侯 潔，李 琴，熊 科，徐友強，李秀婷*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆與序列分析

侯 潔1,2，李 琴2,3，熊 科2,3，徐友強2,3，李秀婷1,3,*

（1.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；2.北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京工商大學(xué)，北京 100048；3.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京 100048）

基于酸性木聚糖酶在飼料及釀酒行業(yè)良好的應(yīng)用前景，通過基因組步移的方法克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶的全長基因xynA，然后采取重疊延伸PCR技術(shù)進行內(nèi)含子的切除獲得xynA的cDNA序列，并對其進行了生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果顯示xynA基因全長720 bp，內(nèi)含子63 bp，cDNA全長657 bp。推測該木聚糖酶編碼信號肽28 個氨基酸，成熟肽190 個氨基酸；預(yù)測該蛋白為分子質(zhì)量20.61 kD、等電點7.0的親水性蛋白，且分子內(nèi)不含二硫鍵。與其他真菌來源的GH11族耐酸性木聚糖酶進行序列比對，結(jié)果顯示該酶的相應(yīng)位置具有特征天冬氨酸殘基Asp，且具有糖苷水解酶11 族的保守區(qū)域特征以及典型的“右手半握”狀結(jié)構(gòu)，重組木聚糖酶基因xynA能夠在大腸桿菌中成功表達，比酶活力達220.5 U/mg。

微紫青霉；酸性木聚糖酶；基因克??；生物信息學(xué)分析

半纖維素是自然界中生物量僅次于纖維素的可再生生物質(zhì)資源，是一類存在于大多數(shù)植物細胞壁的雜聚多糖[1]。木聚糖酶是將半纖維素的主要組成成分——木聚糖降解為低聚木糖和木糖的一組復(fù)合酶系，是木聚糖降解酶系中最關(guān)鍵的酶[2]，主要包括β-1,4-D-外切木聚糖酶、β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶。其中β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶作用于木聚糖主鏈，起主要降解作用[3-4]。不同領(lǐng)域?qū)τ谀揪厶敲傅男枨蟛煌?，所對?yīng)酶的酶學(xué)性質(zhì)也具有較大差異[5]，目前關(guān)于木聚糖酶的研究多集中于其耐熱及耐堿性方面，而對于在飼料、果汁、釀酒等行業(yè)具有極大應(yīng)用潛力的酸性木聚糖酶的研究相對較少[6-8]。酸性木聚糖酶的研究，不但可以豐富木聚糖酶資源，而且有助于促進其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用。產(chǎn)酸性木聚糖酶的菌株主要來源有兩種，一是天然篩選得到的菌株，二是通過基因工程技術(shù)構(gòu)造的菌株[9-10]。由于天然菌株具有產(chǎn)酶能力有限、穩(wěn)定性差等缺點，越來越多的研究人員從分子層面對酸性木聚糖酶結(jié)構(gòu)中影響其性質(zhì)的因素進行研究。Ohta等[11]采用實時-聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的方法從Aureobasidium pullulans var. melanigenum中克隆得到編碼酸性木聚糖酶xynI的cDNA并進行測序分析，推測其耐酸性與Glu和Asp殘基密切相關(guān)。Michaux等[12]通過比對酸性木聚糖酶XYL1與其他同源的中、堿性木聚糖酶的結(jié)構(gòu)，得知XYL1的耐酸特征是由活性位點附近的保守氨基酸序列、表面負電勢以及鹽鍵數(shù)量等因素共同決定。迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的酸性木聚糖酶大多來源于真菌[10]，與細菌來源的木聚糖酶相比，雖然表達量較高，但熱穩(wěn)定性差。可以通過基因工程手段對酶蛋白進行耐熱性改造，從而提高酸性木聚糖酶的工業(yè)價值。

以實驗室前期從全國各地300余份土壤樣品中篩選得到的產(chǎn)酸性木聚糖酶的微紫青霉（Penicillium janthinellum）MA21601為對象進行研究。該菌株在pH 3.0的培養(yǎng)基中生長良好，所產(chǎn)酸性木聚糖酶最適反應(yīng)pH值為4.0，然而該酶在60 ℃保溫30 min后殘留酶活力幾乎為零[13]，一定程度上限制了其工業(yè)應(yīng)用。通過巢式PCR[14]獲得木聚糖酶基因xynA的全長，采用重疊延伸PCR[15]的方法進行內(nèi)含子的切除獲得該木聚糖酶的cDNA，省去了提取RNA和反轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜步驟，并對該木聚糖酶基因進行了序列分析。通過與GH11族其他耐酸木聚糖酶進行比對，分析其耐酸性相關(guān)的氨基酸殘基，根據(jù)蛋白的親/疏水性分析，推測木聚糖酶XynA熱穩(wěn)定性差的原因，為進一步闡明酸性木聚糖酶XynA結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系、提高酶蛋白的耐熱性等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。對獲得的木聚糖酶基因xynA進行原核表達驗證其酶活力，顯示酸性木聚糖酶XynA能夠在E. coli BL21（DE3）中成功表達，確定可以對該基因進行更深層次的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

微紫青霉MA21601為北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心保藏；克隆載體pMD18-T及表達載體pET28-a TaKaRa公司；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、E.coli BL21（DE3） 天根生化科技有限公司。引物合成由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成；序列測定由華大基因完成。

T4 DNA連接酶、Q5超保真酶、LA Taq聚合酶美國NEB公司；真菌DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒美國Omega公司；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；其他常規(guī)試劑為進口或國產(chǎn)分析純。1.2 培養(yǎng)基

PDA液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L、葡萄糖20 g/L，pH值自然。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、胰蛋白胨10 g/L，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需加入瓊脂粉20 g/L。1.3 儀器與設(shè)備

T100-Thermal cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司；EPS301瓊脂糖凝膠電泳儀 北京六一儀器廠；1-14小型臺式離心機 美國Sigma公司；ImageQuant 300凝膠成像儀、Multitemp Ⅲ恒溫循環(huán)水浴器 美國GE公司；HR60-IIA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱 上海STIK公司；DHZ-DA大容量全溫振蕩器 江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；立式壓力蒸汽滅菌器上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.4 方法

1.4.1 微紫青霉基因組DNA的提取及木聚糖酶編碼基因保守序列的擴增

將P. janthinellumMA21601在PDA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集菌體，培養(yǎng)條件為：25 ℃，125 r/min。利用真菌DNA提取試劑盒提取微紫青霉MA21601的總DNA。

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的青霉及曲霉所產(chǎn)GH11族木聚糖酶基因序列，在Block Maker網(wǎng)站設(shè)計簡并引物，以所提取的DNA為模板，進行PCR擴增獲得木聚糖酶基因的保守序列；通過基因組步移巢式PCR的方法獲得木聚糖酶基因的側(cè)翼，巢式PCR程序參考文獻[16]。采用了2 輪PCR，第2輪擴增以第1輪擴增的PCR產(chǎn)物稀釋40 倍為模板，將所得保守序列以及側(cè)翼序列運用DNAMAN軟件進行拼接得到木聚糖酶基因的全長。引物設(shè)計采用Primer Premier 5.0，引物設(shè)計如表1所示。

表1 擴增木聚糖酶基因xynA 保守序列以及側(cè)翼序列引物設(shè)計Table 1 Primers for PCR amplification ofxynA conserved sequence and flanking sequence

1.4.2 木聚糖酶基因cDNA的擴增

將所得全長序列在BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）進行比對，與P. canescens（FJ860893.1）序列相似性較高，由此預(yù)測該木聚糖酶基因含有一個內(nèi)含子，通過重疊延伸PCR切除木聚糖酶Xyn-M的內(nèi)含子，引物設(shè)計如表2所示。

表2 切除內(nèi)含子的引物設(shè)計Table 2 Primers for excising intron

第1輪PCR擴增選用Q5超保真DNA聚合酶進行PCR擴增（98 ℃ 30 s；98 ℃ 8 s，59 ℃ 25 s，72 ℃ 20 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 2 min）；第2輪將第1輪的PCR產(chǎn)物膠回收作為模板，選用LA Taq酶進行PCR擴增（95 ℃ 3 min； 95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，循環(huán)30 次；72 ℃ 10 min）。

1.4.3 目的片段的電泳檢測及測序

將PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。膠回收產(chǎn)物與pMD18-T克隆載體在16 ℃保溫3 h進行連接，42 ℃、60 s熱激導(dǎo)入E. coli DH5α感受態(tài)細胞，涂布于含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、X-gal、Amp的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，通過藍白斑篩選，挑取陽性克隆子，送至北京華大基因研究中心測序確認。

1.4.4 木聚糖酶xynA基因序列分析

序列拼接及比對選用DNAMAN6.0軟件完成、信號肽的預(yù)測選用將序列提交到SignalP 4.1在線預(yù)測（Serverhttp://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）、理化性質(zhì)分析采用ExPASy-ProtParam tool完成（http://web. expasy.org/protparam/）、采用ExPASy-PROTSITE（http:// prosite.expasy.org/）進行催化活性位點分析、結(jié)構(gòu)域分析選擇SMART網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）、N-糖基化分析：NetNGlyc1.0（http://www.cbs.dtu.dk/ services/NetNGlyc/）、二硫鍵預(yù)測由DbD2完成（http:// cptweb.cpt.wayne.edu/DbD2/）。

1.4.5 蛋白質(zhì)親水/疏水性以及跨膜蛋白分析

蛋白親水/疏水性分析由ExPASy-ProtScale（http://web. expasy.org/protscale/）完成，利用TMHMM（http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進行跨膜蛋白的分析。

1.4.6 木聚糖酶XynA序列比對

通過DNAMAN6.0軟件以及NCBI（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/）對木聚糖酶XynA以及GH11族真菌來源的酸性木聚糖酶進行序列比對，分析決定木聚糖酶嗜酸特點的關(guān)鍵氨基酸。

1.4.7 木聚糖酶XynA二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三維同源建模

二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測由SOPMA完成、三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測以及同源建模采用SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy.org/）。

1.4.8 重組木聚糖酶XynA的原核表達與純化

將測序正確的克隆子發(fā)酵后提取質(zhì)粒，將帶有目的片段的pMD18-T載體與表達載體pET28-a分別用NcoI-HF和Not-HF進行雙酶切，雙酶切條件為37 ℃、3 h，將酶切后產(chǎn)物純化并用T4連接酶于25 ℃連接1 h，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET28-a-xynA，42 ℃、60 s熱激導(dǎo)入E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，涂布于含有Kan的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取部分克隆子進行測序同時保存甘油管，選取測序成功的克隆子挑入5 mL LB液體培養(yǎng)基中并于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)14 h作為種子液，接1 mL種子液于含有Kan的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達到0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，20 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h對重組木聚糖酶進行誘導(dǎo)表達后，離心并收集沉淀，用10 mL 0.05 mol/L pH 5.5的醋酸緩沖液重懸菌體，超聲破壁后離心，留取上清液即粗酶液，過鎳柱純化后測定酶活力。

1.4.9 重組木聚糖酶的酶活力測定及十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）分析

酶活力測定參考Miller[17]的3,5-二硝基水楊酸法（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS），采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定純化后酶液的蛋白質(zhì)濃度，SDS-PAGE按照Laemmli[18]的方法進行，濃縮膠濃度為4.5%，分離膠濃度為12.5%，用考馬斯亮藍染色15 min后脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶基因xynA保守序列以及側(cè)翼序列的PCR結(jié)果

圖1 木聚糖酶xynA保守序列以及側(cè)翼序列電泳結(jié)果Fig. 1 Electrophoresis analysis of conserved and flanking sequences of xynA

以微紫青霉基因組DNA為模板，用簡并引物進行PCR擴增獲得木聚糖酶基因xynA保守序列，長度為185 bp（圖1a）。采用巢式PCR的方法，通過基因組步移獲得木聚糖酶基因xynA側(cè)翼序列。圖1 b中第2、3、7道擴增得到基因片段，表明簡并引物L(fēng)AD2和3的擴增效果較好，圖1c為巢式PCR第2輪的擴增結(jié)果，特異性較明顯，將對應(yīng)位置的目的片段分別進行測序以獲得完整的側(cè)翼序列。

2.2 木聚糖酶基因序列全長及cDNA序列的獲得

圖2 木聚糖酶基因xynA全長及cDNA電泳結(jié)果Fig. 2 Electrophoresis analysis of PCR amplified products of fulllength xynA gene sequence and cDNA

用DNAMAN軟件將保守序列與側(cè)翼序列進行拼接，獲得木聚糖酶基因全長，測序所得結(jié)果在NCBI上進行比對，具有完整的開放閱讀框。與來源P. canescens的木聚糖酶基因xylB序列相似性較高為85%[19]，由此預(yù)測木聚糖酶基因xynA僅含有一個內(nèi)含子，并設(shè)計引物通過重疊延伸PCR的方法進行內(nèi)含子的切除。省去了提取RNA以及反轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜步驟，直接得到了木聚糖酶基因xynA的cDNA序列。木聚糖酶基因全長為720 bp（圖2a），內(nèi)含子為63 bp，cDNA為657 bp（圖2b）

2.3 木聚糖酶xynA基因的序列分析

DNA全長為720 bp，具有完整的開放閱讀框。木聚糖酶xynA基因序列中含有一個內(nèi)含子為63 bp，cDNA全長657 bp，編碼218 個氨基酸。堿基組成及百分比：A 144 個（占比21.9%）、C 217 個（占比33.0%）、G 155 個（占比23.6%）、T 141 個（占比21.5%）。木聚糖酶xynA全基因序列及對應(yīng)氨基酸序列如圖3所示。

圖3 xynA全基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of xynA

信號肽預(yù)測結(jié)果顯示，該酶含有19 個氨基酸的信號肽序列，通過同源比對發(fā)現(xiàn)，不同于序列相似度較高的Penicillium sp. 40信號肽序列為31 個氨基酸。該基因采用了N端序列分析判斷信號肽，可信度較高[20]。相關(guān)研究表明，信號肽軟件預(yù)測存在一定不確定性，Liu Liangwei等[21]研究發(fā)現(xiàn)，木聚糖酶XynB真正的信號肽序列為1～25而非軟件預(yù)測的1～19，N端多余的殘基對其熱穩(wěn)定性以及底物親和性都有不良影響。由此推測XynA正確的信號肽序列為N端1～28 個氨基酸，編碼成熟肽190 個氨基酸。

理化性質(zhì)分析表明，木聚糖酶XynA推測分子質(zhì)量20.61 kD，符合酸性木聚糖酶的分子質(zhì)量一般都小于30 kD的特點[22]。等電點為7.0，分子式為C911H1321N243O302S3，脂肪系數(shù)為45.68，不穩(wěn)定系數(shù)為18.96（＜40），說明這種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。木聚糖酶分子為單一催化結(jié)構(gòu)域，與大多數(shù)GH11族木聚糖酶相一致[23]。二硫鍵預(yù)測結(jié)果顯示該序列不存在二硫鍵，許多研究表明G/11家族木聚糖酶的耐熱性與分子內(nèi)的二硫鍵密切相關(guān)[24]。Jeong等[25]在脂肪嗜熱芽孢桿菌Bacillus stearothermophilus No. 236木聚糖酶內(nèi)部構(gòu)建一個二硫鍵，使木聚糖酶XynA的熱穩(wěn)性提高5 ℃。Miyazaki等[26]在里氏木霉Trichoderma reesei XYNⅡ的N-末端構(gòu)建一個二硫鍵，并延長C-末端使酶的最適反應(yīng)溫度提高10 ℃。由此推測可以通過在XynA分子內(nèi)構(gòu)建二硫鍵的方法提高其熱穩(wěn)定性。N-糖基化分析顯示，該序列包含1 個N-糖基化位點Asn89。

2.4 蛋白親水/疏水性以及跨膜蛋白分析

圖4 木聚糖酶XynA的疏水性分析Fig. 4 Analysis of hydrophobic region of XynA

XynA蛋白疏水性分析預(yù)測結(jié)果如圖4所示：XynA蛋白疏水指數(shù)最小值為-2.221（145位），XynA蛋白疏水指數(shù)最大值0.867（86位）。網(wǎng)站分析結(jié)果以及ProtParam軟件計算的親水性指數(shù)（GRAVY）為-0.564，均表明XynA為親水性蛋白。氨基酸的疏水作用對于其在三維結(jié)構(gòu)上的穩(wěn)定性具有重要影響[26]，青霉來源的木聚糖酶大多不耐熱，田谷等[27]在橘青霉中克隆木聚糖酶基因并在畢赤酵母中表達后，得到的木聚糖酶在50～55 ℃保存10 min以上，酶活力急劇下降至失活。微紫青霉來源的酸性木聚糖酶XynA也具有熱穩(wěn)定性差的缺點，在后續(xù)的研究中可以在相應(yīng)位點引入疏水氨基酸，有望改善酶蛋白的耐熱性。

圖5 XynA跨膜蛋白結(jié)合位點預(yù)測結(jié)果Fig. 5 Prediction of transmembrane binding sites of XynA protein

TMHMM軟件跨膜蛋白分析結(jié)果如圖5所示，XynA全肽中不存在明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，定位于胞外，表明該蛋白不是跨膜蛋白。

2.5 木聚糖酶XynA序列比對

圖6 真菌來源的11家族木聚糖酶氨基酸序列的多重比對Fig. 6 Multiple BLAST of amino acid sequences of fungal family GH11 xylanases

將微紫青霉木聚糖酶XynA完整的氨基酸序列與GenBank中真菌來源的木聚糖酶氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明XynA與Penicillium sp. 40[20]、Aspergillus kawachii[28]、Aureobasidium melanigenum[11]以及Bispora sp. MEY-1[29]來源的木聚糖酶序列相似性分別為81%、44%、45%和44%，與來源于Aspergillus nidulans[30]和Aspergillus niger[31]的木聚糖酶序列相似性分別為64%和61%。XynA中含有2 個保守的谷氨酸催化活性中心，序列相應(yīng)位置存在GH11家族木糖酶保守區(qū)域VYGWT、PLVEYYI、SDGATYDIYE、HFNAWAKLGMNLG[32]，表明XynA具有11家族木聚糖酶的共同特征。上述木聚糖酶的主要區(qū)別在于最適反應(yīng)pH值不同，Penicillium sp. 40、Aspergillus kawachii、Aureobasidium melanigenum和Bispora sp. MEY-1來源的木聚糖酶最適反應(yīng)pH值為2.0～4.0，Aspergillus nidulans以及Aspergillus niger所產(chǎn)木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值分別為5.5和5.0。研究表明GH11族木聚糖酶分子中2 個谷氨酸催化活性中心附近的氨基酸殘基對其耐酸性有顯著影響[33]。如圖6所示，最適pH值較低的木聚糖酶相應(yīng)位置為Asp殘基，木聚糖酶XynA中Asp73也符合這一規(guī)律，而最適反應(yīng)pH值相對較高的該位置則為Asn。Fushinobu等[34]通過分析酸性木聚糖酶的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)與催化中心相鄰的Asp在堿性條件下與Glu形成氫鍵，pH值較低時Asp能夠提供質(zhì)子，有利于木聚糖酶水解反應(yīng)的進行。

2.6 XynA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測及三維同源建模

圖7 XynA木聚糖酶二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig. 7 Prediction of secondary structure of XynA

XynA二級結(jié)構(gòu)如圖7所示，h代表α-螺旋，占蛋白質(zhì)的16.97%；e代表伸展鏈，占蛋白質(zhì)的32.57%；t代表β-轉(zhuǎn)角，占蛋白質(zhì)13.76%；c代表無規(guī)則卷曲，占蛋白質(zhì)的36.70%?？梢娚煺规満蜔o規(guī)則卷曲是XynA蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)元件，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分散在其中。

圖8 XynA木聚糖酶的空間結(jié)構(gòu)Fig. 8 Spatial structure of XynA

將木聚糖酶XynA的氨基酸序列提交到Swiss-model蛋白質(zhì)模建服務(wù)器上[35]，基于Talaromyces cellulolyticus來源的木聚糖酶Xyn11C（PDB:3wp3.1A）為模板構(gòu)建三維模型如圖8所示，二者序列相似性為73.16%。木聚糖酶XynA由1 個α-螺旋和2 個反向平行的β-折疊片組成，2 個谷氨酸催化活性中心（Glu86和Glu177）位于酶分子的凹槽處，Asp45在空間上與活性中心相鄰，符合GH11族酸性木聚糖酶的結(jié)構(gòu)特點。酶分子呈右手半握狀，具有典型的11家族木聚糖酶結(jié)構(gòu)[36]。

2.7 重組木聚糖酶XynA的原核表達與SDS-PAGE分析

圖9 XynA SDS-PAGE分析Fig. 9 SDS-PAGE analysis of XynA

將目的片段與pET28-a連接后導(dǎo)入E. coli BL21（DE3）中表達，經(jīng)過菌落PCR驗證，確認木聚糖酶基因xynA與pET28-a重組成功。測序正確的重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，過鎳柱純化，比酶活力為220.5 U/mg，SDS-PAGE結(jié)果如圖9所示，經(jīng)鎳柱純化后獲得單一條帶，分子質(zhì)量約為20.61 kD，與預(yù)測蛋白分子質(zhì)量相符合，結(jié)果表明重組木聚糖酶XynA能夠在大腸桿菌中成功表達，并具有一定的酶活力，為后續(xù)分子層面改造的研究提供了參考依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究根據(jù)GenBank上已發(fā)表的來源于青霉屬、曲霉屬的木聚糖酶基因序列，設(shè)計簡并引物擴增得到GH11家族木聚糖酶的保守區(qū)域，再通過基因組步移的方法獲得側(cè)翼，從而克隆出P. janthinellum MA21601 xynA的編碼區(qū)DNA序列，具有完整的開放閱讀框。在BLAST上進行比對，與來源于P. canescens的木聚糖酶基因xylB序列相似性達85%，由此推測xynA僅含有一個內(nèi)含子，采取重疊延伸PCR的方式進行內(nèi)含子的切除，避免了提取RNA以及反轉(zhuǎn)錄的復(fù)雜操作，直接獲得xynA的cDNA序列。生物信息學(xué)分析顯示XynA屬于GH11家族糖苷水解酶，具有11家族木聚糖酶高度保守的氨基酸區(qū)域以及催化活性位點。通過與其他GH11家族真菌來源的酸性木聚糖酶序列比對顯示Asp73位于催化位點附近，符合酸性木聚糖酶的特征。XynA三維結(jié)構(gòu)呈11家族典型的“右手半握”狀。重組木聚糖酶基因能夠成功在E. coli BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達，比酶活力達220.5 U/mg，經(jīng)鎳柱純化后成功獲得單一條帶，且分子質(zhì)量與預(yù)測相符合。

隨著工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域的不斷拓展，木聚糖酶的工業(yè)實用性逐漸成為人們關(guān)注的焦點[37]。天然木聚糖酶存在降解效率低，生產(chǎn)成本高等問題，越來越多的研究人員致力于開發(fā)活性高、穩(wěn)定性強的木聚糖酶[38]。青霉來產(chǎn)木聚糖酶的熱穩(wěn)定性一般較差，酸性木聚糖酶也大多為中溫木聚糖酶，Liao Hanpeng等[39]研究表明，菌株P(guān)enicillium oxalicum GZ-2能夠利用麥秸稈作為碳源發(fā)酵產(chǎn)酶，酶最適反應(yīng)pH 4.0，在50～55 ℃溫度穩(wěn)定性較好，當(dāng)溫度升高到60 ℃，15 min內(nèi)木聚糖酶相對酶活力從78%下降到27%，當(dāng)溫度大于65 ℃時，酶基本失活。Deng Ping等[31]將來源于Aspergillus niger的酸性木聚糖酶基因xynB在畢赤酵母中成功表達，重組木聚糖酶在50℃保溫30 min剩余酶活力可達80%，當(dāng)溫度上升到60 ℃，剩余酶活力迅速下降至不足40%，在飼料造粒等需要較高溫度的工業(yè)應(yīng)用中存在著潛在問題。本研究通過基因工程的手段克隆得到微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因并成功在大腸桿菌中表達。在后續(xù)的研究中，可以通過增加分子內(nèi)二硫鍵、引入疏水氨基酸等操作提高木聚糖酶XynA的熱穩(wěn)定性，有望實現(xiàn)其在飼料及釀酒等領(lǐng)域的應(yīng)用。

[1] SAHA B C. Hemicellulose bioconversion[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2003, 30(5): 279-291. DOI:10.1007/ s10295-003-0049-x.

[2] 陳學(xué)敏, 劉培培, 張波. 一株產(chǎn)木聚糖酶嗜熱菌的鑒定及酶學(xué)性質(zhì)[J].微生物學(xué)通報, 2011, 38(2): 151-156. DOI:10.13344/j.microbiol. china.2011.02.013.

[3] 佘元莉, 李秀婷, 宋煥祿, 等. 微生物木聚糖酶的研究進展[J]. 中國釀造, 2009, 28(2): 1-4. DOI:10.3969/j.issn.0254-5071.2009.02.001.

[4] 李同彪, 周晨妍, 朱新術(shù), 等. N-端二硫鍵及芳香族氨基酸對木聚糖酶XynZF-2熱穩(wěn)定性的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016, 42(1): 26-30. DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201601005.

[5] JUTURU V, WU J C. Microbial xylanases: engineering, production and industrial applications[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(6): 1219-1227. DOI:10.1016/j.biotechadv.2011.11.006.

[6] WANG J, TAN Z, WU M, et al. Improving the thermostability of a mesophilic family 10 xylanase, AuXyn10A, from Aspergillus usamii by in silico design[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2014, 41(8): 1217-1225. DOI:10.1007/s10295-014-1463-y.

[7] LI H, VOUTILAINEN S, OJAMO H, et al. Stability and activity of Dictyoglomus thermophilum GH11 xylanase and its disulphide mutant at high pressure and temperature[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2015, 70: 66-71. DOI:10.1016/j.enzmictec.2014.12.011.

[8] 郄衛(wèi)那, 張?zhí)m英, 何健, 等. 微生物產(chǎn)木聚糖酶研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 42(7): 387-391.

[9] COLIINS T, GERDAY C, FELLER G. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2005, 29(1): 3-23. DOI:10.1016/j.femsre.2004.06.005.

[10] 王雅珍, 李秀婷, 孫寶國, 等. 微生物酸性木聚糖酶及其應(yīng)用的研究進展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2012, 38(8): 107-113. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.2012.08.043.

[11] OHTA K, MORIYAMA S, TANAKA H, et al. Purification and characterization of an acidophilic xylanase from Aureobasidium pullulans var. melanigenum and sequence analysis of the encoding gene[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2001, 92(3): 262-270. DOI:10.1016/S1389-1723(01)80260-7.

[12] MICHAUX C, POUYEZ J, MAYARD A, et al. Structural insights into the acidophilic pH adaptation of a novel endo-1,4-β-xylanase from Scytalidium acidophilum[J]. Biochimie, 2010, 92(10): 1407-1415. DOI:10.1016/j.biochi.2010.07.003.

[13] 王雅珍. 酸性木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選及其性質(zhì)與應(yīng)用研究[D].北京: 北京工商大學(xué), 2014.

[14] 羅麗娟, 施季森. 一種DNA側(cè)翼序列分離技術(shù): TAIL-PCR[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2003, 27(4): 87-90.

[15] 戴燦, 苗聰秀, 盧光琇. 基于重疊延伸PCR法的定點突變技術(shù)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2010, 1(3): 411-412. DOI:10.13241/j.cnki. pmb.2010.03.004.

[16] HUANG J, WANG G, XIAO L. Cloning, sequencing and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia coli[J]. Bioresource Technology, 2006, 97(6): 802-808. DOI:10.1016/ j.biortech.2005.04.011.

[17] MILLER G L. Use of dintrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar[J]. Analytical Chemistry, 1959, 31(3): 426-428.

[18] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the head of bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227: 680-685. DOI:10.1038/227680a0.

[19] MAISURADZE I G, CHULKIN A M, VAVILOVA E A, et al. Multigene families of endo-(1-4)-β-xylanases of Penicillium canescens[J]. Russian Journal of Genetics, 2011, 47(2): 153-161. DOI:10.1134/S1022795411020128.

[20] KIMURA T, ITO J, KAWANO A, et al. Purification, characterization, and molecular cloning of acidophilic xylanase from Penicillium sp. 40[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2000, 64(6): 1230-1237. DOI:10.1271/bbb.64.1230.

[21] LIU L W, CHEN L, TIAN H, et al. Using signal peptide prediction with caution, a case study in Aspergillus niger xylanase[J]. Process Biochemistry, 2012, 47(12): 2527-2530. DOI:10.1016/ j.procbio.2012.07.004.

[22] LUO H, WANG Y, LI J, et al. Cloning, expression and characterization of a novel acidic xylanase, XyL11B, from the acidophilic fungus Bispora sp. MEY-1[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45(2): 126-133. DOI:10.1016/j.enzmictec.2009.05.002.

[23] 李同彪, 周晨妍, 王丹丹. 木聚糖酶熱穩(wěn)定性分子改造的研究進展[J].中國生物制品學(xué)雜志, 2014, 27(11): 1493-1496. DOI:10.13200/j.cnki. cjb.000658.

[24] SONG L, DUMON C, SIGUIER B, et al. Impact of an N-terminal extension on the stability and activity of the GH11 xylanase from Thermobacillus xylanilyticus[J]. Journal of Biotechnology, 2014, 174: 64-72. DOI:10.1016/j.jbiotec.2014.01.004.

[25] JEONG M Y, KIM S, YUN C W, et al. Engineering a de novo internal disulfide bridge to improve the thermal stability of xylanase from Bacillus stearothermophilus No. 236[J]. Journal of Biotechnology, 2007, 127(2): 300-309. DOI:10.1016/j.jbiotec.2006.07.005.

[26] MIYAZAKI K, TAKENOUCHI M, KONDO H, et al. Thermal stabilization of Bacillus subtilis family-11 xylanase by directed evolution[J]. Journal of Biological Chemistry, 2006, 281(15): 10236-10242. DOI:10.1074/jbc.M511948200.

[27] 田谷, 頓寶慶, 王智, 等. 桔青霉木聚糖酶基因克隆及其在畢赤酵母中的表達及活性分析[J]. 生物技術(shù)通報, 2012(6): 87-93. DOI:10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2012.06.030.

[28] ITO K, IWASHITA K, IWANO K. Cloning and sequencing of the xynC gene encoding acid xylanase of Aspergillus kawachii[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 1992, 56(8): 1338-1340. DOI:10.1271/bbb.56.1338.

[29] LUO H, WANG Y, LI J, et al. Cloning, expression and characterization of a novel acidic xylanase, XyL11B, from the acidophilic fungus Bispora sp. MEY-1[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2009, 45(2): 126-133. DOI:10.1016/j.enzmictec.2009.05.002.

[30] PéREZ-GONZALEZ J A, de GRAAFF L H, VISSER J, et al. Molecular cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of two Aspergillus nidulans xylanase genes[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(6): 2179-2182.

[31] DENG P, LI D F, CAO Y H, et al. Cloning of a gene encoding an acidophilic endo-β-1,4-xylanase obtained from Aspergillus niger CGMCC1067 and constitutive expression in Pichia pastoris[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(5): 1096-1102. DOI:10.1016/j.enzmictec.2006.02.014.

[32] SAPAG A, WOUTERS J, LAMBERT C, et al. The endoxylanases from family 11: computer analysis of protein sequences reveals important structural and phylogenetic relationships[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 95(2): 109-131. DOI:10.1016/S0168-1656(02)00002-0.

[33] de LE F, RUELLE V, LAMOTTE B J, et al. Acidophilic adaptation of family 11 endo-β-1, 4-xylanases: modeling and mutational analysis[J]. Protein Science, 2004, 13(5): 1209-1218. DOI:10.1110/ps.03556104.

[34] FUSHINOBU S, ITO K, KONNO M, et al. Crystallographic and mutational analyses of an extremely acidophilic and acid-stable xylanase: biased distribution of acidic residues and importance of Asp37 for catalysis at low pH[J]. Protein Engineering, 1998, 11(12): 1121-1128. DOI:10.1093/protein/11.12.1121.

[35] ARNOLD K, BORDOLI L, KOPP J, et al. The SWISS-MODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling[J]. Bioinformatics, 2006, 22(2): 195-201. DOI:10.1093/ bioinformatics/bti770.

[36] PAES G, BERRIN J G, BEAUGRAND J. GH11 xylanases: structure/function/properties relationships and applications[J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(3): 564-592. DOI:10.1016/ j.biotechadv.2011.10.003.

[37] QIAN C, LIU N, YAN X, et al. Engineering a high-performance, metagenomic-derived novel xylanase with improved soluble protein yield and thermostability[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2015, 70: 35-41. DOI:10.1016/j.enzmictec.2014.11.005.

[38] SYDENHAM R, ZHENG Y, RIEMENS A, et al. Cloning and enzymatic characterization of four thermostable fungal endo-1, 4-β-xylanases[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(8): 3613-3628. DOI:10.1007/s00253-013-5244-8.

[39] LIAO H P, XU C M, TAN S Y, et al. Production and characterization of acidophilic xylanolytic enzymes from Penicillium oxalicum GZ-2[J]. Bioresource Technology, 2012, 123: 117-124. DOI:10.1016/ j.biortech.2012.07.051.

Cloning and Bioinformatics Analysis of Acidophilic xynA Gene from Penicillium janthinellum

HOU Jie1,2, LI Qin2,3, XIONG Ke2,3, XU Youqiang2,3, LI Xiuting1,3,*
(1. Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, Beijing Technology & Business University, Beijing 100048, China; 2. Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing Technology & Business University, Beijing 100048, China; 3. School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology & Business University, Beijing 100048, China)

Acidic xylanases have extensive application in feed and wine industries. The whole sequence of the gene xynA encoding acidic xylanase was amplified from Penicillium janthinellum MA21601 by genome walking. A cDNA sequence was obtained through the elimination of introns by overlapping PCR and analyzed by bioinformatics. The whole sequence was about 720 bp in length with only one intron of 63 bp. The cDNA sequence was 657 bp long and putatively encoded a protein which contained a 28-amino acid (aa) signal peptide and a 190-aa mature peptide. The molecular weight of the protein was estimated to be about 20.61 kD, which had an isoelectric point of 7.0. Bioinformatics analysis showed that XynA was a hydrophilic protein without disulfide bond. The amino acid sequence comparison of XynA with other fungal GH11 acidophilic xylanases indicated that the XynA had an identified specific recognition site of Asp, which displayed a β-jellyroll architecture as a conserved region which was the characteristic of the GH11 family xylanases. The recombinant xylanase was successfully expressed in Escherichia coli with a specific activity of up to 220.5 U/mg.

Penicillium janthinellum; acidophilic xylanase; gene cloning; bioinformatics analysis

10.7506/spkx1002-6630-201714002

Q71

A

1002-6630（2017）14-0009-08

侯潔, 李琴, 熊科, 等. 微紫青霉酸性木聚糖酶xynA基因的克隆與序列分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 9-16.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714002. http://www.spkx.net.cn

HOU Jie, LI Qin, XIONG Ke, et al. Cloning and bioinformatics analysis of acidophilic xynA gene from Penicillium janthinellum[J]. Food Science, 2017, 38(14): 9-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714002. http://www.spkx.net.cn

2016-12-04

國家自然科學(xué)基金面上項目（31371723）

侯潔（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：3156827570@qq.com

*通信作者：李秀婷（1970—），女，教授，博士，研究方向為食品酶工程。E-mail：lixt@th.btbu.edu.cn