謝友坪，趙旭蕊，陽需求，盧英華，鄭向南，陳劍鋒,*

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005）

脈沖式添加氮源對耐溫微藻Desmodesmus sp. F51細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響

謝友坪1，趙旭蕊1，陽需求1，盧英華2，鄭向南1，陳劍鋒1,*

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005）

考察脈沖式添加氮源培養(yǎng)對耐溫微藻Desmodesmus sp. F51細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響。結(jié)果表明，在脈沖式添加氮源培養(yǎng)過程中，藻株F51的蛋白質(zhì)含量由（560±16）mg/g降低至（456±17）mg/g，而碳水化合物和油脂含量則分別由（209±13）mg/g和（98±3） mg/g提高至（310±12）mg/g和（120±4）mg/g。另外，對色素和油脂的具體組成變化進行分析，發(fā)現(xiàn)脈沖式添加氮源培養(yǎng)可增強β-胡蘿卜素的生物合成，以及促進α-胡蘿卜素生物轉(zhuǎn)化為葉黃素，同時還可發(fā)現(xiàn)葉黃素積累與多不飽和脂肪酸含量變化呈正相關(guān)性。而在碳水化合物的具體組成分析中，發(fā)現(xiàn)碳水化合物為藻株F51主要的儲能物質(zhì)，當(dāng)脈沖式添加氮源培養(yǎng)時間為3 d時，其葡萄糖占總碳水化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可明顯提高至（75.7±1.4）%。采用脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略可明顯同時促進藻株F51葉黃素和碳水化合物的生產(chǎn)。

微藻；流加培養(yǎng)；細(xì)胞組成；葉黃素；碳水化合物

微藻具有光合作用效率高、生長速率快等特點，在某些特定培養(yǎng)條件下，微藻還可改變其細(xì)胞組成成分，從而高效積累某一細(xì)胞產(chǎn)物，如蛋白質(zhì)、碳水化合物、油脂或色素等[1-7]。其中，較高的蛋白質(zhì)含量以及合適的氨基酸組成使得微藻可被用作健康食品和飼料添加劑[6]。微藻碳水化合物組成在細(xì)胞壁外層主要為多糖，而在細(xì)胞壁內(nèi)層主要為淀粉和纖維素，因此容易被水解為可發(fā)酵糖，進而被用作生物酒精發(fā)酵的原料[1]。特別地，一些微藻油脂還含有較高含量的長鏈不飽和脂肪酸，如二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA），可被開發(fā)用作保健和醫(yī)藥產(chǎn)品[4]。而在營養(yǎng)匱乏條件下，大多數(shù)微藻油脂組成主要為十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸，因此較適合用于生物柴油的生產(chǎn)[2-3]。此外，微藻來源的多種天然色素，如類胡蘿卜素和藻膽色素等，還可被應(yīng)用于保健品和化妝品等[5]。截至目前，已有較多研究集中于微藻細(xì)胞單一成分（如蛋白質(zhì)、油脂、碳水化合物或色素等）的開發(fā)利用，并將其應(yīng)用于不同的下游領(lǐng)域。然而，在微藻生物燃料應(yīng)用方面，其生產(chǎn)成本還相對較高，目前還難以實現(xiàn)大規(guī)模的商業(yè)化開發(fā)利用[8]。為降低微藻生物燃料的開發(fā)利用成本，對微藻細(xì)胞進行多組分綜合利用，以及耦合生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品，已是其發(fā)展趨勢[8]。

葉黃素是一種含氧的類胡蘿卜素，由于具有較強的抗氧化和抗炎作用，被廣泛應(yīng)用于食品、飼料添加劑、醫(yī)藥和保健品等行業(yè)，而微藻則被認(rèn)為是商業(yè)葉黃素的新興來源[5,9]。由于葉黃素較高的應(yīng)用價值，目前在微藻葉黃素方面已有較多研究報道，如考察藻種種類、光照強度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)策略等條件對微藻葉黃素合成的影響[5,9-10]。此外，為降低微藻生物燃料的開發(fā)利用成本，一些研究表明在使用微藻粗油進行生物柴油制備過程中，還可同步進行高附加值葉黃素的偶合生產(chǎn)[11-12]。此外，也有研究者致力于將提完粗油后的藻渣（富含碳水化合物）用作生物乙醇發(fā)酵的原料[13]。然而，目前微藻培養(yǎng)可同時積累葉黃素、油脂和碳水化合物的研究還鮮有報道。Araya等[14]考察了小球藻同時生產(chǎn)葉黃素和油脂的情況，發(fā)現(xiàn)其中Chlorella vulgaris 1803的葉黃素產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率可分別達(dá)0.51、11.12 mg/（L·d），而Chlorella zofingiensis B 32的葉黃素產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率分別為0.53、10.95 mg/（L·d）。Dineshkumar等[12]通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)建模優(yōu)化小球藻Chlorella minutissima同時生產(chǎn)葉黃素和油脂的培養(yǎng)條件，最終其最高葉黃素產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率可分別達(dá)4.32、142.2 mg/（L·d）。

前期研究結(jié)果表明，微藻Desmodesmus sp. F51是較佳的葉黃素生產(chǎn)藻株，同時該藻株具有一定的耐高溫特性，十分適于熱帶和亞熱帶地區(qū)的戶外培養(yǎng)[2,15-17]。Xie Youping等[15]研究發(fā)現(xiàn)耐溫微藻Desmodesmus sp. F51需在氮源非限制條件下才會積累葉黃素，并比較了5 種不同的脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略對葉黃素生產(chǎn)的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)脈沖流加控制氮源濃度為2.2 mmol/L時，可明顯提高其葉黃素含量和產(chǎn)率，分別達(dá)（5.05±0.20） mg/g和（3.56±0.10） mg/（L·d）。然而，對于耐溫微藻Desmodesmus sp. F51的細(xì)胞組成在氮源流加過程中的變化還未有深入研究。鑒于此，本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，進一步深入考察Desmodesmus sp. F51細(xì)胞組成的變化，同時探討此策略是否也適用于微藻油脂和碳水化合物的生產(chǎn)，為開發(fā)低成本的微藻生物精煉技術(shù)提供理論參考和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

耐溫微藻Desmodesmus sp. F51由臺灣中山大學(xué)陳慶能副教授提供。

種子培養(yǎng)基為Modified Bold Basal 3N培養(yǎng)基[15]，實驗培養(yǎng)基為Modified Bristol培養(yǎng)基[15]。

無水乙醚、丙酮、乙酸銨、丁基羥基甲苯、三乙胺、甲醇、乙醇、乙腈、甲基叔丁基醚、正己烷、二十烷酸甲酯、類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1 L光生物反應(yīng)器玻璃瓶 德國Schott Duran公司；AB104N電子天平 德國Sartorius公司；U-2001紫外-可見分光光度計 日本Hitachi公司；TDL-40B低速臺式大容量離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；Li-190SA日射強度計 美國Li-COR公司；Minibeadbeater-16破碎儀美國Biospec公司；FD-1000型冷凍干燥機 上海愛郎儀器有限公司；RCT B S25型磁力攪拌器 德國IKA公司；MOT500-CO2-IR型二氧化碳檢測器 美國德康公司；1200高效液相色譜儀、GC7890氣相色譜儀美國安捷倫公司；Vario EL Ⅲ型元素分析儀 德國Elementar公司。

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

種子培養(yǎng)按Xie Youping等[15]的方法。從平板上刮取1～2 球藻體，接種于250 mL玻璃瓶中，35 ℃培養(yǎng)，300 r/min磁力攪拌，2.5% CO2-空氣混合氣，通氣量0.05 L/min，光照強度60 μmol/（m2·s），培養(yǎng)至OD685nm為3.5。

1.3.2 脈沖式添加氮源培養(yǎng)

脈沖式添加氮源培養(yǎng)按Xie Youping等[15]的方法。將種子接種于1 L玻璃瓶中，接種量9%，400 r/min磁力攪拌，通氣量0.2 L/min，光照強度600 μmol/（m2·s），其余條件同上。當(dāng)初始氮源濃度耗盡時，開始脈沖流加濃度為880 mmol/L的硝酸鈉溶液，使得培養(yǎng)液中氮源濃度達(dá)到2.2 mmol/L。待氮源耗盡時，再次開始脈沖流加氮源。

1.3.3 生物量的測定

待測藻液適當(dāng)稀釋后測定OD685nm。用已稱質(zhì)量的醋酸纖維素膜（孔徑0.45 μm，直徑47 mm）過濾50 mL待測藻液，濾膜置于105 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，根據(jù)過濾前后濾膜的干質(zhì)量得藻體細(xì)胞干質(zhì)量。在氮源充足的條件下，藻體生物質(zhì)濃度X（g/L）與其在特定波長下的光密度呈線性關(guān)系[8]，可得回歸方程X=0.315OD685nm-0.024（R2=0.988）。根據(jù)公式（1）計算藻體的生物量產(chǎn)率。

式中：Pbiomass為藻體生物量產(chǎn)率/（g/（L·d））；ΔX為Δt時間內(nèi)藻體的生物量濃度差/（g/L）；Δt為藻體培養(yǎng)時間差/d。

1.3.4 硝酸鈉濃度的測定

硝酸鈉濃度測定按Chiu等[18]的方法。NO3－在220 nm波長處有最大吸收值，因此用紫外分光光度法測定培養(yǎng)基中硝酸鈉濃度。

1.3.5 細(xì)胞元素組成和蛋白含量的測定

準(zhǔn)確稱取5 mg干藻體，使用Vario EL Ⅲ型元素分析儀測定藻體中的C、N、S和H元素含量，并根據(jù)公式（2）計算藻體蛋白質(zhì)含量[19]。

式中：P為藻體蛋白質(zhì)含量/%；Nnitrogen為藻體N元素含量/%。

1.3.6 類胡蘿卜素含量及組成的測定

類胡蘿卜素含量及組成測定按Xie Youping等[15]的方法。待測藻液6 000 r/min離心2 min，倒去上清液，用等量去離子水清洗2 次后，藻體冷凍干燥。準(zhǔn)確稱取10 mg干藻體，置于2 mL離心管中，加入1 mL 60% KOH溶液和0.5 g研磨珠，用破碎儀破碎7 min，于40 ℃水浴40 min，加入2 mL無水乙醚萃取類胡蘿卜素，重復(fù)萃取直至乙醚層無色。用氮氣將乙醚萃取液吹干，加入3 mL丙酮重懸，用高效液相色譜儀測定重懸液中類胡蘿卜素含量及組成。

1.3.7 葉綠素質(zhì)量濃度的測定

采用Hansmann等[20]報道的方法測定藻體葉綠素含量。準(zhǔn)確稱取5 mg干藻體，置于15 mL離心管中，加入8 mL 90%丙酮和0.5 g研磨珠，使用破碎儀破碎7 min。將處理后的樣品6 000 r/min離心2 min，所得上清液經(jīng)90%丙酮適當(dāng)稀釋后，使用紫外分光光度計分別測定OD665nm、OD645nm和OD630nm值。藻體中葉綠素a、b、c的質(zhì)量濃度（ρ）分別按公式（3）～（5）計算。

1.3.8 油脂含量及脂肪酸組成的測定

油脂含量及脂肪酸組成測定按Ho等[3]的方法。準(zhǔn)確稱取40 mg干藻體置于15 mL離心管中，加入8 mL 0.5 mol/L 的氫氧化鉀/乙醇溶液，混勻，使用破碎儀破碎7 min。將破碎處理后的樣品置于100 ℃水浴條件下皂化15 min，冷卻至室溫。然后，加入8 mL 0.7 mol/L的鹽酸-甲醇溶液和10 mL 14%三氟化硼的甲醇溶液，混勻，于100 ℃水浴條件下酯化反應(yīng)15 min，冷卻后加入5 mL正己烷和50 μL 40 g/L的二十烷酸甲酯，混勻振蕩，接著加入2 mL飽和氯化鈉溶液防止乳化，靜置分層后取上層正己烷相并加入無水硫酸鈉脫水，最后使用0.22 μm有機濾膜過濾后進行氣相色譜分析。

1.3.9 碳水化合物含量及其組成的測定

碳水化合物含量及其組成測定按Ho等[3]的方法。準(zhǔn)確稱取15.0 mg干藻體，置于2 mL離心管中，加入1 mL 72% H2SO4溶液和0.5 g研磨珠，使用破碎儀破碎7 min后，在30 ℃條件下水浴1 h。將混合液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，再加入17 mL蒸餾水稀釋至4% H2SO4，在121 ℃條件下滅菌20 min?；旌弦涸? 000 r/min離心2 min，采用苯酚-硫酸法測定上清液中碳水化合物含量。取5 mL上清液，加入0.5 g碳酸鈣中和溶液中的硫酸，之后8 000 r/min離心5 min，最后使用0.22 μm醋酸纖維濾膜過濾后，用高效液相色譜測定碳水化合物組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 Desmodesmus sp. F51細(xì)胞組成隨流加培養(yǎng)時間的變化趨勢

圖 1Desmodesmus sp. F51細(xì)胞生長、氮源消耗及細(xì)胞組成隨脈沖式添加氮源培養(yǎng)時間的變化趨勢Fig. 1 Time-course profiles of biomass concentration, nitrate concentration and biomolecule composition of Desmodesmus sp. F51 under nitrate pulse-feeding cultivation

前期研究通過脈沖流加控制不同的氮源濃度（1.1、2.2、4.4、8.8、17.6 mmol/L），考察了脈沖式添加氮源培養(yǎng)對藻株F51葉黃素生產(chǎn)的影響，結(jié)果表明當(dāng)脈沖流加控制氮源濃度為2.2 mmol/L時，藻株F51具有最佳的葉黃素生產(chǎn)能力[15]。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步分析了其細(xì)胞組成變化。

表1 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞元素含量的影響Table 1 Effect of nitrate pulse feeding on cellular elemental composition of Desmodesmus sp. F51

由圖1可知，對于不同流加培養(yǎng)時間所獲得的藻體，其細(xì)胞組成主要為蛋白質(zhì)、碳水化合物、油脂和色素，而前三者可占到總細(xì)胞組成的80%～90%。隨流加培養(yǎng)時間的延長，藻株F51的蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)緩慢降低的趨勢，由（560±16） mg/g降低至（456±17） mg/g。同時還可發(fā)現(xiàn)，在脈沖式添加氮源培養(yǎng)2 d后，藻株F51的細(xì)胞生長速率和氮源消耗速率逐漸下降，這可能是由于培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)源被耗盡導(dǎo)致。由表1可知，藻株F51細(xì)胞的硫元素含量隨流加培養(yǎng)時間延長由1.76%降低至0.60%，該結(jié)果表明培養(yǎng)基中的硫元素可能已逐漸處于缺乏或低濃度狀態(tài)。相關(guān)研究表明，當(dāng)某些必須營養(yǎng)源的濃度低于其臨界值時，藻細(xì)胞將會感應(yīng)并表達(dá)一系列特定基因來改變其生理機能，以適應(yīng)營養(yǎng)缺乏的環(huán)境[7]。而在硫缺乏條件下，藻體將會降解其細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽和蛋白質(zhì)以保證其對硫的需求[21]。

如圖1所示，通過氮源脈沖流加培養(yǎng)策略，藻株F51的碳水化合物和油脂含量可分別由（209±13）、（98±3）mg/g提高至（310±12）、（120±4）mg/g。而Ho等[2]發(fā)現(xiàn)藻株F51在氮源限制條件下其碳水化合物和油脂含量可分別達(dá)到440 mg/g和425 mg/g左右。分析原因可能是由于微藻只有在氮源限制條件下才會明顯引起其代謝變化，從蛋白質(zhì)合成轉(zhuǎn)向非含氮儲能物質(zhì)的合成，如三酰甘油酯和淀粉[6]。而其他營養(yǎng)源的限制（如硫限制），在一定程度上也會促進藻體油脂和碳水化合物的積累，但其效果要明顯低于氮源限制的情況[7]。

2.2 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞色素組成的影響

如圖2所示，藻株F51的類胡蘿卜素組成主要為紫黃素、新黃素、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。其中，葉黃素為藻株F51最主要的類胡蘿卜素，可占總類胡蘿卜素組成的50%～60%。相關(guān)研究表明，對于大多數(shù)綠藻來說，其葉黃素可占到總類胡蘿卜素組成的60%左右，主要是由于葉黃素在組成和穩(wěn)定捕光復(fù)合物（LHC-Ⅱ三聚體）過程中起到重要作用[22]。同時，還可發(fā)現(xiàn)隨脈沖式添加氮源培養(yǎng)時間的延長，藻株F51的總類胡蘿卜和葉綠素含量均呈現(xiàn)先上升而后下降的趨勢。分析原因可能是由于在流加培養(yǎng)初期，由于藻體生物量的逐漸提高，使得單位藻體所獲得的光照強度逐漸降低，這時藻細(xì)胞就需要表達(dá)更多色素來捕獲光能[23]。而在之后，由于培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)源（如硫元素）的缺乏，使得藻體色素含量開始下降。Giordano等[24]研究表明硫元素缺乏會對藻體光合機構(gòu)的電子傳遞產(chǎn)生影響，從而降低其光合作用效率。

圖2 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51類胡蘿卜素含量及其組成的影響Fig. 2 Effect of nitrate pulse feeding on carotenoids content and composition of Desmodesmus sp. F51

圖3 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51葉綠素含量及其組成的影響Fig. 3 Effect of nitrate pulse feeding on chlorophylls content and composition of Desmodesmus sp. F51

如圖2和圖3所示，隨脈沖式添加氮源培養(yǎng)時間的延長，藻株F51的葉綠素組成無明顯變化，但其葉黃素和β-胡蘿卜素占總類胡蘿卜素的百分含量可分別由51.6%和7.9%提高至61.6%和10.4%，而α-胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)由7.5%降低至1.3%。該結(jié)果表明，使用脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略有利于促進葉黃素和β-胡蘿卜素的生物合成。分析原因可能是由于當(dāng)一些營養(yǎng)源處于缺乏或低濃度狀態(tài)時，藻體細(xì)胞內(nèi)將容易產(chǎn)生活性氧，而葉黃素和β-胡蘿卜素在防止光合機構(gòu)氧化損傷中起到重要作用，但當(dāng)這一環(huán)境壓力超過藻體自身的適應(yīng)能力時就會導(dǎo)致藻細(xì)胞活力下降而死亡[25-26]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)基中的S處于缺乏或低濃度狀態(tài)時，藻體的類胡蘿卜素/葉綠素比例會明顯提高[7]。而這也與本研究所獲得的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)在脈沖式添加氮源培養(yǎng)條件下，藻株F51的類胡蘿卜素與葉綠素比例可由0.20逐漸提高至0.23。

2.3 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞脂肪酸組成的影響

圖4 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞脂肪酸組成的影響Fig. 4 Effect of nitrate pulse feeding on fatty acid composition of Desmodesmus sp. F51

如圖4所示，在藻株F51的脂肪酸組成中，棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亞油酸（C18:2）和亞麻酸（C18:3）為含量最多的5種脂肪酸，可占到總脂肪酸含量的55%～60%。其中，藻株F51的棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1）含量在脈沖式添加氮源培養(yǎng)初期逐漸降低，但在脈沖式添加氮源培養(yǎng)2 d后（即氮源消耗速率明顯減緩時）呈上升趨勢。相反地，對于大部分多不飽和脂肪酸，如亞油酸（C18:2）和亞麻酸（C18:3），卻呈現(xiàn)先上升而后下降的趨勢。一些研究表明，中性脂質(zhì)三?；视蜑樵弩w主要的貯存脂質(zhì)，并且其酰基大多為飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸，如棕櫚酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）等，而極性脂質(zhì)的?；蠖酁殚L鏈多不飽和脂肪酸[27-28]。極性脂質(zhì)大多位于微藻細(xì)胞膜，其含量的提高可增加細(xì)胞膜的流動性，從而改善電子傳遞效率，最終提高藻體的光合作用效率[4,28]。而當(dāng)營養(yǎng)源缺乏時，微藻細(xì)胞膜開始逐漸惡化，其極性脂質(zhì)含量逐漸降低，藻細(xì)胞開始積累貯存脂質(zhì)（三?；视停27]。因此可知，在脈沖式添加氮源培養(yǎng)初期，由于單位藻體所獲得的光照強度逐漸降低，這時藻體更趨于合成多不飽和脂肪酸來改善光合作用效率，而當(dāng)培養(yǎng)基中一些營養(yǎng)源（如硫元素）缺乏或處于低濃度時，藻體才開始積累飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸。

另外，有研究表明，藻體類胡蘿卜素主要是以類胡蘿卜素酯的形式存在于細(xì)胞中，其中次級類胡蘿卜（如蝦青素等）的積累與棕櫚酸（C16:0）和油酸（C18:1）含量變化呈正相關(guān)[29-30]。而藻株F51在脈沖式添加氮源培養(yǎng)條件下，其類胡蘿卜素組成主要為初級類胡蘿卜素（葉黃素），因此可發(fā)現(xiàn)其含量變化與棕櫚酸（C16:0）和油酸（C18:1）含量變化呈負(fù)相關(guān)，而與多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）含量變化呈正相關(guān)（圖2、4）。一些研究也表明，葉黃素和玉米黃素在防止類囊體膜油脂的過氧化過程中起重要作用[31]。因此，藻株F51的葉黃素合成和多不飽和脂肪酸合成可能存在一定聯(lián)系，但具體的作用機制還有待進一步研究。

2.4 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞碳水化合物組成的影響

圖5 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51細(xì)胞碳水化合物含量及其組成的影響Fig. 5 Effect of nitrate pulse feeding on carbohydrate content and composition of Desmodesmus sp. F51

如圖5所示，藻株F51的碳水化合物組成主要為葡萄糖，可占總碳水化合物組成的50%以上。較多研究也表明，微藻細(xì)胞在其細(xì)胞壁和葉綠體中含有大量的碳水化合物，主要為纖維素、可溶性多糖和淀粉，因此其組成大部分為葡萄糖[1,3]。而Ho等[3]研究還發(fā)現(xiàn)微藻Scenedesmus obliquus CNW-N的碳水化合物組成除葡萄糖外，還含有少量的木糖和半乳糖。

在脈沖式添加氮源培養(yǎng)的第0天和第1天，藻株F51的碳水化合物含量及其葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化不明顯，但之后隨流加培養(yǎng)時間的延長，可分別由（209±13）mg/g和（51.4±1.2）%明顯提高至（310±12）mg/g和（75.7±1.4）%。這主要是由于在流加培養(yǎng)2 d后，培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)源（如硫元素）處于缺乏或低濃度狀態(tài)，使得藻細(xì)胞的生長速率和氮源消耗速率開始呈現(xiàn)下降趨勢（圖1），這時藻細(xì)胞更傾向于積累合成儲能物質(zhì)來適應(yīng)外界環(huán)境壓力[7]。相關(guān)研究表明，淀粉為大多數(shù)微藻主要的儲能碳水化合物，并且其合成與油脂合成共用相同的前體物質(zhì)[3]。對于大多數(shù)微藻來說（特別是綠藻），在營養(yǎng)缺乏的初始階段，主要是合成淀粉來作為儲能物質(zhì)，而只有當(dāng)營養(yǎng)源（特別是氮源）缺乏較長時間時，藻細(xì)胞才會由淀粉合成轉(zhuǎn)變?yōu)楦邇δ芪镔|(zhì)油脂的合成[3,7]。因此，可發(fā)現(xiàn)在脈沖式添加氮源培養(yǎng)過程中，藻株F51的碳水化合物增加量要明顯高于油脂，并且其葡萄糖（淀粉）質(zhì)量分?jǐn)?shù)也呈明顯上升趨勢。

2.5 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51生物量產(chǎn)率、葉黃素產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化物產(chǎn)率的影響

表2 脈沖式添加氮源培養(yǎng)對Desmodesmus sp. F51的生物量產(chǎn)率、葉黃素產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率的影響Table 2 Effect of nitrate pulse feeding on biomass, lutein, carbohydrate and lipid productivity of Desmodesmus sp. F51

對于微藻培養(yǎng)來說，其產(chǎn)物含量和生物量產(chǎn)率是重要指標(biāo)。而本研究主要是綜合考慮產(chǎn)物含量和生物量產(chǎn)率這兩個因素，以產(chǎn)物產(chǎn)率作為指標(biāo)來考察藻株的生產(chǎn)能力。如表2所示，隨流加培養(yǎng)時間的延長，Desmodesmus sp. F51的生物量產(chǎn)率逐漸下降，這可能是由于藻體生物量的提高導(dǎo)致光遮蔽效應(yīng)逐漸增強，從而降低藻細(xì)胞生長速率。在脈沖式添加氮源培養(yǎng)過程中，Desmodesmus sp. F51的葉黃素產(chǎn)率、碳水化合物產(chǎn)率和油脂產(chǎn)率均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，在脈沖式添加氮源培養(yǎng)時間為2 d時，其葉黃素產(chǎn)率和碳水化物產(chǎn)率達(dá)最大值，分別為3.56 mg/（L·d）和204 mg/（L·d）。

表3 光自養(yǎng)條件下Desmodesmus sp. F51的生物量產(chǎn)率、葉黃素產(chǎn)率、油脂產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率與文獻結(jié)果的比較Table 3 Comparison of biomass, lutein, carbohydrate and lipid productivity of Desmodesmus sp. F51 with those of other microalgal species reported in the literature under phototrophic cultivation mg/（L·d）

如表3所示，通過脈沖式添加氮源培養(yǎng)，Desmodesmus sp. F51的生物量產(chǎn)率要高于大部分文獻報道的結(jié)果，但其油脂產(chǎn)率卻明顯低于文獻報道值。這主要是由于大多數(shù)文獻是采用氮源匱乏培養(yǎng)策略來促進微藻油脂含量的積累[2-3,32]，但同時該策略也會導(dǎo)致微藻生物量產(chǎn)率和葉黃素含量的降低[15]。因此，可發(fā)現(xiàn)微藻生物量產(chǎn)率及葉黃素含量與油脂含量之間往往存在相反的變化趨勢。類似地，Araya等[14]也發(fā)現(xiàn)當(dāng)以葉黃素為主要目標(biāo)產(chǎn)物時，其微藻油脂產(chǎn)率要明顯低于氮源匱乏培養(yǎng)策略所得結(jié)果。而在脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略下，培養(yǎng)液中的氮源濃度一直保持較充足狀態(tài)，但隨培養(yǎng)時間的延長，其他營養(yǎng)源（如硫元素）將逐漸處于缺乏或低濃度狀態(tài)，使得微藻Desmodesmus sp. F51主要以積累碳水化合物作為初級儲能物質(zhì)（圖5）。因此，可發(fā)現(xiàn)通過該策略不僅可明顯提高微藻Desmodesmus sp. F51的葉黃素含量及產(chǎn)率[15]，同時還可促進碳水化合物的積累，其碳水化合物產(chǎn)率可達(dá)204 mg/（L·d），且高于大多數(shù)文獻報道結(jié)果（表3）。雖然目前已有較多研究致力于微藻細(xì)胞單一產(chǎn)物的積累表達(dá)，但微藻可同時積累表達(dá)葉黃素和碳水化合物的研究還鮮有報道。特別地，已有報道研究表明可同步實現(xiàn)微藻生物柴油和葉黃素產(chǎn)品的偶合生產(chǎn)[11-12]，同時也可將提完粗油后的藻渣（富含碳水化合物）用作生物乙醇發(fā)酵的原料[13]。鑒于此，對于通過脈沖式添加氮源培養(yǎng)所得藻體，在進行完葉黃素和油脂萃取后，萃余物還可進一步用于微生物酒精發(fā)酵，這可為后續(xù)開發(fā)低成本的微藻生物精煉技術(shù)提供一定技術(shù)支持。

3 結(jié) 論

本實驗結(jié)果表明：在脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略下，藻株F51葉黃素含量變化與多不飽和脂肪酸（亞油酸和亞麻酸）含量變化呈正相關(guān)趨勢，同時培養(yǎng)基中的其他營養(yǎng)源（如硫元素）逐漸處于缺乏或低濃度狀態(tài)，使得藻株F51主要以合成碳水化合物來作為儲能物質(zhì)，而其葡萄糖占總碳水化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也可由51.4%明顯提高至75.7%。采用脈沖式添加氮源培養(yǎng)策略，可明顯同時促進藻株F51葉黃素和碳水化合物的積累表達(dá)，其生物量產(chǎn)率、葉黃素產(chǎn)率和碳水化合物產(chǎn)率可分別達(dá)706、3.56 mg/（L·d）和204 mg/（L·d），且高于大多數(shù)文獻報道結(jié)果。因此，對于通過脈沖式添加氮源培養(yǎng)所得藻體，在進行完葉黃素和油脂萃取后，萃余物（富含碳水化合物）還可進一步用作微生物酒精發(fā)酵的原料。本實驗結(jié)果可為后續(xù)開發(fā)低成本的微藻生物精煉技術(shù)提供一定技術(shù)支持。

[1] CHEN C Y, ZHAO X Q, YEN H W, et al. Microalgae-based carbohydrates for biofuel production[J]. Biochemical Engineering Journal, 2013, 78: 1-10. DOI:10.1016/j.bej.2013.03.006.

[2] HO S H, LAI Y Y, CHIANG C Y, et al. Selection of elite microalgae for biodiesel production in tropical conditions using a standardized platform[J]. Bioresource Technology, 2013, 147: 135-142. DOI:10.1016/j.biortech.2013.08.028.

[3] HO S H, CHEN C Y, CHANG J S. Effect of light intensity and nitrogen starvation on CO2fixation and lipid/carbohydrate production of an indigenous microalga Scenedesmus obliquus CNW-N[J]. Bioresource Technology, 2012, 113: 244-252. DOI:10.1016/ j.biortech.2011.11.133.

[4] CHEN C Y, CHEN Y C, HUANG H C, et al. Engineering strategies for enhancing the production of eicosapentaenoic acid (EPA) from an isolated microalga Nannochloropsis oceanica CY2[J]. Bioresource Technology, 2013, 147: 160-167. DOI:10.1016/ j.biortech.2013.08.051.

[5] del CAMPO J A, GARCIA-GONZALEZ M, GUERRERO M G. Outdoor cultivation of microalgae for carotenoid production: current state and perspectives[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74(6): 1163-1174. DOI:10.1007/s00253-007-0844-9.

[6] WANG L, LI Y, SOMMERFELD M, et al. A flexible culture process for production of the green microalga Scenedesmus dimorphus rich in protein, carbohydrate or lipid[J]. Bioresource Technology, 2013, 129: 289-295. DOI:10.1016/j.biortech.2012.10.062.

[7] PROCHAZKOVA G, BRANYIKOVA I, ZACHLEDER V, et al. Effect of nutrient supply status on biomass composition of eukaryotic green microalgae[J]. Journal of Applied Phycology, 2014, 26(3): 1359-1377. DOI:10.1007/s10811-013-0154-9.

[8] MARKOU G, NERANTZIS E. Microalgae for high-value compounds and biofuels production: a review with focus on cultivation under stress conditions[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(8): 1532-1542. DOI:10.1016/j.biotechadv.2013.07.011.

[9] 吳正云, 史賢明, 曾娟. 微藻生物合成葉黃素的研究進展[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 268-273.

[10] FERNANDEZ-SEVILLA J M, FERNANDEZ F G A, GRIMA E M. Biotechnological production of lutein and its applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 86(1): 27-40. DOI:10.1007/ s00253-009-2420-y.

[11] PROMMUAK C, PAVASANT P, QUITAIN A T, et al. Simultaneous production of biodiesel and free lutein from Chlorella vulgaris[J]. Chemical Engineering & Technology, 2013, 36(5): 733-739. DOI:10.1002/ceat.201200668.

[12] DINESHKUMAR R, DASH S K, SEN R. Process integration for microalgal lutein and biodiesel production with concomitant flue gas CO2sequestration: a biorefinery model for healthcare, energy and environment[J]. RSC Advances, 2015, 5(90): 73381-73394. DOI:10.1039/c5ra09306f.

[13] LEE O K, OH Y K, LEE E Y. Bioethanol production from carbogydrate-enriched residual biomass obtained after lipid extraction of Chlorella sp. KR-1[J]. Bioresource Technology, 2015, 196: 22-27. DOI:10.1016/j.biortech.2015.07.040.

[14] ARAYA B, GOUVEIA L, NOBRE B, et al. Evaluation of the simultaneous production of lutein and lipids using a vertical alveolar panel bioreactor for three Chlorella species[J]. Algal Research, 2014, 6: 218-222. DOI:10.1016/j.algal.2014.06.003.

[15] XIE Y P, HO S H, CHEN C N N, et al. Phototrophic cultivation of a thermo-tolerant Desmodesmus sp. for lutein production: effects of nitrate concentration, light intensity and fed-batch operation[J]. Bioresource Technology, 2013, 144: 435-444. DOI:10.1016/ j.biortech.2013.06.064.

[16] XIE Y, HO S H, CHEN C Y, et al. Simultaneous enhancement of CO2fixation and lutein production with thermo-tolerant Desmodesmus sp. F51 using a repeated fed-batch cultivation strategy[J]. Biochemical Engineering Journal, 2014, 86: 33-40. DOI:10.1016/j.bej.2014.02.015.

[17] 謝友坪, 陽需求, 陳劍鋒, 等. 室內(nèi)外培養(yǎng)對耐溫微藻Desmodesmus sp. F51細(xì)胞生長和葉黃素積累的影響[J]. 過程工程學(xué)報, 2016, 16(4): 86-92.

[18] CHIU S Y, KAO C Y, TSAI M T, et al. Lipid accumulation and CO2utilization of Nannochloropsis oculata in response to CO2aeration[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(2): 833-838. DOI:10.1016/ j.biortech.2008.06.061.

[19] BECKER E W. Microalgae: biotechnology and microbiology[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1994.

[20] HANSMANN E. Handbook of phycological methods: culture methods and growth measurements[M]. Cambridge: Cambridge University Press, 1973.

[21] CARFAGNA S, SALBITANI G, VONA V, et al. Changes in cysteine and O-acetyl-L-serine levels in the microalga Chlorella sorokiniana in response to the S-nutritional status[J]. Journal of Plant Physiology, 2011, 168(18): 2188-2195. DOI:10.1016/j.jplph.2011.07.012.

[22] BISHOP N I. The β,ε-carotenoid, lutein, is specifically required for the formation of the oligomeric forms of the light harvesting complex in the green alga, Scenedesmus obliquus[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 1996, 36(3): 279-283. DOI:10.1016/ S1011-1344(96)07381-2.

[23] MARKOU G, CHATZIPAVLIDIS I, GEORGAKAKIS D. Effects of phosphorus concentration and light intensity on the biomass composition of Arthrospira (Spirulina) platensis[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2012, 28(8): 2661-2670. DOI:10.1007/s11274-012-1076-4.

[24] GIORDANO M, PEZZONI V, HELL R. Strategies for the allocation of resources under sulfur limitation in the green alga Dunaliella salina[J]. Plant Physiology, 2000, 124(2): 857-864. DOI:10.1104/ pp.124.2.857.

[25] JAHNS P, HOLZWARTH A R. The role of the xanthophyll cycle and of lutein in photoprotection of photosystem Ⅱ[J]. Biochimica et Biophysica Acta-Bioenergetics, 2012, 1817(1): 182-193. DOI:10.1016/j.bbabio.2011.04.012.

[26] TELFER A. What is beta-carotene doing in the photosystem Ⅱreaction centre?[J]. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, Series B, 2002, 357: 1431-1440.

[27] HU Q, SOMMERFELD M, JARVIS E, et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and advances[J]. Plant Journal, 2008, 54(4): 621-639. DOI:10.1111/j.1365-313X.2008.03492.x.

[28] DUNSTAN G A, VOLKMAN J K, BARRETT S M, et al. Changes in the lipid composition and maximisation of the polyunsaturated fatty acid content of three microalgae grown in mass culture[J]. Journal of Applied Phycology, 1993, 5: 71-83. DOI:10.1007/BF02182424.

[29] LAMERS P P, van DE LAAK C C, KAASENBROOD P S, et al. Carotenoid and fatty acid metabolism in light-stressed Dunaliella salina[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2010, 106(4): 638-648. DOI:10.1002/bit.22725.

[30] ZHEKISHEVA M, BOUSSIBA S, KHOZIN-GOLDBERG I, et al. Accumulation of oleic acid in Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated with that of astaxanthin esters[J]. Journal of Phycology, 2002, 38(2): 325-331. DOI:10.1046/j.1529-8817.2002.01107.x.

[31] JOYARD J, TEYSSIER E, MI?GE C, et al. The biochemical machinery of plastid envelope membranes[J]. Plant Physiology, 1998, 118(3): 715-723. DOI:10.1104/pp.118.3.715.

[32] ZHU S, HUANG W, XU J, et al. Metabolic changes of starch and lipid triggered by nitrogen starvation in the microalga Chlorella zofingiensis[J]. Bioresource Technology, 2014, 152: 292-298. DOI:10.1016/j.biortech.2013.10.092.

[33] DRAGONE G, FERNANDES B D, ABREU A P, et al. Nutrient limitation as a strategy for increasing starch accumulation in microalgae[J]. Applied Energy, 2011, 88(10): 3331-3335. DOI:10.1016/j.apenergy.2011.03.012.

Effect of Nitrate Pulse-Feeding Cultivation on Cell Growth and Cell Composition of Thermo-Tolerant Desmodesmus sp. F51

XIE Youping1, ZHAO Xurui1, YANG Xuqiu1, LU Yinghua2, ZHENG Xiangnan1, CHEN Jianfeng1,*
(1. College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Xiamen University, Xiamen 361005, China)

The aim of the present study was to investigate the effect of nitrate pulse feeding on the cell growth and cell composition of Desmodesmus sp. F51. Under nitrate pulse-feeding cultivation, the protein content of cells of Desmodesmus sp. F51 decreased from (560 ± 16) mg/g to (456 ± 17) mg/g, while the contents of carbohydrate and lipid increased from (209 ± 13) mg/g to (310 ± 12) mg/g and (98 ± 3) mg/g to (120 ± 4) mg/g, respectively. By investigating the changes in carotenoid, lipid and carbohydrate compositions, it appeared that nitrate pulse feeding could promote β-carotene biosynthesis and enhance the bioconversion of α-carotene to lutein. Lutein accumulation was positively associated with polyunsaturated fatty acid formation. Desmodesmus sp. F51 tended to accumulate carbohydrate as an energy storage product after 3 days of cultivation under nitrate pulse-feeding conditions, and the major accumulated monosaccharide was glucose (75.7 ± 1.4)%. Therefore, the nitrate-pulse feeding strategy is a highly promising approach to simultaneously produce lutein and carbohydrate in Desmodesmus sp. F51.

microalgae; fed-batch culture; cell composition; lutein; carbohydrate

10.7506/spkx1002-6630-201714010

Q939.97

A

1002-6630（2017）14-0064-07

謝友坪, 趙旭蕊, 陽需求, 等. 脈沖式添加氮源對耐溫微藻Desmodesmus sp. F51細(xì)胞生長和細(xì)胞組成的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 64-70.

10.7506/spkx1002-6630-201714010. http://www.spkx.net.cn

XIE Youping, ZHAO Xurui, YANG Xuqiu, et al. Effect of nitrate pulse-feeding cultivation on cell growth and cell composition of thermo-tolerant Desmodesmus sp. F51[J]. Food Science, 2017, 38(14): 64-70. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714010. http://www.spkx.net.cn

2016-09-07

國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項目（41641050）；福建省青年科技人才創(chuàng)新基金資助項目（2016J05077）；福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項（閩海洋高新[2016]15號）；福州市市校（院所）科技合作項目（2015-G-69）

謝友坪（1986—），男，助理研究員，博士，研究方向為生物化工。E-mail：ypxie@fzu.edu.cn

*通信作者：陳劍鋒（1968—），男，教授，博士，研究方向為生物化工。E-mail：jfchen@fzu.edu.cn