趙子舒，李吉年，郭 謙，葉翔宇，胡夢欣,3,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省紡織測試研究院，浙江 杭州 310018；3.浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310018）

副干酪乳桿菌在多巴胺改性聚丙烯纖維膜上形成生物膜及其發(fā)酵性能

趙子舒1，李吉年1，郭 謙1，葉翔宇2，胡夢欣1,3,*

（1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.浙江省紡織測試研究院，浙江 杭州 310018；3.浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室，浙江 杭州 310018）

利用多巴胺在材料表面的自發(fā)黏附特性，制備了多巴胺改性的聚丙烯纖維膜，研究多巴胺改性對副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracaise）在聚丙烯纖維膜上形成生物膜的影響及L. paracasei生物膜的發(fā)酵性能。利用掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀及接觸角儀對多巴胺改性聚丙烯纖維膜表面形成的L. paracasei生物膜進(jìn)行表征，并對L. paracasei生物膜的抗逆性與發(fā)酵能力進(jìn)行研究。結(jié)果表明，多巴胺改性對聚丙烯纖維膜表面L. paracasei生物膜形成具有顯著的促進(jìn)作用，多巴胺改性聚丙烯纖維膜表面的生物膜具有極佳的抗逆性能，更耐受高溫和酸堿環(huán)境，用于生物膜反應(yīng)器中發(fā)酵生產(chǎn)的L-乳酸純度維持在99%以上，同時反應(yīng)器基本沒有發(fā)酵延滯期，有效提高了生物發(fā)酵效率。

副干酪乳桿菌生物膜；多巴胺；聚丙烯纖維膜；生物膜反應(yīng)器；L-乳酸

引文格式：趙子舒, 李吉年, 郭謙, 等. 副干酪乳桿菌在多巴胺改性聚丙烯纖維膜上形成生物膜及其發(fā)酵性能[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 71-77. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714011. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Zishu, LI Jinian, GUO Qian, et al. Surface modification of polypropylene fiber membranes with dopamine to enhance the formation of Lactobacillus paracasei biofilms and its fermentation performance for lactic acid production[J]. Food Science, 2017, 38(14): 71-77. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714011. http://www.spkx.net.cn

乳酸是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，廣泛應(yīng)用于食品[1]、醫(yī)藥[2]、化工[3]等諸多領(lǐng)域。其中，約有80%的乳酸消費(fèi)在食品行業(yè)。近年來，以乳酸為單體合成可生物降解高分子，聚乳酸（polylactic acid，PLA）[4]，是乳酸消費(fèi)的新興領(lǐng)域，市場對乳酸的需求極其旺盛。乳酸是具有光學(xué)活性的分子[5]，常見的乳酸包括L-乳酸、D-乳酸以及它們的混合物外消旋DL-乳酸[6]?；谌樗岬娜梭w代謝情況和聚合物合成及使用的需求，生產(chǎn)高光學(xué)純度的乳酸，特別是L-乳酸，是當(dāng)前迫切需要解決的問題[7]。

由于石油資源的日漸匱乏，目前多采用生物發(fā)酵法代替化學(xué)合成法生產(chǎn)L-乳酸。工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的菌種主要為米根霉菌和乳酸菌。米根霉菌在生產(chǎn)過程中需要調(diào)控其復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)才能得到高純度L-乳酸。與之相比較，乳酸菌更易合成高純度的L-乳酸。副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）同時具有益生菌和發(fā)酵菌種的雙重作用[8]，在代謝過程中可產(chǎn)生大量的L-乳酸。Richter等[9]利用L. paracasei發(fā)酵淀粉水解液生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)率為94%，且細(xì)胞具有良好的重復(fù)使用性，在連續(xù)7 批實驗中，乳酸鹽最大生產(chǎn)量達(dá)6.23～11.54 g/（L?h）。Moon等[10]發(fā)現(xiàn)從乙醇生產(chǎn)工廠附近土壤中分離出的L. paracasei CHB2121在含有200 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中發(fā)酵，可有效地產(chǎn)生192 g/L的L-乳酸，且光學(xué)純度達(dá)到96.6%。Petrova等[11]利用L. paracasei B41發(fā)酵淀粉生產(chǎn)L-乳酸，在48 h的發(fā)酵過程中，L-乳酸最高質(zhì)量濃度為40 g/L，L-乳酸轉(zhuǎn)化率為93.3%，生產(chǎn)率為1.3 g/（L?h）。由此可知，L. paracasei是發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸優(yōu)良菌種。

眾所周知，生物發(fā)酵是生物工程領(lǐng)域獲得L-乳酸等產(chǎn)品的至關(guān)重要的應(yīng)用型環(huán)節(jié)。近年來，生物固定化技術(shù)發(fā)展成為現(xiàn)代生物發(fā)酵領(lǐng)域的一項新興技術(shù)，包括固定化酶技術(shù)和固定化細(xì)胞技術(shù)。其中，生物膜法細(xì)胞固定技術(shù)是一種有效的細(xì)胞固定化方法。生物膜指附著于有生命或無生命物體表面被細(xì)胞外基質(zhì)緊密包裹的高度組織化的細(xì)菌群體[12]。與傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法相比，生物膜法道法自然，優(yōu)勢明顯：1）自發(fā)在材料表面形成，簡化了固定化程序；2）更耐受苛刻環(huán)境，具有高催化活性；3）極大地提高了細(xì)菌密度，且較為穩(wěn)定，可連續(xù)生產(chǎn)數(shù)月甚至年余，提高了反應(yīng)效率；4）簡化了下游分離環(huán)節(jié)，大幅減少污水和副產(chǎn)物，極具經(jīng)濟(jì)價值和環(huán)境意義[13-14]。因此，生物膜法被國內(nèi)外研究者們認(rèn)為是一種最具潛力的工業(yè)化生產(chǎn)工具[12]。目前，基于生物膜構(gòu)建的反應(yīng)器在污水處理[15-16]、生物發(fā)酵[17-18]和微生物燃料電池[19-20]等領(lǐng)域的應(yīng)用尤為廣泛。然而，關(guān)于乳酸菌生物膜反應(yīng)器方面的研究和應(yīng)用還相對較少。

雖然形成生物膜是多數(shù)細(xì)菌的特性，但其成膜能力存在差異。因此選擇合適的載體材料十分關(guān)鍵。在生物膜形成的過程中，材料表面的性質(zhì)對微生物的吸附與黏附影響深遠(yuǎn)。構(gòu)建合適的材料表面與界面是生物材料領(lǐng)域里的核心問題。多巴胺是貽貝分泌的黏附蛋白中的主要結(jié)構(gòu)，在堿性環(huán)境下可發(fā)生自聚合反應(yīng)，在各種材料表面形成仿生聚多巴胺薄膜，對各種材料進(jìn)行表面改性和表面功能化。大量研究表明，多巴胺可增強(qiáng)材料的親水性。材料表面的親水性與細(xì)胞的生物學(xué)行為密切相關(guān)，高親水性的材料表面在短期內(nèi)能促進(jìn)各種細(xì)胞的黏附和增殖活性[25-27]。Mo Xiaoju等[28]采用多巴胺對氧化石墨烯進(jìn)行表面改性，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞在多巴胺氧化石墨烯表面的黏附、鋪展、分化得到了強(qiáng)化。Ku等[29]比較了材料表面多巴胺改性對細(xì)胞黏附的影響，發(fā)現(xiàn)不同種類的細(xì)胞在多巴胺改性的區(qū)域具有顯著的黏附行為，并保持良好的生理形態(tài)。這些研究結(jié)果說明多巴胺改性賦予了材料良好的生物相容性，可促進(jìn)生物細(xì)胞的黏附、增殖和生理活性。但目前研究基本集中在考察動物細(xì)胞在多巴胺修飾的材料表面的行為，甚少涉及微生物細(xì)胞在這類材料表面的行為。本研究利用多巴胺的自聚沉積和超強(qiáng)黏附力，在聚丙烯纖維膜表面形成聚多巴胺層，并以多巴胺改性的聚丙烯纖維膜為載體材料，考察L. paracasei在多巴胺改性聚丙烯纖維膜上形成生物膜的能力，并對生物膜的結(jié)構(gòu)、抗逆性及其發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的能力進(jìn)行了初探，以期為益生菌生物膜在未來生物發(fā)酵領(lǐng)域高密度連續(xù)發(fā)酵的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基與試劑

L. paracasei 1597為浙江省食品微生物技術(shù)研究重點實驗室分離自嬰兒糞便。

MRS液體培養(yǎng)基[30]：蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母粉5.0 g、無水乙酸鈉5.0 g、檸檬酸三銨2.0 g、MgSO4·7H2O 0.58 g、K2HPO42.0 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、吐溫-80 1.0 mL，葡萄糖依據(jù)實驗要求定量添加，超純水1 000 mL，pH 6.1～6.5，121 ℃滅菌15 min。

MRS固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基加入1.5%～2.0%瓊脂，121 ℃滅菌15 min。

聚丙烯纖維膜 江蘇省江陰金鳳特種紡織品有限公司；12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Corning公司；鹽酸多巴胺、50%戊二醛溶液 上海阿拉丁試劑有限公司；L-乳酸試劑盒 愛爾蘭Megazyme公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TM3030PLUS掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；Nicolet 6700衰減全反射/傅里葉紅外光譜（attenuated total reflection/Fourier transform infrared，ATR/FT-IR）儀美國Themo Fisher公司；DropMeter A-200接觸角測定儀寧波邁時檢測科技有限公司；KQ5200超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；1260高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 聚丙烯纖維膜的多巴胺改性

將聚丙烯纖維膜剪成2 cm×2 cm的片狀正方形，在95%乙醇溶液中浸泡2 h，然后在4 mmol/L的多巴胺溶液浸泡24 h，最后取出膜片用無菌水清洗多遍，真空干燥，得到多巴胺改性的聚丙烯纖維膜，紫外滅菌后待用。

1.3.2 L. paracasei生物膜的培養(yǎng)

分別將多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜，放入多孔板中，加入4 mL MRS培養(yǎng)基，以1%的接種量接種L. paracasei，37 ℃靜置培養(yǎng)1～5 d，每24 h更換一次培養(yǎng)基。

1.3.3 掃描電子顯微鏡分析

先將培養(yǎng)1～5 d的生物膜樣品從多孔板中取出，用0.9%生理鹽水對樣品進(jìn)行漂洗，再將漂洗后的樣品用2.5%的戊二醛（0.1 mol/L、pH 7.2的磷酸緩沖液配制）固定6～8 h，經(jīng)磷酸緩沖液漂洗3 次（每次15 min）后，依次用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇逐級脫水，每次15 min，臨界點干燥，真空鍍金后用掃描電子顯微鏡觀察L. paracasei在聚丙烯纖維膜上形成生物膜的規(guī)律。

1.3.4 ATR/FT-IR分析

ATR/FT-IR的穿透深度在1 μm左右，被廣泛用于檢測薄膜材料的化學(xué)組成變化。采用Nicolet 6700 ATR/ FT-IR儀對聚丙烯纖維膜在改性前后和生物膜形成前后的表面化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。該光譜儀的內(nèi)反射元件為ZnSe晶體（本征折射率為2.42），內(nèi)反射角為45°。測量時，先將多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜以及附有生物膜的聚丙烯纖維膜充分干燥，再分別將膜緊貼晶體表面，選擇ATR模式，設(shè)置掃描精度2 cm-1、掃描次數(shù)32 次分別對膜進(jìn)行掃描，得到相應(yīng)的紅外光譜圖。

1.3.5 水接觸角測試

測試前，先將多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜以及附有生物膜的聚丙烯纖維膜充分干燥，再采用座滴法分別測量3 個樣品的水接觸角，以表征聚丙烯纖維膜改性前后以及附有生物膜后的親疏水性質(zhì)變化。具體操作如下：將樣品用雙面膠帶平整地貼于玻片表面，放置在試樣臺上，將體積為5 μL的液滴滴在膜表面，用攝像機(jī)迅速記錄下液滴變化的全過程，經(jīng)電腦擬合計算，得出樣品表面隨時間變化的接觸角。

1.3.6 L. paracasei生物膜菌體干質(zhì)量測定

先將多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜進(jìn)行稱質(zhì)量，記為M0；再將聚丙烯纖維膜放入培養(yǎng)基中進(jìn)行1～5 d的生物膜培養(yǎng)，培養(yǎng)方法同1.3.2節(jié)；然后將樣品取出，分別用生理鹽水漂洗3 遍，置于60 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，記為M1，L. paracasei生物膜菌體干質(zhì)量（ΔM）按公式（1）計算。每組有3 個平行樣品，菌體干質(zhì)量為3 個平行樣品的平均值。

1.3.7 L. paracasei生物膜抗逆性研究

將培養(yǎng)結(jié)束后的聚丙烯纖維膜（包括多巴胺改性前和改性后的聚丙烯纖維膜）用生理鹽水漂洗3 次，再放入裝有6 mL MRS的離心管中，80 ℃水浴10 min后，立即將樣品膜取出放入另一個相同的離心管中，室溫200 W超聲處理3 min[31]，取離心管中液體計菌數(shù)。對照為37 ℃條件下相同處理。按相同的方法，進(jìn)行pH 2和pH 10條件下L. paracasei生物膜的抗逆性實驗，處理溫度為37 ℃?？鼓鎸嶒灪蟮纳锬さ碾娮语@微鏡觀察方法同1.3.3節(jié)。

1.3.8 L. paracasei生物膜反應(yīng)器

1.3.8.1 L. paracasei生物膜反應(yīng)器的構(gòu)建及發(fā)酵

圖 1L. paracasei生物膜反應(yīng)器示意圖Fig. 1 Schematic diagram of L. paracasei biofilm reactor

乳酸菌生物膜反應(yīng)器如圖1所示，主要包括兩部分：儲液瓶和恒溫水浴夾套式反應(yīng)器，儲液瓶通過軟管連接至恒溫水浴夾套式生物膜反應(yīng)器。生物膜反應(yīng)器內(nèi)填充筒狀聚丙烯纖維膜，兩端加蓋密封；反應(yīng)器為夾套式，外層通入37 ℃的水以控制發(fā)酵溫度，內(nèi)層通入培養(yǎng)基，供乳酸菌生長和發(fā)酵。

與儲液瓶相連前，將多巴胺改性后的聚丙烯纖維膜卷成筒狀置于反應(yīng)器中，膜質(zhì)量與發(fā)酵液體積（60 mL）比為1∶5（g/mL）。單獨將反應(yīng)器121 ℃滅菌15 min，冷卻過夜，重復(fù)滅菌1 次，這一過程可以徹底滅活空氣中的雜菌。在裝有60 mL新鮮MRS的錐形儲液瓶中以10%的接種量接入種子培養(yǎng)液，通過蠕動泵以0.3 L/h的流速將種子培養(yǎng)液泵入生物膜反應(yīng)器內(nèi)，循環(huán)48 h完成生物膜的初步固定，每24 h更換一次新鮮培養(yǎng)基以保證菌種的活力。

生物膜形成后棄去種子培養(yǎng)基，并用新鮮MRS培養(yǎng)基沖洗反應(yīng)器，除去游離的L. paracasei，然后更換新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基，提高蠕動泵流速開始進(jìn)行生物膜發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，直到溶液中L-乳酸質(zhì)量濃度不再增加，補(bǔ)充新鮮MRS培養(yǎng)基，繼續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。實驗初始先重復(fù)以上步驟循環(huán)3 次，以保證生物膜反應(yīng)器產(chǎn)酸的穩(wěn)定性，從第4批循環(huán)開始正式發(fā)酵，每隔一定時間取樣檢測。

1.3.8.2 發(fā)酵液中L-乳酸的檢測

L-乳酸的檢測采用高效液相色譜法。色譜分離柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18反相柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）；紫外檢測器波長為210 nm；柱溫為室溫；流動相為5 mmol/L的H2SO4溶液，超聲脫氣后備用；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.8.3 發(fā)酵液中L-乳酸的檢測

L-乳酸的測量采用L-乳酸測量試劑盒。

1.3.8.4 底物質(zhì)量濃度及轉(zhuǎn)化率計算

L-乳酸產(chǎn)量為發(fā)酵末期，培養(yǎng)基中生成的L-乳酸質(zhì)量濃度/（g/L）。

轉(zhuǎn)化率為每消耗單位質(zhì)量的基質(zhì)（各種碳源底物）生成的產(chǎn)物質(zhì)量百分比，根據(jù)公式（2）計算。

生產(chǎn)率為1h內(nèi)所生成的底物的質(zhì)量濃度/（g/（L·h））。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. paracasei生物膜的電子顯微鏡觀察結(jié)果

圖2 多巴胺改性前、后聚丙烯纖維膜表面L. paracasei 生物膜的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig. 2 SEM images of L. paracasei biofilm on native and dopaminemodified polypropylene fiber membranes

由圖2可知，L. paracasei在多巴胺改性前的聚丙烯纖維膜上培養(yǎng)1～3 d時，僅有少量細(xì)菌零散的黏附在纖維上，而表面幾乎無菌附著；培養(yǎng)4～5 d后，L. paracasei也僅在聚丙烯纖維膜局部黏附，生物膜成膜效果較差。相形之下，在多巴胺改性的聚丙烯纖維膜上，L. paracasei經(jīng)過1d的培養(yǎng)即可快速形成生物膜，菌體之間緊密排列，并通過其自身分泌的胞外基質(zhì)共同黏連在載體表面，與聚丙烯纖維膜的纖維絲交織在一起。此外，在5 000 倍的放大倍率下，也可以清晰看到生物膜的特征結(jié)構(gòu)，生物膜通道（即黑色的部分），它是細(xì)胞之間的物質(zhì)傳送和信息交流的重要結(jié)構(gòu)。由此可知，聚丙烯纖維膜表面的多巴胺促進(jìn)了L. paracasei在聚丙烯纖維膜上的黏附并進(jìn)一步形成生物膜。這一結(jié)果說明材料表面的生物相容性是促進(jìn)生物膜形成重要因素之一。

FT-IR Fig. 3 ATR/FT-IR spectra of native and dopamine-modified polypropylene fiber membranes圖3 不同處理條件下的聚丙烯纖維膜ATR/

2.2 ATR/FT-IR分析如圖3所示，多巴胺改性后的聚丙烯纖維膜在3 400 cm－1出現(xiàn)相對寬而強(qiáng)的吸收峰，這是由多巴胺分子間氫鍵引起的，在1 600 cm－1處的寬強(qiáng)峰是由多巴胺在反應(yīng)過程中生成的吲哚中的C＝C伸縮振動引起的，這些初步說明聚丙烯纖維膜表面已沉積多巴胺。生物膜主要由細(xì)菌和胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）組成，而圖3C則表明了典型生物大分子EPS（多糖、蛋白質(zhì)）的存在。在3 370 cm－1處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰為細(xì)胞表面碳水化合物中結(jié)合水O—H鍵的伸縮振動特征峰[32]，從而表明生物膜EPS多糖的存在；1 646～1 546 cm－1的光譜區(qū)域是蛋白質(zhì)獨特的二級結(jié)構(gòu)[33]，即酰胺Ⅰ（C－O的伸展振動）和酰胺Ⅱ（N—H的彎曲振動與C—H伸縮振動）[32]，表明了生物膜EPS中蛋白質(zhì)的存在。綜上所述，L. paracasei在多巴胺改性后聚丙烯纖維膜上附著后，分泌大量的EPS從而形成了典型的生物膜。

2.3 接觸角分析

圖4 聚丙烯纖維膜表面的水接觸角Fig. 4 Water contact angle of native and dopamine-modifiedpolypropylene fiber membranes

接觸角是材料表面親水性的重要判據(jù)之一，反映了材料表面的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。聚丙烯纖維膜表面在改性前后及形成生物膜后的水接觸角結(jié)果如圖4所示。多巴胺改性前，膜表面的水接觸角約為133°，基本不隨時間的延長而變化。多巴胺改性后，膜表面的水接觸角有所下降，但也不隨時間延長而變化。當(dāng)多巴胺修飾聚丙烯纖維膜表面形成生物膜后，接觸角迅速下降為0°，說明膜表面形成了生物膜，生物膜內(nèi)大量羥基、羧基以及酰胺基等這些強(qiáng)親水基團(tuán)使得表面超級親水[34-35]。

2.4 培養(yǎng)時間對L. paracasei生物膜菌體干質(zhì)量的影響

圖5 培養(yǎng)時間對多巴胺改性前后聚丙烯纖維膜表面L. paracasei 生物膜菌體干質(zhì)量的影響Fig. 5 Effect of culture time on the dry weight of L. paracasei biofilm on native and dopamine-modified polypropylene fiber membranes

培養(yǎng)時間對多巴胺改性前后聚丙烯纖維膜上L. paracasei生物膜菌體干質(zhì)量的影響如圖5所示。在生物膜培養(yǎng)的前4天，2 種載體材料上生物膜菌體干質(zhì)量較之前均略有上升，第5天時，干質(zhì)量趨于平穩(wěn)。由此說明，L. paracasei在材料表面的吸附和生長需要一定的時間。在每天更換新鮮培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)時間越長，膜上黏附的L. paracasei數(shù)量越多，直到聚丙烯纖維膜上生物膜中的細(xì)菌達(dá)到動態(tài)平衡。值得注意是，多巴胺改性的聚丙烯纖維膜上生物膜菌體干質(zhì)量值明顯高于改性前的聚丙烯纖維膜，這一結(jié)果與掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果一致，驗證了材料表面的多巴胺修飾層會促進(jìn)乳酸菌的附著和生物膜的形成。

2.5 多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜上L. paracasei抗逆性

圖6 多巴胺改性前后的聚丙烯纖維膜表面L. paracasei 菌體在不同環(huán)境下的存活率Fig. 6 Survival rates of L. paracasei on native and dopamine-modified polypropylene fiber membranes in different stress environments

由圖6可知，多巴胺改性后聚丙烯纖維膜表面L. paracasei生物膜分別在80 ℃、pH 2和pH 10條件下處理10 min后，菌體存活率分別為60.12%、70.55%和52.76%，遠(yuǎn)大于多巴胺改性前聚丙烯纖維膜表面L. paracasei生物膜菌體的10.31%、12.15%、9.26%。這一結(jié)果說明材料表面引入多巴胺修飾層后，有力地促進(jìn)了L. paracasei生物膜的形成和成熟，進(jìn)而增強(qiáng)了生物膜中L. paracasei的抗逆性。

圖7 多巴胺改性聚丙烯纖維膜表面生物膜的電子顯微鏡照片F(xiàn)ig. 7 SEM images of L. paracasei biofilm on dopamine-modified polypropylene fiber membranes in different environmentsL. paracasei

生物膜的電子顯微鏡照片F(xiàn)ig. 8 SEM images of L. paracasei biofilm on polypropylene fiber membranes in different environments圖8 聚丙烯纖維膜表面L. paracasei

從圖7、8也可看出，經(jīng)過高溫和酸堿的處理，多巴胺改性后聚丙烯纖維膜表面的L. paracasei有所減少，但仍有大量L. paracasei內(nèi)嵌生長在聚丙烯纖維膜上。而未經(jīng)多巴胺改性的聚丙烯纖維膜表面和內(nèi)部幾乎無菌附著，此現(xiàn)象與菌體存活率結(jié)果一致。掃描電子顯微鏡的結(jié)果進(jìn)一步驗證了經(jīng)多巴胺改性后聚丙烯纖維膜上的L. paracasei生物膜具有良好的抗逆特性和穩(wěn)定性。

2.6 生物膜反應(yīng)器分批發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的探究

由圖9可知，在4 種不同糖質(zhì)量濃度條件下，L. paracasei基本上沒有延滯期，在1～2 h內(nèi)快速進(jìn)入產(chǎn)酸階段，伴有大量的L-乳酸生成?？焖侔l(fā)酵11 h后，L-乳酸產(chǎn)量不再上升，原因可能是在發(fā)酵過程中未使用酸中和劑，發(fā)酵液中L-乳酸質(zhì)量濃度較高，出現(xiàn)代謝產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。由此說明，L. paracasei生物膜有較好的發(fā)酵能力，采用生物膜反應(yīng)器法生產(chǎn)L-乳酸，可大大縮短發(fā)酵延滯期。

圖9 不同初始葡萄糖質(zhì)量濃度下的發(fā)酵液中L-乳酸產(chǎn)量Fig. 9 Concentration of L-lactic acid in fermentation broth with different initial glucose concentrations

表1 初始葡萄糖質(zhì)量濃度對L-乳酸發(fā)酵參數(shù)的影響Table 1 Effect of initial glucose concentration on L-lactic acid production

結(jié)合表1發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖質(zhì)量濃度小于60 g/L時，L-乳酸產(chǎn)量隨著糖質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)糖質(zhì)量濃度達(dá)到60 g/L時，L-乳酸轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、生產(chǎn)效率分別為49.3%、28.56 g/L、1.77 g/（L?h），各項參數(shù)均為最優(yōu)；當(dāng)糖質(zhì)量濃度大于60 g/L時，隨著糖質(zhì)量濃度的增加，L-乳酸轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、生產(chǎn)率有所下降，當(dāng)初始糖質(zhì)量濃度為80 g/L時，L-乳酸轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、生產(chǎn)率分別為35.1%、28.11 g/L、0.67 g/（L?h）。原因可能是，在低糖質(zhì)量濃度下，乳酸菌通過磷酸己糖途徑發(fā)酵，同型發(fā)酵轉(zhuǎn)化為異型發(fā)酵，而在高質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中，滲透壓增大，使得菌體不能正常生長和代謝[36]。因此，為了得到高的L-乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，可將初糖質(zhì)量濃度控制在60 g/L附近。

此外，由表1可知，本實驗通過乳酸菌生物膜反應(yīng)器得到的L-乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)率與文獻(xiàn)報道[9-10]相比，仍處于較低水平，分析其原因可能是在實驗中未采用中和劑對發(fā)酵過程進(jìn)行調(diào)控，出現(xiàn)酸抑制現(xiàn)象。但不可否認(rèn)的是，在未調(diào)控pH值的條件下，L-乳酸的轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)49.3%，明顯高于文獻(xiàn)報道[37]的自然條件下23.9%的轉(zhuǎn)化率，且在L-乳酸生產(chǎn)過程中，即使未經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化或基因工程等復(fù)雜手段調(diào)節(jié)，其生產(chǎn)純度仍高達(dá)99%以上，這充分體現(xiàn)了L. paracasei生物膜在生產(chǎn)高純度L-乳酸方面的巨大優(yōu)勢。

3 結(jié) 論

本實驗利用掃描電子顯微鏡、紅外光譜儀及接觸角儀對多巴胺改性聚丙烯纖維膜上形成的L. paracasei生物膜進(jìn)行表征，并對聚丙烯纖維膜經(jīng)多巴胺改性前后表面所形成的L. paracasei生物膜干質(zhì)量進(jìn)行了對比。結(jié)果表明，多巴胺作為生物分子對聚丙烯纖維膜進(jìn)行表面改性，改善了材料表面的生物相容性，有力地促進(jìn)了L. paracasei在聚丙烯纖維膜上形成生物膜，實現(xiàn)L. paracasei在聚丙烯纖維膜上的高密度固定化；此外，L. paracasei生物膜抗逆性能良好，可更好地耐受高溫和酸堿環(huán)境；L. paracasei生物膜反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸，雖然其L-乳酸轉(zhuǎn)化率和純度均達(dá)到較高水平，但其L-乳酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率仍有提高的空間；同時，L. paracasei生物膜反應(yīng)器基本沒有發(fā)酵延滯期，有效提高了生物發(fā)酵效率。這一結(jié)果為高密度連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸提供了新思路，為解決工業(yè)生產(chǎn)高純度L-乳酸提供了新方法。

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Surface Modification of Polypropylene Fiber Membranes with Dopamine to Enhance the Formation of Lactobacillus paracasei Biofilms and Its Fermentation Performance for Lactic Acid Production

ZHAO Zishu1, LI Jinian1, GUO Qian1, YE Xiangyu2, HU Mengxin1,3,*
(1. School of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310018, China; 2. Zhejiang Textile Testing and Research Institute, Hangzhou 310018, China; 3. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Food Microbial Technology, Hangzhou 310018, China)

Since dopamine can self-polymerize and adhere to the material surface in mild aqueous environments, dopamine was used for surface modification of polypropylene fiber membranes. In this paper, the effect of surface modification of polypropylene fiber membranes with dopamine on the formation of Lactobacillus paracasei biofilms was studied. The L. paracasei biofilms were characterized by scanning electron microscope, attenuated total reflectance Fourier transform infrared spectroscopy, and water contact angle measurement. The stress resistance and fermentation performance for lactic acid production were studied in detail. The results demonstrated that the dopamine layer on the surface of polypropylene fiber membranes remarkably enhanced the formation of L. paracasei biofilms. It is worth to note that as compared with the L. paracasei on polypropylene fiber membranes, L. paracasei biofilms on dopamine-modified polypropylene fiber membranes possessed higher resistance to severe environments, such as high temperature, strong acid and strong base. Besides, the purity of L-lactic acid produced by L. paracasei biofilms in a biofilm reactor was higher than 99%. The lag phase of fermentation scarcely existed, which means that high fermentation efficiency.

Lactobacillus paracasei biofilm; dopamine; polypropylene fiber membrane; biofilm reactor; L-lactic acid

10.7506/spkx1002-6630-201714011

TS210.1

A

1002-6630（2017）14-0071-07

2016-10-17

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（21004051）；中國博士后科學(xué)基金面上資助項目（2015M580500）；

浙江省博士后科研項目擇優(yōu)資助項目；浙江省教育廳科研項目（Y201018929）；

浙江省新型吸附分離材料與應(yīng)用技術(shù)重點實驗室開放基金項目（XFFL2015）；

浙江省食品科學(xué)與工程重中之重一級學(xué)科開放基金項目（JYTSP20142103）

趙子舒（1992—），女，碩士研究生，研究方向為生物發(fā)酵。E-mail：1272001120@qq.com

*通信作者：胡夢欣（1981—），女，副教授，博士，研究方向為生物固定化。E-mail：mengxinhu@zjgsu.edu.cn