張麗麗，范琳琳，聶啟興，黃延盛，張全才，殷軍藝，張 爽，聶少平,*

（1.無限極（營口）有限公司，遼寧 營口 115000；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析

張麗麗1，范琳琳2，聶啟興2，黃延盛1，張全才1，殷軍藝2，張 爽1，聶少平2,*

（1.無限極（營口）有限公司，遼寧 營口 115000；2.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化蝙蝠蛾擬青霉菌絲體多糖的提取工藝，并對提取所得多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步分析。結(jié)果表明：發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取最佳工藝條件為提取溫度98.0 ℃、提取時(shí)間4.5 h、液固比25∶1（mL/g），該條件下多糖得率為9.69%。菌絲體多糖主要由中性糖（84.7%）和糖醛酸（9.5%）組成。采用高效體積排阻色譜、紅外光譜掃描和離子色譜對多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行光譜分析和單糖組成分析，結(jié)果表明該多糖主要為分子質(zhì)量61.6 kD的單一色譜峰且可能呈吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。另外，菌絲體多糖由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，其物質(zhì)的量比為2.5∶31∶36∶1∶15∶4。研究成果可為日后發(fā)酵蟲草菌絲體多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)與活性研究以及產(chǎn)品開發(fā)提供一定理論依據(jù)。

發(fā)酵蟲草菌絲體多糖；提取工藝優(yōu)化；響應(yīng)面；結(jié)構(gòu)分析

冬蟲夏草是指包括冬蟲夏草在內(nèi)廣義的蟲草屬真菌的總稱，為麥角菌科蟲草屬的藥用真菌。近代研究表明冬蟲夏草具有抗腫瘤、降血壓、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等諸多藥用價(jià)值[1-4]，素與人參、鹿茸齊名，享有“東方傳奇式珍寶”的美稱，它也是中國中草藥在世界范圍內(nèi)最具影響力的神奇中藥之一[5-7]。

由于冬蟲夏草極高的藥用價(jià)值以及對生長環(huán)境的苛求，天然蟲草的產(chǎn)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們的需求，而發(fā)酵蟲草菌絲體的研究與開發(fā)則成為解決此問題的有效途徑。蝙蝠蛾擬青霉是蟲草中的一種常見內(nèi)寄生真菌，通過深層發(fā)酵，可獲得蝙蝠蛾擬青霉菌絲體。研究表明，蝙蝠蛾擬青霉菌絲體具有相當(dāng)天然蟲草的活性功能[8-10]。與天然蟲草相比，人工發(fā)酵蟲草菌粉的主要活性物質(zhì)（如氨基酸、核苷類、蟲草素、多糖等）與天然蟲草在種類上基本一致，但含量和總量上有差異[11-12]。蟲草多糖作為冬蟲夏草中最主要的活性成分之一，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤以及降血糖等功效[2,12-13]，然而，由于來源和發(fā)酵批次不同，菌絲體多糖的結(jié)構(gòu)也有很大差異，因此相應(yīng)的結(jié)構(gòu)分析也是多糖活性研究過程中重要的理論基礎(chǔ)[14-15]。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以發(fā)酵蟲草菌絲體多糖得率為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面分析法對發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論參考。同時(shí)進(jìn)一步對多糖進(jìn)行分子質(zhì)量、單糖組成和紅外光譜等理化性質(zhì)和組成成分分析，為發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝙蝠蛾擬青霉菌絲體粉由無限極中國有限公司提供。

單糖標(biāo)準(zhǔn)巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸（均為分析純）、溴化鉀（光譜純） 美國Sigma公司；氫氧化鈉、醋酸鈉 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀（配備紫外檢測器、示差檢測器） 美國Agilent科技有限公司；Dionex ICS-5000離子交換色譜儀（配備積分脈沖安培檢測器） 美國Dionex公司；高效體積排阻色譜（high performance size exclusion chromatography，HPSEC）儀（配備示差檢測器、黏度監(jiān)測器、多角度激光光散射檢測器） 美國Wyatt技術(shù)公司；XS-105電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；Nicolet 5700紅外光譜儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蟲草菌絲體多糖提取工藝流程

稱取1 g干燥的蟲草菌絲體粉，按一定液固比加入蒸餾水，按設(shè)計(jì)的工藝參數(shù)進(jìn)行熱水浴加熱浸提，4 800 r/min離心10 min得上清液，真空濃縮后按80%比例加入無水乙醇，攪拌均勻，4 ℃靜置過夜，4 800 r/min離心，收集醇沉物，干燥后測定其質(zhì)量[16]。多糖得率計(jì)算如下式所示：

1.3.2 單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

分別選取提取時(shí)間、液固比、提取溫度3 個(gè)因素進(jìn)行菌絲體多糖提取單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取合適的水平，再利用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Variables and levels used in the three-factor, three-level response surface design

1.3.3 蟲草精制多糖制備及其結(jié)構(gòu)初步分析

精密稱取發(fā)酵蟲草菌絲體干燥粉末300 g，提取多糖。醇沉之后4 800 r/min離心15 min，收集沉淀，沉淀加入蒸餾水復(fù)溶，再用Sevag法脫蛋白，反復(fù)進(jìn)行3 次至無蛋白層。然后用蒸餾水透析48 h，冷凍干燥得蟲草菌絲體精制多糖，用于理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析。

1.3.3.1 蟲草多糖的基本化學(xué)組成

中性糖含量測定采用苯酚-硫酸法，酸性糖含量測定采用咔唑-乙醇法，蛋白含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法，水分測定采用直接干燥法。

1.3.3.2 HPSEC分析

分別采用HPSEC廣譜校正和HPSEC串聯(lián)多角度激光光散射的標(biāo)準(zhǔn)方法對蟲草菌絲體多糖的Mw及其分布進(jìn)行分析[17]。HPSEC串聯(lián)多角度激光光散射檢測器、黏度檢測器和示差檢測器。Model 1500 HPLC泵連接兩個(gè)分析柱：SB-806 HQ和SB-804 HQ，柱溫35 ℃。流動(dòng)相為0.2 mol/L NaNO3（含0.02% NaN3），流速為0.6 mL/min，ASTRA 6.1 software采集和分析數(shù)據(jù)。

1.3.3.3 單糖組成分析

采用高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培積分檢測器分析蟲草菌絲體多糖單糖組成。分析條件：CarboPacTMPA 20保護(hù)柱和CarboPacTMPA 20分析柱（4 mm×250 nm），流動(dòng)相A為超純水，B為250 mmol/L NaOH溶液，C為1 mol/L NaOAc溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表2，流速為0.25 mL/min。

表2 Dionex色譜系統(tǒng)單糖和糖醛酸的洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure for separation of monosaccharidesand uronic acid using Dionex chromatographic system

取多糖樣品5 mg于具塞試管中，冰浴條件下加入0.5 mL 12 mol/L的濃硫酸，冰浴攪拌30 min，然后加水稀釋至3 mL，轉(zhuǎn)移至100 ℃油浴中水解4 h。水解完成后取出，迅速用冷水冷卻，稀釋后用0.22 μm針孔過濾器過濾后直接進(jìn)樣分析。單糖標(biāo)準(zhǔn)品配成不同濃度的單標(biāo)和混標(biāo)后直接進(jìn)樣分析，用于判斷和計(jì)算樣品中單糖的含量和種類。

1.3.3.4 紅外光譜分析

稱取充分干燥的多糖樣品2 mg與KBr混勻研磨后壓片，上機(jī)掃描分析，掃描范圍400～4 000 cm-1[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 液固比對多糖得率的影響

圖1 液固比對多糖得率的影響Fig. 1 Effect of solvent-to-solid ratio on the yield of polysaccharides

在固定提取溫度90 ℃、提取時(shí)間2 h、提取1 次的條件下，考察液固比對多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。多糖等大分子物質(zhì)在水中的溶解度與液固比密切相關(guān)，隨著液固比的增加，多糖的得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)液固比小于20∶1時(shí)，得率增長較快。當(dāng)液固比大于25∶1時(shí)，上升已趨于平緩。雖然隨著液固比的增加得率有輕微增長，但綜合考慮濃縮以及醇沉的能耗，最佳液固比選擇22∶1為宜。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響

在固定液固比20∶1、提取時(shí)間2 h、提取1 次的條件下，考察提取溫度對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。溫度直接影響物質(zhì)在水中的溶解度，因此對多糖的得率會(huì)有比較明顯的影響。隨著溫度的升高，多糖的得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)溫度小于95 ℃時(shí)，得率增長較快。當(dāng)溫度大于95 ℃時(shí)，得率已趨于平緩。因此，最佳提取溫度選擇95 ℃。

圖2 提取溫度對多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides

2.1.3 提取時(shí)間對多糖得率的影響

圖3 提取時(shí)間對多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides

在固定液固比20∶1、提取溫度95 ℃、提取1 次的條件下，考察提取時(shí)間對多糖得率的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著時(shí)間的延長，多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢，當(dāng)時(shí)間大于4 h時(shí)，得率已趨于平緩。因此，最佳提取時(shí)間選擇4 h。

2.2 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface methodology

依據(jù)Design-Expert 8.05軟件中的中心組合設(shè)計(jì)選項(xiàng)，得到發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取的三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，見表3。按照表3數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，可建立以發(fā)酵蟲草菌絲體得率（Y）對液固比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）的擬合方程為：Y=9.59+0.14X1+0.14X2+0.19X3+0.15X1X3+ 0.07X2X3-0.2X12-0.19X2

2-0.28X3

2。對回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析結(jié)果（表4）表明，模型F值為17.08，極顯著（P＜0.01），且失擬項(xiàng)不顯著（P=0.1103），因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對結(jié)果進(jìn)行分析。相關(guān)系數(shù)R2為0.9564，表明用上述回歸方程描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著，該模型與實(shí)際擬合較好。

表4 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取工藝條件的回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for polysaccharides from Paecilomyces hepiali Chen & Dai

從表4可以看出，多糖提取模型建立中一次項(xiàng)和二次項(xiàng)均對多糖得率表現(xiàn)出極顯著影響，交互項(xiàng)X1X3對多糖得率的影響表現(xiàn)為顯著水平，而X1X2和X2X3不具有顯著水平影響。因此，各因素對多糖得率的影響主次順序?yàn)椋篨3（提取溫度）＞X1（液固比）＞X2（提取時(shí)間）。

通過軟件求解回歸方程，得出提取工藝最優(yōu)條件為液固比24.85∶1、提取時(shí)間4.48 h、提取溫度97.75 ℃，預(yù)測得率為9.71%。考慮到實(shí)際的可操作性，選擇液固比25∶1、提取時(shí)間4.5 h、提取溫度98.0 ℃，在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示發(fā)酵蟲草菌絲體多糖得率為（9.69±0.04）%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%，提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 基本組成分析

表5 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖組成成分Table 5 Chemical composition of the extracted polysaccharide

表5顯示，發(fā)酵蟲草菌絲體多糖中中性糖含量較高，并含有部分糖醛酸（9.5%），離子色譜（圖5）顯示為半乳糖醛酸。除此之外，還含有少量水分和蛋白質(zhì)。HPSEC（圖4）結(jié)果顯示出菌絲體多糖分子質(zhì)量分布較為集中，有1個(gè)較大主峰（峰2），因此，可進(jìn)一步對多糖進(jìn)行純化獲得純度更高、均一性更好的多糖純品。

2.4 HPSEC分析

HPSEC串聯(lián)多檢測器（多角度激光光散射檢測器、黏度檢測器和示差檢測器）技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于聚合物分子質(zhì)量和大小的分析。圖4為發(fā)酵蟲草菌絲體多糖在不同檢測器下的洗脫曲線，通過ASTRA 6.1 software計(jì)算，得到多糖的分子參數(shù)，結(jié)果如表6所示。色譜峰1處只存在單獨(dú)的激光信號，可能是因?yàn)榘l(fā)酵蟲草菌絲體多糖中存在極少量的高分子質(zhì)量多糖組分或聚集體[19]，這些組分的含量很低，在示差等濃度型檢測器中幾乎檢測不出，但是由于分子尺寸大，光散射能力強(qiáng)，在光散射檢測器（尤其是小角度）中可觀察到這些極少量物質(zhì)的信息。

如表6所示，色譜峰2的數(shù)均分子質(zhì)量Mn和重均分子質(zhì)量Mw分別34.7、61.6 kD，色譜峰3的Mn和Mw分別26.6 kD和35.8 kD，由此可知色譜峰2和色譜峰3的多分散系數(shù)（Mw/Mn）分別為1.77和1.35，表明菌絲體多糖的分子尺寸是一種寬分布且峰2的分子質(zhì)量分布區(qū)間比峰3要更寬。ASTRA軟件分析多糖樣品的構(gòu)象，即由分子旋轉(zhuǎn)半徑與分子摩爾數(shù)之間的關(guān)系曲線可得，該關(guān)系曲線用α表示[20-22]。一般認(rèn)為α在0.5～0.8之間，表明多糖分子呈柔性無規(guī)則線團(tuán)；當(dāng)α增大，多糖的剛性隨之增強(qiáng)。當(dāng)α超過1時(shí)，表明多糖鏈呈棒狀結(jié)構(gòu)，低于0.3時(shí)則呈球形結(jié)構(gòu)[23-24]。發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的主要成分（峰2）的α值為0.61，因此其結(jié)構(gòu)可能呈柔性無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)。

2.5 單糖組成分析

圖5 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的單糖組成色譜圖Fig. 5 HPAEC chromatogram for the monosaccharide composition ofthe polysaccharide

發(fā)酵蟲草菌絲體多糖經(jīng)酸水解后進(jìn)離子色譜分析，結(jié)果如圖5所示。根據(jù)不同單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到，發(fā)酵蟲草菌絲體多糖主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成，其物質(zhì)的量比為2.5∶31∶36∶1∶15∶4，另外還有極少量的巖藻糖和鼠李糖。單糖種類結(jié)果與Wu Zhongwei等[25]報(bào)道的類似，但是他們所提取的擬青霉多糖中甘露糖含量最高，這種差異可能因?yàn)榫N、發(fā)酵條件等的不同而導(dǎo)致的。其他有關(guān)發(fā)酵蟲草菌粉多糖的報(bào)道中也有相似的單糖組成[26-27]，表明發(fā)酵蟲草菌絲體多糖屬于雜多糖。

2.6 紅外光譜分析

圖6 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的紅外圖譜Fig. 6 FI-IR spectrum of the polysaccharide

發(fā)酵蟲草菌絲體多糖紅外光譜分析見圖6，菌絲體多糖具有糖類化合物的特征吸收峰3 600～3 200 cm-1， 3 000～2 800 cm-1和1 400～1 200 cm-1。3 448 cm-1處是多糖分子中O—H的伸縮振動(dòng)，說明存在分子內(nèi)和分子間氫鍵[28-29]。2 931 cm-1波長處的峰是多糖類C—H伸縮振動(dòng)，1 417 cm-1之間的吸收峰是多糖類C—H的變角振動(dòng)[27]。1 652 cm-1為羰基伸縮振動(dòng)，1 234 cm-1為—COOH中O—H鍵伸縮振動(dòng)，1 040 cm-1的中等強(qiáng)度的信號峰是C—O—H和吡喃糖環(huán)C—O—C中C—O鍵伸縮振動(dòng)引起的，877 cm-1處的吸收峰說明該多糖以β-糖苷鍵連接[30]。

3 結(jié) 論

本研究采用響應(yīng)面法對發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得出菌絲體多糖最佳提取工藝條件分別為提取溫度98.0 ℃、提取時(shí)間4.5 h、液固比25∶1，該條件下多糖得率為9.69%。發(fā)酵蟲草菌絲體多糖主要為分子質(zhì)量61.6 kD的單一色譜峰，并且可能呈柔性無規(guī)則線團(tuán)結(jié)構(gòu)。單糖組成結(jié)果表明菌絲體多糖主要由半乳糖、葡萄糖和甘露糖組成，紅外光譜表明多糖可能為吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)。本研究為進(jìn)一步探討發(fā)酵蟲草菌絲體多糖活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持，同時(shí)也為發(fā)酵蟲草菌絲體多糖產(chǎn)品的開發(fā)及擴(kuò)大應(yīng)用提供初步理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction and Structural Analysis of Polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai

ZHANG Lili1, FAN Linlin2, NIE Qixing2, HUANG Yansheng1, ZHANG Quancai1, YIN Junyi2, ZHANG Shuang1, NIE Shaoping2,*
(1. Infintus (Yingkou) Co. Ltd., Yingkou 115000, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Response surface methodology was applied to optimize polysaccharide extraction from Paecilomyces hepiali Chen & Dai. The extracted polysaccharide was structurally elucidated. The optimal extraction conditions were found to be 4.5 h extraction with hot water at 98.0 ℃ at water/material ratio of 25:1 (mL/g). Under these conditions, the maximum polysaccharide yield of 9.69% was obtained and the polysaccharide mainly composed of neutral polysaccharide (84.7%) and uronic acid (9.5%). High performance size exclusion chromatography (HPESC), high performance anion exchange chromatography and FT-IR spectroscopy were used to analyze the structural characteristics of the polysaccharide. Results showed that the molecular weight of the polysaccharide was 61.6 kD, displaying a single chromatographic peak, and its structure contained a pyran ring. In addition, the polysaccharide was composed of arabinose, galactose, glucose, xylose, mannose and galacturonic acid, with a molar ratio of 2.5:31:36:1:15:4. The findings may be useful for future studies on the structure-activity relationship of polysaccharides from Paecilomyces hepiali Chen & Dai and for the development of new polysaccharide-based products.

polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai; extraction optimization; response surface methodology; structural analysis

10.7506/spkx1002-6630-201714014

TS201.1

A

1002-6630（2017）14-0091-06

張麗麗, 范琳琳, 聶啟興, 等. 發(fā)酵蟲草菌絲體多糖提取條件優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 91-96.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714014. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Lili, FAN Linlin, NIE Qixing, et al. Optimization of extraction and structural analysis of polysaccharide from Paecilomyces hepiali Chen & Dai[J]. Food Science, 2017, 38(14): 91-96. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201714014. http://www.spkx.net.cn

2016-09-05

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD33B06）

張麗麗（1986—），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)楸＝∈称?。E-mail：lili.zhang@infinitus-int.com

*通信作者：聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與分析、食品營養(yǎng)與安全、食品復(fù)雜碳水化合物。E-mail：spnie@ncu.edu.cn