楊龍平，嚴文靜*，黃明明，喬維維，章建浩*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌性能研究

楊龍平，嚴文靜*，黃明明，喬維維，章建浩*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，國家肉品質(zhì)量與安全控制工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210095）

為了提高溶菌酶的穩(wěn)定性及對革蘭氏陰性菌的抑菌性能，以金納米顆粒為核，通過表面定向修飾溶菌酶，制備了綠色、高效的溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌材料，研究溶菌酶與金納米的比例、納米顆粒質(zhì)量濃度等對抑菌效果的影響，研究溶菌酶功能化納米材料對大腸桿菌的抑菌機理及對人神經(jīng)母細胞瘤（SH-SY5Y）的細胞毒性。結(jié)果表明：與未修飾的金納米及單純的溶菌酶相比，溶菌酶功能化金納米顆粒對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果均顯著增強，表現(xiàn)出協(xié)同抑菌作用，在最優(yōu)條件下，0.1 g/L溶菌酶功能化金納米顆?？梢酝耆珰⑺? 種細菌，并且該溶菌酶功能化金納米顆粒具有持久抑菌性及良好的生物相容性，對哺乳細胞沒有毒性。透射電子顯微鏡和活菌/死菌熒光染色結(jié)果表明：溶菌酶功能化金納米顆粒主要通過破壞菌體細胞壁和細胞膜結(jié)構(gòu)，從而殺死細菌。

溶菌酶；金納米顆粒；抑菌活性；細胞毒性；細胞膜通透性

蛋清溶菌酶是一種糖苷水解酶，等電點為10.8，酸性條件下十分穩(wěn)定，具有催化、抑菌等作用[1]。溶菌酶能夠通過水解細胞壁中肽聚糖主鏈上N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，最終導(dǎo)致細菌溶解死亡，主要作用于革蘭氏陽性菌。由于革蘭氏陰性菌細胞壁中的肽聚糖含量很少，且存在于細胞膜的中間層，因此，溶菌酶對革蘭氏陰性菌幾乎沒有抑制效果[2]。另外，有研究表明，溶菌酶的抑菌活性受鹽濃度、堿性條件、氧化劑等因素影響，因而極大限制了溶菌酶作為天然防腐劑在食品保鮮中的實際應(yīng)用和推廣[3]。

隨著細菌對抗生素的耐藥性日益增強，納米材料在抗菌殺菌領(lǐng)域的研究和應(yīng)用受到了廣泛的關(guān)注。納米材料具有量子尺寸效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和極大的比表面積等特性，因而具有傳統(tǒng)抗菌劑無法比擬的抗菌性能[4]。其中，銀納米顆粒由于在殺菌方面具有強效、快速和滲透力強等特點，且具有廣譜抗菌性，被廣泛用于醫(yī)療、生物等領(lǐng)域[5]，但研究發(fā)現(xiàn)納米銀對哺乳動物細胞有較大的毒性[6]。金納米顆粒具有生物相容性好、化學(xué)性能穩(wěn)定、形貌可控、表面易于修飾等特性，目前已在生物成像、癌癥治療、生物傳感等方面有著廣泛的應(yīng)用[7]。研究表明，金納米顆粒能夠破壞細胞膜通透性，導(dǎo)致內(nèi)容物泄漏而使菌體死亡，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定的抑菌作用[8]，但是單純使用金納米顆粒往往達不到實際殺菌的要求，其原因可能與金納米良好的生物相容性有關(guān)[9]。目前，關(guān)于金納米顆粒在抑菌方面的研究較少。

與常規(guī)大尺寸材料不同，納米材料的性質(zhì)很大程度上受材料本身的尺寸、形貌、表面性質(zhì)、聚集狀態(tài)、劑量等因素影響，這一特點賦予了納米材料更大的應(yīng)用潛力。金納米顆粒能夠通過表面靜電吸附作用或形成Au—S鍵與生物分子定向結(jié)合，從而制備得到具有不同功能基團和表面性能的金納米顆粒[10]。另外，通過對金納米顆粒表面進行定向修飾能夠有效降低其細胞毒性和免疫原性，基于此性質(zhì)，功能化金納米顆粒已被廣泛用于藥物釋放、光學(xué)成像和光熱治療等方面，是目前納米材料領(lǐng)域研究的熱點[11]。但是，功能化金納米顆粒在抑菌方面的研究卻仍處于初級階段[12]。

本實驗為了解決溶菌酶和單純金納米顆粒在抑菌方面的局限性，開發(fā)綠色、高效、廣譜的非抗生素、非銀系納米抑菌材料，通過制備溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌材料，研究該功能化納米材料對大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）的抑菌性能、抑菌持久性及其細胞毒性，并且通過活菌/死菌熒光染色及透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）初步揭示溶菌酶功能化金納米顆粒的抑菌機理。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus CMCC（B）26003）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922） 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

普通肉湯培養(yǎng)基、伊紅美蘭固體培養(yǎng)基、貝爾德-帕克固體培養(yǎng)基 青島海博生物科技有限公司；HAuCI4北京化學(xué)試劑公司；檸檬酸三鈉 美國Sigma公司；單寧酸 上海瑞永生物科技有限公司；碳酸鉀 西隴化工股份有限公司；蛋清溶菌酶 北京Solarbio公司。實驗用水均為去離子水，所用玻璃儀器均預(yù)先采用王水浸泡進行清洗，干燥后備用。

1.2 儀器與設(shè)備

JEM-2100 TEM 日本電子株式會社；UV-2600紫外-可見光分光光度計 日本島津有限公司；Allegra-64R臺式冷凍離心機 美國Beckman公司；Nano ZS90納米粒度儀、Zeta電位儀 英國馬爾文儀器有限公司；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Bruker-M90電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）儀 布魯克科技有限公司；TCS-SP2激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 溶菌酶功能化金納米顆粒的制備與表征

金納米顆粒合成[13]：取一潔凈的錐形瓶A依次加入79 mL超純水和1 mL 1%的HAuCI4溶液。另取一錐形瓶B依次加入15.8 mL超純水、4 mL 1%的檸檬酸三鈉溶液、0.1 mL 1%的單寧酸溶液、0.1 mL 25 mmol/L的K2CO3溶液。將A、B溶液放置于60 ℃水浴加熱30 min，然后將B液迅速加入到A液中，并于60 ℃水浴攪拌加熱，直至溶液顏色由無色變成酒紅色并保持不變，停止加熱，冷卻至室溫。將制備的金納米溶液于13 000 r/min離心10 min，去上清液，加12.5 mL超純水重懸，得到8 倍濃縮的金納米溶液。由ICP-MS分析得到，濃縮后的金納米溶液中金納米顆粒的質(zhì)量濃度為0.8g/L。

溶菌酶功能化金納米顆粒制備：分別取上述制備的1 mL 0.05 g/L金納米溶液于5 個離心管中，向5 個管中依次加入0.001、0.005、0.05、0.1、0.2 mL 100 g/L溶菌酶，使金納米-溶菌酶的質(zhì)量比分別為1∶2、1∶10、1∶100、1∶200、1∶400?；旌弦菏覝卣袷幏磻?yīng)過夜，10 000 r/min離心10 min，去上清液，加1 mL超純水重懸，得到溶菌酶功能化金納米顆粒溶液。

溶菌酶功能化金納米顆粒表征：對制備的金納米顆粒采用TEM進行表征，對溶菌酶修飾的金納米顆粒采用納米粒度儀及Zeta電位儀、紫外-可見分光光度計進行表征。

1.3.2 溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌活性測定

分別取冷凍保藏的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌種，接種于普通肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)16 h，在轉(zhuǎn)速6 000 r/min下離心10 min，棄上清液，菌體沉淀重懸并稀釋至菌落總數(shù)106CFU/mL作為測試菌液，備用。

金納米顆粒、溶菌酶和溶菌酶功能化金納米顆粒的抑菌活性采用平板計數(shù)法測定。取1 mL不同質(zhì)量濃度的抑菌劑分別加入到1 mL的菌液中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，以加生理鹽水組作空白對照。取1 mL培養(yǎng)后的菌液加入9 mL無菌生理鹽水（1號），振蕩均勻后，取管1中1 mL菌液加入9 mL無菌生理鹽水（2號），依次類推至6號，即稀釋106倍，分別取稀釋后的菌懸液100 μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)平皿在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，對菌落計數(shù)。實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。抑菌率（R）按公式（1）進行計算。

式中：A、B分別為空白組、處理組平均菌落數(shù)。

1.3.3 溶菌酶功能化金納米顆粒最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）測定

將1 mL金納米、溶菌酶和溶菌酶功能化金納米顆粒溶液，分別加入到1 mL滅菌的普通肉湯培養(yǎng)基中，進行2 倍逐級稀釋后，分別向每個梯度的樣品溶液中加入1 mL的菌懸液，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)24 h。以加生理鹽水替代溶菌酶和金納米顆粒為空白對照。觀察細菌生長情況，空白對照組中細菌呈混濁狀生長；然后觀察含有抑菌劑溶液的混濁度，溶液開始出現(xiàn)澄清的最低濃度確定為樣品的MIC。實驗重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。并通過計算部分抑菌濃度（fractional inhibitory concentration，F(xiàn)IC）來判斷2 種抑菌劑聯(lián)合抑菌效果，F(xiàn)IC指數(shù)按公式（2）計算[14]。若FIC≤0.5，則其抑菌效果為協(xié)同作用；若0.5＜FIC≤1.0，則其抑菌效果為相加作用；若1.0＜FIC＜4.0，則其抑菌效果無相關(guān)作用；若FIC≥4.0，則其抑菌效果為拮抗作用。

式中：MIC甲藥聯(lián)用、MIC乙藥聯(lián)用分別為甲、乙藥物聯(lián)合使用時的MIC值對應(yīng)的甲、乙藥物的濃度；MIC甲藥單用、MIC乙藥單用分別為甲、乙藥物單獨使用時的MIC值。

1.3.4 溶菌酶功能化金納米顆粒生長抑制曲線測定

用肉湯培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)增長期的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌液稀釋成106CFU/mL，分別加入0.5×MIC、1.0×MIC、2.0×MIC的溶菌酶功能化金納米顆粒。以加生理鹽水組為空白對照，37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)，定時取樣，利用紫外-可見分光光度計測定菌液OD600nm。

1.3.5 活菌/死菌熒光染色分析

用生理鹽水將培養(yǎng)至對數(shù)增長期的大腸桿菌菌液稀釋成106CFU/mL，分別加入金納米（0.05 g/L）、溶菌酶（5.00 g/L）和溶菌酶功能化金納米顆粒溶液（0.05 g/L）。以加生理鹽水組為空白對照，37 ℃條件下振蕩反應(yīng)24 h。按照LIVE/DEAD?BaclightTMBacterial Vibility Kit試劑盒說明書，對處理后的細菌進行染色。在CLSM下死菌被碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色呈紅色，活菌被SYTO 9染色呈綠色。

1.3.6 TEM觀察

培養(yǎng)至對數(shù)增長期的大腸桿菌菌液，分別加入金納米（0.05 g/L）、溶菌酶（5.00 g/L）和溶菌酶功能化金納米顆粒溶液（0.05 g/L），反應(yīng)24 h，6 000 r/min離心10 min收集細胞，按照文獻[15]進行超薄切片，用TEM觀察細菌形態(tài)變化。

1.3.7 溶菌酶功能化金納米顆粒細胞毒性測定

細胞毒性分析采用常用的四甲基偶氮唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）比色法[16]，收集對數(shù)期SH-SY5Y細胞，制成細胞懸液，以每孔5×104個的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，再置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。細胞貼壁后向其中分別加入不同質(zhì)量濃度的金納米和溶菌酶功能化金納米顆粒，使其金納米顆粒的終質(zhì)量濃度為0、0.012、0.025、0.050、0.100、0.200 g/L，每個梯度做6 孔平行實驗。2.5% CO2、37 ℃條件下孵育24 h后，每孔加入10 μL 5 g/L MTT染色液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，取出傾倒孔內(nèi)液體，每個孔中加入100 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），室溫下避光振蕩反應(yīng)15 min，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定570 nm波長處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶菌酶功能化金納米顆粒制備與表征

由圖1A可知，合成的金納米顆粒分散性好、形貌均一，平均粒徑為（11.5±2.5） nm。圖1A內(nèi)嵌圖為溶菌酶功能化金納米顆粒TEM圖，可以看出，溶菌酶修飾后的金納米顆粒呈單分散狀態(tài)，粒徑均一，體系中沒有明顯的顆粒聚集。由圖1B可知，金納米顆粒的最大吸收峰在520 nm左右，溶菌酶的最大吸收峰在280 nm左右，而制備的溶菌酶功能化金納米顆粒同時在280 nm和520 nm附近出現(xiàn)吸收峰，分別對應(yīng)溶菌酶和金納米的等離子共振峰，說明金納米表面成功修飾溶菌酶。并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)金納米表面修飾溶菌酶后，金納米的最大吸收峰發(fā)生紅移，但是隨著金納米表面溶菌酶含量逐漸增加，金納米最大吸收峰的偏移波長逐漸減小。由于反應(yīng)體系的pH值（8.5）小于溶菌酶的等電點（10.8），此時溶菌酶帶正電荷，當(dāng)與表面帶負電荷的金納米接觸時，會引起金納米聚集，表現(xiàn)為金納米的最大吸收峰發(fā)生紅移[17]。但是隨著金納米表面溶菌酶含量的增加，金納米顆粒被溶菌酶完全包圍，有效阻止了金納米顆粒之間的聚集，因此，金納米的紫外吸收峰偏移減小。這一結(jié)果與溶菌酶功能化金納米顆粒的粒徑和Zeta電位的變化一致。

圖1 溶菌酶功能化金納米顆粒表征Fig. 1 Characterization of lysozyme-functionalized Au NPs

表1 溶菌酶功能化金納米顆粒粒徑和電位Table 1 Size and Zeta charge of lysozyme-functionalized Au NPs

如表1所示，與未修飾的金納米相比，金納米顆粒表面修飾溶菌酶后，其粒徑和電位均增大。隨著金納米表面溶菌酶含量的增加，其粒徑表現(xiàn)為先增大后減小然后保持不變的趨勢，當(dāng)溶菌酶-金納米的質(zhì)量比小于100時，其粒徑由原來的11.5 nm增至66.7 nm，表明金納米顆粒發(fā)生明顯聚集，當(dāng)溶菌酶-金納米的質(zhì)量比大于等于100時，其粒徑減小至40 nm左右并保持不變，說明金納米顆粒聚集程度減小，并且當(dāng)溶菌酶的質(zhì)量比為100時，金納米表面的溶菌酶已經(jīng)達到飽和。整個修飾過程中，Zeta電位由原來的-14.7 mV變?yōu)?9.3 mV，說明金納米表面成功修飾溶菌酶。

2.2 溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌活性測定

圖2 不同材料對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性Fig. 2 Antibacterial activities of different materials against E. coli and S. aureus

由圖2A可知，單純的金納米顆粒對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均沒有明顯的抑制作用，即使在0.8 g/L時對2 種菌株的抑菌率仍小于50%，而此質(zhì)量濃度的金納米顆粒對哺乳細胞具有較大的毒性[18]。綜合考慮不同質(zhì)量濃度金納米的細胞毒性及抑菌效率，選用0.05 g/L的金納米顆粒作為基底材料，對其表面修飾溶菌酶。

由圖2B可知，溶菌酶對2 種菌株都有一定的抑菌效果，并且對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑菌效果明顯高于對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑菌效果。5 g/L溶菌酶能抑制80%的金黃色葡萄球菌，而對大腸桿菌的抑菌率只有53%。其原因在于，溶菌酶是一種作用于細菌細胞壁的胞壁質(zhì)酶，能夠水解細菌細胞壁中的肽聚糖層。由于革蘭氏陽性菌的肽聚糖層位于細胞壁外層，因此溶菌酶對大多數(shù)革蘭氏陽性菌都有較好的抑菌效果；而革蘭氏陰性菌的肽聚糖層位于細胞壁的中間層，溶菌酶難以越過脂多糖作用于中間的肽聚糖層，因此溶菌酶對大多數(shù)革蘭氏陰性菌的抑菌效果并不理想[19]。

由圖2C可知，當(dāng)金納米顆粒表面修飾溶菌酶后，其抑菌效果大大提高，并且隨著金納米表面溶菌酶含量的增加，其對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果均逐漸提高。當(dāng)金納米-溶菌酶的質(zhì)量比為1∶100時（其中金納米質(zhì)量濃度為0.05 g/L，溶菌酶的質(zhì)量濃度為5 g/L），功能化金納米顆粒對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到99.5%，對大腸桿菌的抑菌率達到83%，明顯高于同樣質(zhì)量濃度未修飾的金納米顆粒和溶菌酶。并且發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溶菌酶-金納米的質(zhì)量比大于100后，其抑菌率增加幅度減小，可能是與金納米顆粒的尺寸、表面電位和結(jié)合位點有關(guān)，根據(jù)粒徑和Zeta電位的測量結(jié)果，當(dāng)溶菌酶-金納米質(zhì)量比超過100時，金納米表面的溶菌酶已經(jīng)達到飽和，過多的溶菌酶不能結(jié)合到金納米表面，導(dǎo)致其抑菌率不再增加，故選擇金納米-溶菌酶質(zhì)量比為1∶100為宜。

2.3 溶菌酶功能化金納米顆粒MIC實驗中分別對金納米、溶菌酶及溶菌酶功能化金納米顆粒的MIC進行了測定，由表2可知，溶菌酶對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為20 g/L和13 g/L，單純的金納米顆粒對2 種菌株的MIC均大于2 g/L，此結(jié)果與平板計數(shù)法測得抑菌率的變化趨勢一致。而溶菌酶功能化金納米顆粒（金納米-溶菌酶質(zhì)量比為1∶100）對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC分別為0.08 g/L和0.05 g/L，而該復(fù)合材料中含的溶菌酶的MIC降至單用時的0.4 倍。通過計算聯(lián)合抑菌效果指標FIC值進一步考察并驗證金納米顆粒和溶菌酶的聯(lián)合抑菌效果[20]。由表2可知，溶菌酶與金納米顆粒對2 種供試菌的抑菌效果指數(shù)FIC小于0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用。聯(lián)合抑菌效果的明顯性表現(xiàn)為：對金黃色葡萄球菌的抑制能力大于大腸桿菌，且相對于溶菌酶或金納米顆粒單獨抑菌效果來說尤為明顯。

表2 溶菌酶功能化金納米顆粒MIC及聯(lián)合抑菌效果評價Table 2 MIC and synergistic antibacterial effect of lysozymefunctionalized Au NPs

2.4 溶菌酶功能化金納米顆粒生長抑制曲線

圖3 不同質(zhì)量濃度溶菌酶功能化金納米顆粒作用下金黃色葡萄球菌（A）、大腸桿菌（B）的生長曲線Fig. 3 Growth curves of S. aureus and E. coli in the presence of different concentrations of lysozyme-functionalized Au NPs

由圖3可知，在0～48 h內(nèi)，添加生理鹽水（空白）的金黃色葡萄球菌和大腸桿菌快速生長，呈現(xiàn)典型的生長曲線。與空白組相比，添加溶菌酶功能化金納米顆粒的實驗組，能有效延長大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的延滯期，且隨著納米顆粒質(zhì)量濃度的提高延滯期變長。當(dāng)溶菌酶功能化金納米顆粒的質(zhì)量濃度達到2 倍MIC時，能完全抑制兩菌株的生長，菌液培養(yǎng)至48 h時其OD600nm值仍小于0.2。說明該方法制備的溶菌酶功能化金納米顆粒具有較持久的抑菌性能。

2.5 活菌/死菌熒光染色分析

圖4 活菌/死菌熒光染色CLSM圖Fig. 4 CLSM images of E. coli stained with LIVE/DEAD dye

圖4 為SYTO 9/PI染色大腸桿菌的熒光照片。SYTO 9可以穿透所有的細胞膜，而PI只能穿透死亡細菌破損的細胞膜，從而使活菌被綠色熒光標記（圖4A），死菌被紅色熒光標記（圖4B）[21]。通過此方法可以證明，細菌死亡是否與細胞膜破壞有關(guān)[22]。由圖4可知，單純金納米顆粒處理的細菌約90%具有完整的細胞膜結(jié)構(gòu)，僅有10%的細菌被紅色標記；溶菌酶處理后，約40%細菌被紅色熒光標記，說明少數(shù)細菌細胞膜結(jié)構(gòu)受損；而溶菌酶功能化金納米顆粒處理后，約80%的細菌失去完整的細胞膜結(jié)構(gòu)、菌體死亡，被紅色熒光標記的細菌數(shù)明顯增加，此結(jié)果與抑菌活性實驗結(jié)果基本一致（圖2）。由此說明，溶菌酶功能化金納米顆粒，通過溶菌酶與金納米顆粒的協(xié)同作用破壞細菌細胞膜，增加細胞膜的通透性，從而達到高效殺菌的目的。

處理后的大腸桿菌TEM圖Fig. 5 TEM images of E. coli treated with different materials

2.6 TEM觀察為了進一步說明溶菌酶功能化金納米顆粒對大腸桿菌細胞形態(tài)的影響，通過TEM觀察抑菌劑處理后的大腸桿菌，如圖5所示。金納米處理后的大腸桿菌細胞壁模糊、外膜表面出現(xiàn)破損，質(zhì)壁略有分離，金納米顆粒進入到細胞質(zhì)內(nèi)部，但細胞形狀保持不變，仍然存活

（圖5A）。在溶菌酶作用下，大腸桿菌質(zhì)壁略有分離，細胞壁結(jié)構(gòu)、層次不清，有空泡狀物及斑片狀低電子密度區(qū)形成，但菌體仍然保持細胞形狀（圖5B）[23]。而溶菌酶功能化金納米顆粒處理后，納米顆粒進入細胞質(zhì)，大腸桿菌細胞整體皺縮變形、質(zhì)壁嚴重分離，細胞壁及細胞膜斷裂、出現(xiàn)孔洞，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外流，細胞呈現(xiàn)為無定型的空殼形態(tài)（圖5C）。大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，其細胞壁由肽聚糖層和外膜構(gòu)成，因此不易被溶菌酶水解[24]。而金納米顆粒受表面官能團、電荷、粒徑等的影響，極易吸附到菌體表面，通過在膜上形成孔洞進入到菌體內(nèi)部，從而破壞微生物的細胞膜結(jié)構(gòu)[25]。因此，通過將溶菌酶修飾于金納米顆粒表面，一方面，能夠增加細菌表面溶菌酶的局部濃度，增加其穩(wěn)定性，提高溶菌酶的抑菌效果；另一方面，金納米顆粒能夠通過吞噬作用進入細胞內(nèi)，使得修飾在金納米表面的溶菌酶能夠越過外膜，并作用于肽聚糖層，通過破壞細胞壁和細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致細胞死亡[26]。

2.7 溶菌酶功能化金納米顆粒細胞毒性

圖6 溶菌酶功能化金納米顆粒細胞毒性Fig. 6 Cytotoxicity of lysozyme-functionalized Au NPs

功能化金納米顆粒對SH-SY5Y的細胞毒性如圖6所示。隨著金納米顆粒質(zhì)量濃度的增加，金納米處理的SH-SY5Y細胞存活率明顯降低，說明金納米對細胞的毒性增強，且當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.025 g/L時，細胞存活率低于80%，通常認為此質(zhì)量濃度的金納米顆粒有毒性[27]，此結(jié)果與Boyoglu等[18]的報道一致。相比于單純的金納米顆粒，溶菌酶功能化金納米顆粒的細胞存活率顯著（P＜0.05）提高，即使在0.1 g/L高質(zhì)量濃度金納米顆粒的作用下，細胞存活率仍大于80%，說明通過表面修飾溶菌酶能有效降低金納米顆粒的細胞毒性。納米顆粒的毒性與納米材料的劑量、尺寸、表面官能團、聚集狀態(tài)等有密切關(guān)系[28-29]，而溶菌酶是天然來源的防腐劑，具有良好的生物相容性，通過在金納米表面修飾溶菌酶，能夠有效提高金納米顆粒的穩(wěn)定性，通過阻止金納米顆粒在細胞內(nèi)的聚集，從而減弱金納米顆粒對細胞的毒理作用[30]。因此，該研究制備的溶菌酶功能化金納米顆粒具有良好的生物相容性。

3 結(jié) 論

通過納米材料表面定向修飾制備的溶菌酶功能化金納米顆粒，是一種綠色、高效的納米抑菌材料，利用溶菌酶和金納米顆粒的協(xié)同殺菌作用，0.1 g/L的溶菌酶功能化金納米顆?？梢?00%殺死大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，并且具有持久的抑菌性能（48 h）和良好的生物相容性，與單純的金納米和溶菌酶相比，其對革蘭氏陰性菌陽性菌的抑菌效果均顯著提高。生物TEM和細胞染色結(jié)果顯示，金納米顆粒與溶菌酶的協(xié)同效果顯著，兩者共同作用導(dǎo)致細菌的細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)破壞，從而加速細菌的死亡，然而其具體作用機理和作用途徑還不清楚，有待進一步研究。

[1] 盧小菊, 孟鴛. 溶菌酶與殼聚糖復(fù)配液抑菌作用的研究[J]. 中國食品添加劑, 2016(2): 51-56. DOI:10.3969/ j.issn.1006-2513.2016.02.002.

[2] AMINLARI L, HASHEMI M M, AMINLARI M. Modified lysozymes as novel broad spectrum natural antimicrobial agents in foods[J]. Journal of Food Science, 2014, 79(6): R1077- R1090. DOI:10.1111/1750-3841.12460.

[3] 任西營, 胡亞芹, 胡慶蘭, 等. 溶菌酶在水產(chǎn)品防腐保鮮中的應(yīng)用[J].食品工業(yè)科技, 2013, 34(8): 390-399.

[4] EBY D M, SCHAEUBLIN N M, FARRINGTON K E, et al. Lysozyme catalyzes the formation of antimicrobial silver nanoparticles[J]. ACS Nano, 2009, 3(4): 984-994. DOI:10.1021/nn900079e.

[5] SHARMA V K, yNGARD R A, LIN y. Silver nanoparticles: green synthesis and their antimicrobial activities[J]. Advances in Colloid and Interface Science, 2009, 145(1/2): 83-96. DOI:10.1016/ j.cis.2008.09.002.

[6] SOTIRIOU G A, PRATSINIS S E. Antibacterial activity of nanosilver ions and particles[J]. Environmental Science & Technology, 2010, 44(14): 5649-5654. DOI:10.1021/es101072s.

[7] DAS M, SGIM K H, AN S S A, et al. Review on gold nanoparticles and their applications[J]. Toxicology and Environmental Health Sciences, 2012, 3(4): 193-205. DOI:10.1007/s13530-011-0109-y.

[8] RAI A, PINTO S, VELHO T R, et al. One-step synthesis of highdensity peptide-conjugated gold nanoparticles with antimicrobial efficacy in a systemic infection model[J]. Biomaterials, 2016, 85: 99-110. DOI:10.1016/j.biomaterials.2016.01.051.

[9] LEE Y, GECKELER K E. Cytotoxicity and cellular uptake of lysozyme-stabilized gold nanoparticles[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2012, 100(4): 848-855. DOI:10.1002/jbm. a.34020.

[10] 劉肇彧, 丁婭, 吳迪, 等. 生物醫(yī)學(xué)新材料金納米粒子的細胞毒性研究進展[J]. 藥學(xué)進展, 2011, 33(4): 153-161. DOI:10.3969/ j.issn.1001-5094.2011.04.002.

[11] JIANG X M, WANG L M, WANG J, et al. Gold nanomaterials: preparation, chemical modification, biomedical applications and potential risk assessment[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2012, 166(6): 1533-1551. DOI:10.1007/s12010-012-9548-4.

[12] LAI H Z, CHEN W Y, WU C Y, et al. Potent antibacterial nanoparticles for pathogenic bacteria[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2015, 7(3): 2046-2054. DOI:10.1021/am507919m.

[13] YAN W, XU L, XU C, et al. Self-assembly of chiral nanoparticle pyramids with strong R/S optical activity[J]. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134(36): 15114-15121. DOI:10.1021/ja3066336.

[14] 張新娟, 左國營, 濤王, 等. 木犀草素與抗菌藥體外聯(lián)用抗耐甲氧西林金葡菌的作用研究[J]. 藥學(xué)進展, 2012, 36(4): 173-179. DOI:10.3969/j.issn.1001-5094.2012.04.005.

[15] 李仲興, 王秀華, 時東彥, 等. 五倍子提取物對表皮葡萄球菌的抗菌作用及其掃描和透射電鏡觀察[J]. 中國中醫(yī)藥信息雜志, 2004, 11(10): 867-869. DOI:10.3969/j.issn.1005-5304.2004.10.010.

[16] MAHMOUDI M, SERPOOSHAN V. Silver-coated engineered magnetic nanoparticles are promising for the success in the fight against antibacterial resistance threat[J]. ACS Nano, 2012, 6(3): 2656-2664. DOI:10.1021/nn300042m.

[17] DAS R, JAGNNATHAN R, SHARAN C, et al. Mechanistic study of surface functionalization of enzyme lysozyme synthesized Ag and Au nanoparticles using surface enhanced raman spectroscopy[J]. Journal of Physical Chemistry C, 2009, 113(52): 21493-21500. DOI:10.1021/ jp905806t.

[18] BOYOGLU C, HE Q W, WILLING G, et al. Microscopic studies of various sizes of gold nanoparticles and their cellular localizations[J]. ISRN Nanotechnology, 2013, 2013: 123838. DOI:10.1155/2013/123838.

[19] TINA F, YUE T, LI Y, et al. Computer simulation studies on the interactions between nanoparticles and cell membrane[J]. Science China Chemistry, 2014, 57(12): 1662-1671. DOI:10.1007/s11426-014-5231-7.

[20] 豆麗麗. 蛋清溶菌酶與茶多酚聯(lián)合抑菌作用研究[J]. 包裝學(xué)報, 2012, 4(4): 26-30. DOI:10.3969/j.issn.1674-7100.2012.04.006.

[21] SOTIRIOU G A, STARICH F, DASARGYRI A, et al. Photothermal killing of cancer cells by the controlled plasmonic coupling of silicacoated Au/Fe2O3nanoaggregates[J]. Advanced Functional Materials, 2014, 24(19): 2818-2827. DOI:10.1002/adfm.201303416.

[22] LI Y, YU H, QIAN Y, et al. Amphiphilic star copolymer-based bimodal fluorogenic/magnetic resonance probes for concomitant bacteria detection and inhibition[J]. Advanced Materials, 2014, 26(39): 6734-6741. DOI:10.1002/adma.201402797.

[23] 楊向科, 鄒艷麗, 孫謐, 等. 海洋微生物溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2005, 26(5): 62-68. DOI:10.3969/ j.issn.1000-7075.2005.05.011.

[24] 盧亞萍, 潘宏濤. Aegis溶菌酶的抑菌作用及抑菌機理初步研究[J]. 飼料與畜牧, 2007(12): 15-17. DOI:10.3969/j.issn.1006-6314-B.2007.12.008.

[25] ADHIKARI M D, GOSWAMI S, PANDA B R, et al. Membranedirected high bactericidal activity of (gold nanoparticle)-polythiophene composite for niche applications against pathogenic bacteria[J]. Advanced Healthcare Materials, 2013, 2(4): 599-606. DOI:10.1002/ adhm.201200278.

[26] REGIELFUTYRA A, KUSLISKIEWICZ M, SEBASTIAN V, et al. Development of noncytotoxic chitosan-gold nanocomposites as efficient antibacterial materials[J]. ACS Applied Materials & Interfaces, 2014, 7(2): 1087-1099. DOI:10.1021/am508094e.

[27] 宋文植, 尹萬忠, 楊歡, 等. MTT法檢測納米金粒子體外細胞毒性的研究[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2011, 15(8): 1242-1245. DOI:10.3969/ j.issn.1007-4287.2011.08.004.

[28] 張富強, 佘文珺, 傅遠飛. 六種納米載銀無機抗菌劑的體外細胞毒性比較[J]. 中華口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 40(6): 504-506. DOI:10.3760/ j.issn:1002-0098.2005.06.018.

[29] SOENEN S J, MANSHIAN B, MONTENEGRO J M, et al. Cytotoxic effects of gold nanoparticles: a multiparametric study[J]. ACS Nano, 2012, 6(7): 5767-5783. DOI:10.1021/nn301714n.

[30] UBOLDI C, BONACCHI D, LORENZI G, et al. Gold nanoparticles induce cytotoxicity in the alveolar type-Ⅱ cell lines A549 and NCIH441[J]. Particle and Fibre Toxicology, 2009, 6: 18. DOI:10.1186/1743-8977-6-18.

Antimicrobial Activity of Lysozyme-Functionalized Gold Nanoparticles

YANG Longping, YAN Wenjing*, HUANG Mingming, QIAO Weiwei, ZHANG Jianhao*
(Jiangsu Collaborative Innovation Center of Meat Production and Processing, Quality and Safety Control, National Central of Meat Quality and Safety Control, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to improve the stability of lysozyme and its antibacterial activity against Gram-negative bacteria, as a green and highly efficient antibacterial agent, lysozyme-functionalized gold nanoparticles were prepared for the first time by surface modification of gold nanoparticles with lysozyme. The influences of the mass ratio of lysozyme to gold nanoparticles and the concentration of functionalized nanoparticles on the antibacterial activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria were examined. The antibacterial mechanism of the prepared materials against Escherichia coli and the cytotoxicity on SH-SY5Y cells were also investigated. The results showed that compared with pure gold nanoparticles and lysozyme, the antibacterial activity of lysozyme-functionalized gold nanoparticles against E. coli and Staphylococcus aureus were obviously enhanced, which indicated the synergistic antibacterial effect of lysozyme and gold nanoparticles. Under optimized conditions, 0.1 g/L lysozyme-functionalized gold nanoparticles were able to completely kill the two types of bacteria. Besides, lysozymefunctionalized gold nanoparticles exhibited durable antibacterial properties and good biocompatibility, which were not toxic to mammalian cells. Transmission electron microscopy (TEM) images and live/dead bacterial assay showed that lysozymefunctionalized gold nanoparticles could kill bacteria by disrupting the cell membrane and cell wall.

lysozyme; gold nanoparticles; antibacterial activity; cytotoxicity; membrane permeability

10.7506/spkx1002-6630-201714013

TS206.4

A

1002-6630（2017）14-0084-07

楊龍平, 嚴文靜, 黃明明, 等. 溶菌酶功能化金納米顆粒抑菌性能研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 84-90.

10.7506/ spkx1002-6630-201714013. http://www.spkx.net.cn

YANG Longping, YAN Wenjing, HUANG Mingming, et al. Antimicrobial activity of lysozyme-functionalized gold nanoparticles[J]. Food Science, 2017, 38(14): 84-90. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714013. http://www.spkx.net.cn

2016-06-16

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2015BAD16B05）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費自主創(chuàng)新重點項目（KYZ2015）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目（CX（15）1049）

楊龍平（1991—），女，碩士研究生，研究方向為納米抑菌材料開發(fā)。E-mail：2014108075@njau.edu.cn

*通信作者：嚴文靜（1986—），女，講師，博士，研究方向為納米材料抑菌保鮮。E-mail：ywj1103@njau.edu.cn

章建浩（1961—），男，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制。E-mail：nau_zjh@njau.edu.cn