張 穎，烏日娜,2,*，孫慧君,3，武俊瑞，陶冬冰，王洪玉

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)?，F(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)系，遼寧 錦州 121001）

豆醬不同發(fā)酵階段細(xì)菌群落多樣性及動態(tài)變化分析

張 穎1，烏日娜1,2,*，孫慧君1,3，武俊瑞1，陶冬冰1，王洪玉1

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866；2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3.遼寧省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)校現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)系，遼寧 錦州 121001）

以東北傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬為研究對象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)結(jié)合高通量測序方法分析豆醬發(fā)酵過程中細(xì)菌的多樣性及動態(tài)變化。結(jié)果顯示，細(xì)菌的可操作分類單元數(shù)值在發(fā)酵過程中上下波動，并在后發(fā)酵第21天時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)細(xì)菌數(shù)目最多；整理分析PCR-DGGE圖譜鑒定結(jié)果以及細(xì)菌在屬水平上的分布得出，明串珠菌屬、腸球菌屬、四聯(lián)球菌屬和乳桿菌屬為豆醬樣品不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬，其中四聯(lián)球菌屬波動性較大，易受內(nèi)外環(huán)境的影響；屎腸球菌、明串珠菌屬、綠色魏斯菌隨著發(fā)酵時(shí)間的延長在減少，說明這些細(xì)菌主要參與豆醬發(fā)酵初期產(chǎn)酶分解物質(zhì)過程，并在整個發(fā)酵過程中起到調(diào)整發(fā)酵內(nèi)環(huán)境等作用。

東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬；PCR-DGGE；微生物多樣性測序；優(yōu)勢細(xì)菌菌屬；可操作分類單元

引文格式：張穎, 烏日娜, 孫慧君, 等. 豆醬不同發(fā)酵階段細(xì)菌群落多樣性及動態(tài)變化分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 30-35.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714005. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Ying, WU Rina, SUN Huijun, et al. Diversity and dynamic changes of the bacterial community during fermentation of soybean paste[J]. Food Science, 2017, 38(14): 30-35. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714005. http://www.spkx.net.cn

傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬是以大豆為原料，經(jīng)過煮制、擠壓成塊、制曲、發(fā)酵而成[1]，其色澤為紅褐色或棕褐色，有光澤，有明顯的醬香和酯香，咸淡適口，呈半流動狀態(tài)[2]。東北傳統(tǒng)豆醬的做法：將挑好洗凈的東北大豆蒸煮6 h，絞碎豆粒制成6 cm×5 cm×5 cm的長方體，置于陽光下發(fā)酵2 個月待干燥后用報(bào)紙或紗布包好繼續(xù)發(fā)酵1 個月成曲；洗掉成曲上的菌絲體后將其切成小塊與一定比例的鹽和水一并放入缸中進(jìn)行后期發(fā)酵，早晚各攪拌一次直至發(fā)酵成熟[3]。豆醬作為主要發(fā)酵豆制品之一，可以助消化，促進(jìn)人體造血、提高肝臟的解毒功能、降低血脂、預(yù)防癌癥發(fā)生[4]。豆醬的品質(zhì)與營養(yǎng)是通過原料和環(huán)境中的多種微生物的協(xié)同作用[8]以及利用碳源、氮源等經(jīng)過一系列生化反應(yīng)所產(chǎn)生的，但目前對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬的研究中，主要集中在發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、流變學(xué)特性及質(zhì)地評價(jià)、風(fēng)味物質(zhì)萃取的條件等[5-7]。因此深入研究傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵不同階段微生物的多樣性和菌群動態(tài)，掌握微生物的生長規(guī)律，為改善工業(yè)豆醬品質(zhì)，發(fā)酵菌株進(jìn)行系統(tǒng)選育，優(yōu)化改良和實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了理論依據(jù)。

Muzyer等[9]證明變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)在研究自然界微生物群落多樣性及菌相差異方面具有明顯的優(yōu)越性，在食品領(lǐng)域已得到了成熟的應(yīng)用，如利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）-DGGE技術(shù)分析國內(nèi)外自然發(fā)酵泡菜中微生物的多樣性[10-12]、酒廠中成熟與退化窖泥中微生物的結(jié)構(gòu)組成[13]、玉米青貯及苜蓿青貯中細(xì)菌動態(tài)發(fā)酵多樣性[14]、周劍忠等[15]通過指紋圖譜技術(shù)與序列分析研究發(fā)現(xiàn)藏靈菇中除了有大量無法培養(yǎng)的微生物外，還有多種酵母菌和乳酸菌的存在。PCRDGGE技術(shù)現(xiàn)如今已得到廣泛的應(yīng)用，值得注意的是當(dāng)雙鏈DNA分子在變性梯度凝膠中電泳時(shí)，為了避免DNA分子全部解鏈而影響結(jié)果的真實(shí)性，一般在設(shè)計(jì)上游引物時(shí)往往會加入一段30～40 bp的GC夾子[16]。它雖成功克服了基于形態(tài)學(xué)及生理生化研究技術(shù)的局限，獲取了更加豐富的微生物多樣性信息，但相比于當(dāng)今高通量分析技術(shù)的優(yōu)勢，對環(huán)境中絕大部分微生物的發(fā)掘還不夠全面[17]。高通量測序是指對微生物群體進(jìn)行高通量測序，通過測序序列的構(gòu)成分析特定環(huán)境中微生物群體的構(gòu)成情況或基因的組成以及功能性，不僅為遺傳信息的揭示和基因表達(dá)調(diào)控等基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在基因診斷和基因治療等應(yīng)用研究中也發(fā)揮著重要的作用。豆醬整個發(fā)酵過程是由多種微生物共同參與的，目前研究發(fā)現(xiàn)其中的主要微生物類群有霉菌[18]、酵母菌和乳酸菌[19-21]，從整體上利用DGGE法結(jié)合高通量測序全面探究東北傳統(tǒng)豆醬中微生物多樣性的研究目前還鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)通過PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合高通量測序方法，對傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中細(xì)菌群落進(jìn)行全面系統(tǒng)研究，揭示不同時(shí)期的細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的真實(shí)狀態(tài)，挖掘豐富的微生物資源并確定不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢菌群，為工業(yè)化人工接種法生產(chǎn)的醬類打下了良好的基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)醬類的現(xiàn)代化、規(guī)?；a(chǎn)，提供質(zhì)量安全、風(fēng)味優(yōu)良的豆醬以滿足市場需求，為進(jìn)一步深入研究和開發(fā)自然發(fā)酵豆醬中的有益菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)樣品：采集自兩家東北地區(qū)農(nóng)家（T家、Z家）利用東北傳統(tǒng)方法制作的不同發(fā)酵階段的豆醬樣品各6 份，分別在發(fā)酵0、7、14、21、28、35 d（成品醬）進(jìn)行取樣（樣品分別記為T1～T6、Z1～Z6），樣品采集方式為隨機(jī)采樣。樣品采集后，立即送往實(shí)驗(yàn)室保存于-20 ℃。

TE緩沖液、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、蛋白酶K、十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）、Tris飽和酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1，V/V）、氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）、冰異丙醇、70%無水乙醇、10×Easy Taq Buffer、High Pure dNTPs、Easy Taq聚合酶、6×Loading buffer、DL2000 DNA Marker 北京艾比根生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5417高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；Veriti96 PCR擴(kuò)增儀 美國ABI公司；水浴鍋、DYCP-31BN型瓊脂糖凝膠電泳儀 中國深華生物技術(shù)有限公司；紫外凝膠成像及分析系統(tǒng)、DGGE儀 美國Bio-Rad公司；FastPrep勻漿儀 美國MP Biomedicals公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品總DNA提取

樣品處理：pH 7.0、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液懸浮8 g豆醬，用振蕩器振蕩均勻，樣品用2 層滅菌紗布過濾，濾液經(jīng)4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液，將沉淀用pH 7.0、濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液懸浮后離心，收集上清液，重復(fù)2 次，離心收集上清液；將所收集上清液在12 000 r/min、4 ℃條件下離心10 min，收集沉淀，將沉淀用5 mL滅菌水混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，重復(fù)2 次，收集沉淀，得到菌體沉淀。采用CTAB法進(jìn)行總DNA的快速提取[22]。

1.3.2 細(xì)菌的PCR擴(kuò)增

以提取的總DNA為模板，采用16S rDNA基因V3區(qū)通用引物，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約250 bp。PCR體系（50 ?L）：36 ?L ddH2O、5 ?L 10×Easy Taq Buffer、 4 ?L dNTPs，1.5 ?L F338-GC，1.5 ?L R518，0.5 ?L的Easy Taq聚合酶及適量的ddH2O補(bǔ)足50 ?L。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃ 1 min、55 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳（100 V恒壓電泳30 min）檢測后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用DGGE對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。使用梯度膠制備裝置，采用8%聚丙烯酰胺凝膠、35%～50%變性劑梯度。待膠完全凝固后，將膠板放入裝有1×TAE電泳緩沖液的裝置中，在每個加樣孔中加入已和上樣緩沖液混合好的PCR樣品。電泳完畢后，利用GelRed染色法將凝膠染色30 min，將染好的凝膠用掃描儀成像，得到PCR-DGGE圖譜，對上述掃描后的圖片進(jìn)行分析，標(biāo)記特異性條帶，并回收條帶，由上海桑尼生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對鑒定。

1.3.4 高通量測序分析

1.3.4.1 可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

使用QIIME軟件，調(diào)用UCLUST這一序列比對工具[23]，對前述獲得的高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，選取每個OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表序列。在QIIME軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，通過將OTU代表序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫的模板序列相比對，獲取每個OTU所對應(yīng)的分類學(xué)信息。

1.3.4.2 基于UniFrac距離的樣本聚類分析

UniFrac距離就是通過比較兩個群落各自獨(dú)有OTU之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的遠(yuǎn)近，從而更全面地反映群落樣本之間的相似程度[24]。使用QIIME軟件對UniFrac距離矩陣分別進(jìn)行UPGMA聚類分析，并使用R軟件進(jìn)行可視化。

1.3.4.3 屬水平的分類學(xué)組成分析

使用QIIME軟件，獲取各樣本屬分類水平上的組成和豐度分布表，并通過柱狀圖呈現(xiàn)分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DGGE圖譜分析

3.任何技能都離不開反復(fù)實(shí)驗(yàn)，微信群是一個好平臺，不受時(shí)空限制，評賞修改方便快捷，有親友參與興味會更濃。

采用CTAB法提取豆醬樣品總DNA，并特異擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，其PCR-DGGE圖譜如圖1所示。對各條帶的鑒定結(jié)果見表1。

圖1 豆醬樣品細(xì)菌總DNA的PCR-DGGE圖譜Fig. 1 DGGE atlas of bacterial community in each soybean paste sample

表1 不同發(fā)酵階段的豆醬樣品中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR-DGGE特異性條帶比對結(jié)果Table 1 Identification of the bands obtained by PCR-DGGE of bacterial 16S rDNA from soybean paste based on BLAST comparison in GenBank

根據(jù)測序結(jié)果利用Mega 5 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖所示。由圖2可知，所有階段性豆醬樣品中共檢測到了15 株乳酸菌種，其微生物群落可分為5 個屬：四聯(lián)球菌屬（4 個條帶）、明串珠菌屬（1 個條帶）、腸球菌屬（3 個條帶）、乳桿菌屬（6 個條帶）和魏斯氏菌屬（1 個條帶），其中乳桿菌屬、四聯(lián)球菌屬和腸球菌屬占主導(dǎo)地位。

圖2 東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree for bacterial community in traditional fermented soybean paste

分別對四聯(lián)球菌屬（條帶J、L、M、P）、明串珠菌屬（條帶G）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示其分別屬于嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetraqenococcus halophilus）、明串珠菌（Leuconostoc sp.）；腸球菌屬（條帶A、E、H）經(jīng)檢測分別屬于屎腸球菌（Enterococcus faecium）、希氏腸球菌（Enterococcus hirae）；乳桿菌屬（條帶C、D、F、I、K、O）經(jīng)檢測分別屬于植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）、彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis），魏斯氏菌屬（條帶Q）經(jīng)檢測隸屬于綠色魏斯菌（Weissella viridescens）。

DGGE圖譜條帶的數(shù)目可以直觀地反映樣品中細(xì)菌菌落的遺傳多樣性，條帶的亮度在一定程度上反映該種菌群的數(shù)目[11]。隨著發(fā)酵時(shí)間的變化，圖譜中的部分條帶的分布發(fā)生著一定的變化，條帶的數(shù)目以及條帶的亮度隨著發(fā)酵時(shí)間的變化在時(shí)刻發(fā)生著改變，說明各個時(shí)期的豆醬樣品中細(xì)菌的數(shù)目豐度在隨時(shí)上下波動。條帶A（Enterococcus faecium）、G（Leuconostoc sp.）、Q（Weissella viridescens）、P（Tetraqenococcus sp.）的亮度隨著發(fā)酵時(shí)間變化在變暗，說明這些微生物是啟動豆醬發(fā)酵的最重要菌株，主要參與豆醬發(fā)酵初期的物質(zhì)分解并在整個分解過程中起到一定的作用，其中魏斯氏菌屬的菌落動態(tài)與高秀芝在傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵過程中養(yǎng)分動態(tài)及細(xì)菌多樣性的研究中結(jié)果一致[25]；條帶C（Lactobacillus plantarum）、G（Leuconostoc sp.）、H（Enterococcus faecium）、K（Lactobacillus curvatus）、L（Tetraqenococcus halophilus）、M（Tetraqenococcus sp.）、O（Lactobacillus brevis）在兩家豆醬樣品中均被檢測到，即使來自于不同人家不同手法做制作的豆醬，乳桿菌屬、腸球菌屬與四聯(lián)球菌屬仍然穩(wěn)定存在于所有豆醬樣品中，說明它們?yōu)闁|北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬在發(fā)酵過程中起中主要作用的細(xì)菌菌群；條帶C、H、K與O在下醬時(shí)有一定量的存在，并且在豆醬的整個發(fā)酵階段均很明亮、條帶較寬且變化不大，說明其在豆醬發(fā)酵過程中均穩(wěn)定存在，是東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬在發(fā)酵過程中的優(yōu)勢細(xì)菌菌種，乳桿菌屬為優(yōu)勢菌屬。乳酸菌在生長代謝過程中能與酵母菌代謝產(chǎn)物作用生成酯類物質(zhì)，因此該菌對豆醬發(fā)酵過程的風(fēng)味形成起到重要的作用。

由圖1可知，不同家庭由于制作手法不同，豆醬樣品中菌群也存在著一定的差異性，如條帶F與Q只在Z家豆醬中被檢測出；條帶G的檢測結(jié)果為Leuconostoc sp.，Z家豆醬中條帶G的亮度較T家相比更亮，條帶更寬。Kim等[26]通過16S rRNA基因的初步測序結(jié)合理化指標(biāo)的測定，分析得出韓國豆醬中分離出的菌株為芽孢桿菌屬（Bacillus glycinifermentans sp.）；在醬的生產(chǎn)中，與風(fēng)味有直接關(guān)系的細(xì)菌主要是乳酸菌，其中主要包括Lactobacillus plantarum、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermenti）、Tetragenococcus halophilus等。同樣，Wu Junrui等[27]在分子水平上利用DGGE技術(shù)對東北大醬中的細(xì)菌物種進(jìn)行分析鑒定，得出Lactobacillus plantarum、Leuconostoc gasicomitatum、Enterococcus faecium和Tetragenococcus halophilus是豆醬中的主要細(xì)菌，本研究中的Weissella viridescens在傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中利用傳統(tǒng)方法和分子生態(tài)學(xué)方法均并未分離到。

2.2 OTU聚類及注釋結(jié)果

OTU通常是指根據(jù)某一人為設(shè)定的序列相似度閾值，將來自一個或多個樣本的序列進(jìn)行歸并，彼此間相似度高于該閾值的序列都將歸并為一個OTU[28]?？梢院喕瘮?shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，有利于在某一確定的分類水平，對不同來源的微生物群落樣本進(jìn)行互相比較（表2）。

表2 豆醬樣品細(xì)菌OTU數(shù)目Table 2 Bacterial OTU number of fermented soybean paste

細(xì)菌豐度的波動趨勢為0～7 d，細(xì)菌數(shù)目在增加；7～14 d，細(xì)菌數(shù)目在減少；14～21 d，細(xì)菌數(shù)目在增加，并在21 d達(dá)到了細(xì)菌數(shù)目的最大值；之后細(xì)菌數(shù)目均減少，說明在發(fā)酵前中期，豆醬的內(nèi)部微生物相互作用環(huán)境與外部自然環(huán)境均有利于微生物的生長；到了發(fā)酵后期，細(xì)菌群落數(shù)目在減少，結(jié)合DGGE圖譜上細(xì)菌分布動態(tài)推測，可能是Enterococcus faecium、Leuconostocsp.、Weissella viridescens和四聯(lián)球菌等微生物在豆醬發(fā)酵過程中，主要參與初期的物質(zhì)分解作用，其自身的代謝及其代謝產(chǎn)物在豆醬發(fā)酵過程中可以調(diào)整豆醬內(nèi)環(huán)境，為豆醬風(fēng)味物質(zhì)的形成創(chuàng)造有利條件。其中Leuconostoc sp.能夠在代謝過程中產(chǎn)生葡聚糖并產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)；魏斯菌屬于乳酸菌群，其中大多數(shù)為兼性厭氧或微需氧菌，通常分離于肉類食品中，對發(fā)酵食品風(fēng)味的形成可能具有重要作用[29]。

2.3 基于UniFrac距離矩陣的UPGMA聚類分析

由于微生物極其多樣，不同微生物彼此之間具有特定的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，意味著群落中的各微生物成員（如OTU）之間存在某種內(nèi)在關(guān)聯(lián)。因此，在探究不同群落樣本之間的關(guān)系時(shí)，需要考慮群落成員之間是否存在系統(tǒng)發(fā)育親緣關(guān)系。聚類分析類群的劃分顯示出豆醬樣品中微生物組成之間的相似性和親緣關(guān)系，樣本根據(jù)彼此之間的相似度聚類，樣本間的分枝長度越短，兩樣本越相似。

圖3 豆醬中細(xì)菌的UPGMA聚類分析Fig. 3 UPGMA cluster analysis of bacteria in soybean paste

由圖3可知，兩個家庭所制作的豆醬樣品之間差異率較低，表明兩家豆醬樣品中細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)均有較高的相似性，說明兩家豆醬樣品中微生物的分布特點(diǎn)以及具有的共性對于東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬具有一定的代表性。

2.4 豆醬樣品在屬水平上的物種分布

對每個豆醬樣品中細(xì)菌的OTU在屬水平進(jìn)行分析，得到物種組成比例情況，反映樣品的群落結(jié)構(gòu)。

圖4 豆醬樣品中細(xì)菌在屬水平的分布圖Fig. 4 Bacterial distribution of fermented soybean paste at the genus level

對每個豆醬樣品中細(xì)菌的OTU數(shù)目在屬水平上進(jìn)行歸類和整理，分為已知細(xì)菌屬和未鑒定出的細(xì)菌屬。在豆醬的不同發(fā)酵時(shí)期，樣品中的細(xì)菌群落存在著明顯的動態(tài)變化，其相對含量存在著一定的差別。在已知細(xì)菌屬中，Leuconostoc sp.、Enterococcus sp.與Tetragenococcus sp.明顯存在于所有樣品中。其中，Leuconostoc sp.相對于其他菌屬含量較高，相對穩(wěn)定存在于所有豆醬樣品中；且Tetragenococcus sp.波動性較大，在各個豆醬樣品中的分布很不均勻，結(jié)合DGGE圖譜可看出其對應(yīng)條帶在豆醬樣品中的分布變化較明顯，說明它易受內(nèi)外環(huán)境的影響；其次數(shù)目最多的為Lactobacillus sp.，在不同發(fā)酵階段的豆醬樣品中均被檢測出，且相對于其他細(xì)菌較穩(wěn)定地分布于所有樣品中，也驗(yàn)證了圖2所得結(jié)論，其中Leuconostoc sp.、Enterococcus sp.、Tetragenococcus sp.和Lactobacillus sp.占主導(dǎo)地位。從分布圖可以看出還有部分豐度相對較小的微生物群體存在于各個豆醬樣品中，但由于其數(shù)目少，可能在DGGE圖譜上很難明顯顯現(xiàn)出，因此只有通過DGGE技術(shù)結(jié)合高通量測序的方法才能夠直觀、全面、系統(tǒng)地對樣品中的微生物群落進(jìn)行探究與分析。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用PCR-DGGE分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合高通量測序方法對東北傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬在發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落進(jìn)行了多樣性研究，通過DGGE圖譜的分析結(jié)合高通量測序驗(yàn)證得出：豆醬樣品不同發(fā)酵階段的優(yōu)勢細(xì)菌菌屬為腸球菌屬（Enterococcus sp.）、四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus sp.）和乳桿菌屬（Lactobacillus sp.）；對豆醬樣品所提供的DNA模板中高質(zhì)量序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，經(jīng)整理與分析得出：細(xì)菌的OTU總數(shù)目為7 159 ，各個發(fā)酵階段的細(xì)菌數(shù)目在時(shí)刻變化：在豆醬發(fā)酵前期，細(xì)菌數(shù)目上下波動，在21 d達(dá)到了細(xì)菌數(shù)目的最大值，發(fā)酵后期數(shù)目在減少，結(jié)合DGGE圖譜上細(xì)菌分布動態(tài)推測可能是Enterococcus faecium、Leuconostoc sp.、Weissella viridescens等微生物在豆醬發(fā)酵過程中參與了初期的產(chǎn)酶降解大分子物質(zhì)作用，并在前中期的大分子物質(zhì)分解為小分子物質(zhì)等產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的過程中起到一定的作用；對豆醬樣品中細(xì)菌的OTU數(shù)目在屬水平上進(jìn)行歸類和整理，Enterococcus sp.、Tetragenococcus sp.和Lactobacillus sp.在不同發(fā)酵階段的豆醬樣品中均被檢測出，數(shù)目較其他細(xì)菌相比較多，結(jié)合DGGE結(jié)果推斷其為豆醬發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌群。其中Tetragenococcus sp.波動性較大，易受內(nèi)外環(huán)境的影響。

由于發(fā)酵食品自然發(fā)酵微生物區(qū)系復(fù)雜，生產(chǎn)周期不穩(wěn)定、安全性差、品質(zhì)不能保證等問題經(jīng)常出現(xiàn)，因此研究發(fā)酵食品中微生物多樣性是解決以上問題的必要途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀地展現(xiàn)出傳統(tǒng)自然發(fā)酵豆醬中細(xì)菌的多樣性及其菌相變化，因此對傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬樣品中微生物群落的組成分布與動態(tài)規(guī)律進(jìn)行研究，可以提高豆醬的品質(zhì)、營養(yǎng)、為發(fā)掘優(yōu)良的菌種發(fā)酵劑及其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供有力的依據(jù)。

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Diversity and Dynamic Changes of the Bacterial Community during Fermentation of Soybean Paste

ZHANG Ying1, WU Rina1,2,*, SUN Huijun1,3, WU Junrui1, TAO Dongbing1, WANG Hongyu1
(1. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China;
2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; 3. College of Modern Agricultural Technology, Liaoning Agricultural Economic School, Jinzhou 121001, China)

In this study, the diversity and dynamic changes of the bacterial community during the natural fermentation of soybean paste, a traditional fermented food popular in northeast China, were analyzed by using polymerase chain reactiondenaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) technology and high-throughput sequencing. Results showed that bacterial operational taxonomy unit (OTU) values were fluctuant during the fermentation and reached a maximum on day 21, indicating the largest bacterial population. Analysis of DGGE profiles and the distribution of bacteria at the genus level suggested that Leuconostoc sp., Enterococcus sp., Tetragenococcus sp. and Lactobacillus sp. were predominant bacterial strains for different fermentation stages of soybean paste. Among these, Tetragenococcus sp. was more fluctuant and and vulnerable to both internal and external environments. Enterococcus faecium, Leuconostoc sp. and Weissella viridescens decreased with fermentation time indicating that these bacteria might be mainly involved in the production of catabolic enzymes in the early fermentation stage and played a role in the adjustment of the internal environment during the whole fermentation process.

traditional fermented soybean paste in northeast China; PCR-DGGE; sequencing for microbial diversity; dominant bacterial strains; operational taxonomy unit (OTU)

10.7506/spkx1002-6630-201714005

Q7

A

1002-6630（2017）14-0030-06

2016-09-04

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31471713；31470538）；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2014M560395）；

遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目（2014048）；

遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（LR2015059；LJQ2015103）；江蘇省博士后科研資助計(jì)劃項(xiàng)目（1402071C）作者簡介：張穎（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：794374297@qq.com

*通信作者：烏日娜（1979—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：wrn6956@163.com