crosslinked amylase aggregates (CLEAs-A). Then CLEAs-A was covalently immobilized on a macroporous polymer carrier containing a phenanthrene skeleton to obtain immobilized CLEAs-A. Herein, various process parameters were systematically evaluated. Moreover, the enzymatic properties and physical structure of immobilized CLEAs-A were investigated. The thermal and storage stability were improved remarkably as compared with those of the free amylase. After seventh repeated use, the activity recovery of immobilized CLEAs-A was still as high as 63.29%. Furthermore, scanning electron microscopy and porosity measurements indicated the surface and pore structure of immobilized CLEAs-A. The proposed immobilization strategy would provide a general approach for preparing immobilized enzymes with robust and high bio-catalytic properties for use in industrial production.

amylase; cross-linked amylase aggregates (CLEAs-A); immobilized CLEAs-A; phenanthrene skeleton

10.7506/spkx1002-6630-201714017

Q814.2

A

1002-6630（2017）14-0112-08

黎克純, 盧建芳, 周菊英, 等. 具有菲環(huán)骨架的高分子載體固定淀粉酶交聯(lián)聚集體[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 112-119.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714017. http://www.spkx.net.cn

LI Kechun, LU Jianfang, ZHOU Juying, et al. Immobilization of cross-linked amylase aggregates on polymer containing phenanthrene skeleton[J]. Food Science, 2017, 38(14): 112-119. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714017. http://www.spkx.net.cn

2016-07-01

國家民委項目（14GXZ012）；廣西高?？茖W技術(shù)研究項目（KY2015LX069；KY2015YB080）；

廣西民族大學科研項目（2016MDQN019；2016MDYB025）

黎克純（1984—），男，工程師，碩士，研究方向為天然產(chǎn)物改性及應(yīng)用。E-mail：127606314@qq.com

*通信作者：盧建芳（1979—），女，實驗師，博士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物改性及應(yīng)用。E-mail：18578992008@163.com