張旭華

（江西省吉安市井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江西吉安343000）

克羅恩病患者蛋白質(zhì)組學(xué)差異表達(dá)的研究

張旭華

（江西省吉安市井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院普外科，江西吉安343000）

目的探討克羅恩病患者血清中的差異表達(dá)蛋白。方法選取在本院診治的克羅恩病患者20例，采用各種CyDve染料實(shí)施交叉標(biāo)記后，依據(jù)順序?qū)嵤㎝ALDI-TOF-MS、2-D DIGE等鑒定操作。結(jié)果對二者雙向電泳圖對比，發(fā)現(xiàn)克羅恩病患者在表達(dá)異常蛋白質(zhì)點(diǎn)方面有多個，其中1 058蛋白質(zhì)點(diǎn)，相比于正常成人組，則存在明顯升高，即1.67倍（P＜0.05），此蛋白質(zhì)通過質(zhì)譜鑒定得知，乃是一種結(jié)合珠蛋白質(zhì)。結(jié)論在克羅恩病血清中，結(jié)合珠蛋白所存在的高表達(dá)，提示在其病程中免疫系統(tǒng)失衡可能存在一定作用。

克羅恩病；蛋白質(zhì)組學(xué)；結(jié)合珠蛋白

克羅恩?。–D）乃是一種尚不能明確病因的非特異性且為慢性的腸道炎性疾病。血清中蛋白質(zhì)成分豐富，而在不同疾病狀態(tài)下，其結(jié)構(gòu)及豐度也會存在相應(yīng)差異。在血清當(dāng)中找尋各種與疾病相關(guān)的分子標(biāo)記物，有助于疾病早期診斷[1]。雙向差異凝膠電泳（2-D DIGE）乃是一種新發(fā)展和應(yīng)用的蛋白質(zhì)組學(xué)新技術(shù)，提靈敏性和可重復(fù)性更高[2]。本次研究選取2014年3月～2016年10月在本院診治的克羅恩病患者20例，采用2-D DIGE對其血清中的蛋白質(zhì)予以研究，找尋此病當(dāng)中相應(yīng)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2014年3月～2016年10月在本院診治的克羅恩病患者20例，另選取同期正常成人血清蛋白樣本20例，依據(jù)經(jīng)改良后Mendeloff標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施診斷。兩組在1個月內(nèi)均未曾采用免疫抑制劑及皮質(zhì)激素予以治療。抽取5 mL空腹靜脈血，放置室溫下，持續(xù)20 min，離心機(jī)分離因子3 000 g，并于4℃下實(shí)施離心，持續(xù)10 min，選取上層血清標(biāo)本，將其分別裝入EP管，各管量為100μL，并保存與冰箱中，溫度維持-80℃。選用由瑞典Amershem Bioscience公司生產(chǎn)的EttanTM MALDI-TOF質(zhì)譜儀，Deep Purple全蛋白染料，Ettan TM DALT6電泳儀；采用美國Sigma生產(chǎn)的PROT-BA Kit，運(yùn)用瑞典GE Healthcare生產(chǎn)的2-D Clean-up Kit。

1.2CyDye染料標(biāo)記與樣品蛋白的純化、處理采用2-D Clean-up Kit及PROT-BA Kit試劑盒，將血清標(biāo)本當(dāng)中諸如球蛋白及白蛋白等高豐度蛋白予以去除。蛋白重懸于pH 8.5緩沖液中，由樣品蛋白質(zhì)個抽取3.12μg混合而成內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)本，總劑量50μg，采用特殊材質(zhì)的三種熒光材料，分別為Cy5、Cy3和Cy2，以50μg蛋白，即采用200 pmol熒光染料，實(shí)施標(biāo)記反應(yīng)[3-4]。于無光及冰浴環(huán)境下，實(shí)施標(biāo)記，時間為30 min，而后將20 mmol/L賴氨酸加入其中，持續(xù)冰浴操作，延長10 min，而后將標(biāo)記反應(yīng)予以終止。

1.3 雙向差異凝膠電泳依據(jù)Amersham Ettan DIGE操作標(biāo)準(zhǔn)，將樣品蛋白自上樣至PH3-1024cm非線性IPG膠條標(biāo)記，將其放置于EttanTM DALT6內(nèi)，實(shí)施第一向電泳，逐步增加伏特，當(dāng)增加至65 000 Vh則可停止。而后將內(nèi)部含有碘乙酰胺25 g/L及10 g/L二硫蘇糖醇的SDS平衡液，針對IPG膠條實(shí)施平衡操作，時間均為15 min。當(dāng)IPG膠條完成平衡后，將其放置于125 g/L相應(yīng)聚丙烯酰胺膠上部，開始第二向電泳操作，各張膠均保持恒定功率，即2.5 W，持續(xù)時間40 min。調(diào)整各張膠電泳，即17 W，當(dāng)出現(xiàn)溴酚藍(lán)向膠外移動則可停止。

1.4 分析膠成像及圖像分析采用Typhoon Imager 9400成像儀，圖像掃描上述采用CyDye予以染色的分析膠板，Cy2為487 nm波長激光掃描，Cy3為531 nm波長激光掃描，Cy5為632 nm波長激光掃描，采用DeCyder6.0軟件完成處理操作后，得圖像顏色分別為藍(lán)色、綠色和紅色。將全部的Cy2圖像，均設(shè)置成內(nèi)標(biāo)圖像，而將那些具有最多蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)的膠，設(shè)定為參考膠，而其它膠則與其形成匹配，對于所得出的匹配點(diǎn)，開展后續(xù)分析。將蛋白質(zhì)體積作為指標(biāo)，當(dāng)電梯及圖像小于1.0×e 5蛋白質(zhì)點(diǎn)，則表明其為太小的蛋白質(zhì)點(diǎn)不納入差異分析，而若為1.0×e 8，則為太大，也不納入差異分析，采用DeCyder6.0分析軟件實(shí)施Decye焦內(nèi)分析，將差異表達(dá)蛋白點(diǎn)（index，ID）找尋，完成差異目錄（pick，list）編制，差異比值設(shè)定為大于1.5倍[5]。

1.5 制備膠Deep Purple蛋白染色各組樣品蛋白質(zhì)含有同等量的樣品共500μg，將其加樣至制備膠，實(shí)施電泳，采用Deep Purple實(shí)施全蛋白染色。步驟為：把膠放置于固定液中（醋酸70 mL/L，甲醇95 mL/L），當(dāng)完成雙蒸水漂洗操作后，放置于1/200 Deep Purple染色液中；在搖床上顏色，持續(xù)1 h，最后，于信號固定液中實(shí)施漂洗，時間大于25 min，采用Typhoon Imager9400成像儀實(shí)施成像操作，采用532 nm激光實(shí)施掃描操作。

1.6MALDI TOF-MS把分析膠差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，匹配與制備膠，并且，在制備膠上，將具體位置的蛋白點(diǎn)予以找出，采用RttanTM全自動斑點(diǎn)處理工作站，實(shí)施干燥、脫色除鹽及切點(diǎn)操作，當(dāng)完成這些步驟之后，將樣品放置于RttanTMMALDI-TOF質(zhì)譜儀之中，將闡述予以設(shè)定，開展質(zhì)譜分析操作，至此，便可將肽指紋圖譜予以獲取。檢索目標(biāo)設(shè)置為差異點(diǎn)的肽指紋圖譜，另外，采用MALDL EVALUATION V2.0軟件實(shí)施檢索操作[6]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法采用DeCyder V6.0軟件，實(shí)施膠內(nèi)差異分析操作（DIA），另行生物學(xué)差異分析（CVA），采用t行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 分析膠成像通過雙向差異電泳后，在全部膠條中，都可獲取清晰蛋白質(zhì)達(dá)譜，然后采用DeCyder軟件實(shí)施處理，由于采用不同染料實(shí)施標(biāo)記的樣本，其圖譜也呈現(xiàn)出不同顏色，抽取其中任意一張開展分析，經(jīng)過融合而最終形成，藍(lán)色圖譜所表示的是內(nèi)標(biāo)，標(biāo)記為Cy2；綠色的圖譜則表示為正常成人的血清蛋白，標(biāo)記為Cy3；紅色的則為CD患者的血清蛋白，標(biāo)記為Cy5。見圖1。

2.2 圖像質(zhì)譜分析采用DeCyder軟件實(shí)施分析，CD患者相比于正常成人血清當(dāng)中差異點(diǎn)，共計29個，其中差異表達(dá)1.5倍上為25個（P＜0.05）；見圖2。膠號乃是1 055的蛋白質(zhì)點(diǎn)，則在CD患者血清中，相比于正常成人組，高出1.67倍，P=4.29，E-08。見圖3。EttanTM MALDI-TOF質(zhì)譜儀實(shí)施分析操作后，獲取肽指紋圖譜。見圖4。將肽段在NCBInr數(shù)據(jù)庫中輸入，并搜索，最終確定為結(jié)合珠蛋白（Hp）。

圖1 雙向差異凝膠電泳圖像

圖2 CD患者2-DE凝膠電泳圖，編號標(biāo)記為差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)

圖3 1055編號差異表達(dá)蛋白質(zhì)的電泳圖

圖4 Hp肽指紋圖譜

3 討論

蛋白質(zhì)組學(xué)研究了基因表達(dá)的成熟形式，乃是基因轉(zhuǎn)錄實(shí)施研究之后，一種最為有利的提升及補(bǔ)充。近些年來，蛋白質(zhì)組學(xué)諸多技術(shù)均得到較大幅度提升及發(fā)展，對于傳統(tǒng)的雙向電泳技術(shù)而言，其靈敏度差，不能對低豐度的蛋白質(zhì)實(shí)施檢測，并且各塊膠僅可以完成2個樣品的分離，另外，人為因素所造成的影響，依據(jù)造成膠之間存在較大差異，還具有較差的實(shí)驗(yàn)室之間的可重復(fù)性。2-D DIGE采用的是一組具有特殊性的CyDYE DIGE熒光染料，能夠?qū)Φ拓S度的探測靈敏度給予顯著提升，此外，對于相同膠上，將三種不同染料的標(biāo)記蛋白實(shí)施分離，經(jīng)實(shí)驗(yàn)樣本當(dāng)中提取量相等的樣本很合，進(jìn)而為各個膠構(gòu)建共同的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣本，也就是內(nèi)標(biāo)，經(jīng)相同凝膠內(nèi)樣品圖像相比于與內(nèi)標(biāo)圖像，針對各種凝膠內(nèi)標(biāo)圖像之間開展比較，主要有兩步驟，可將膠之間的差異予以消除，進(jìn)而獲取樣品之間蛋白表達(dá)的實(shí)際差異，對于操作者間所存在的偏差最大限度的予以降低，進(jìn)而將假陽性及假陰性予以大幅減少，乃是當(dāng)前一種具有高準(zhǔn)確率及可信度的技術(shù)。

[1]廖詩樂,陳白莉,胡坤華,等.英夫利西單抗治療克羅恩病黏膜愈合的血清差異蛋白質(zhì)表達(dá)研究[J].中國病理生理雜志, 2015,31(5):894-899.

[2]康亮,楊祖立,王磊,等.CD45在克羅恩病患者血清中的表達(dá)[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2009,29(2):259-263.

[3]陸曉春,韓樹堂.腸內(nèi)營養(yǎng)療法在克羅恩病臨床治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2012,18(15):26-28.

[4]龐智.蛋白質(zhì)組學(xué)在炎癥性腸病分子機(jī)制研究中的應(yīng)用前景[J].胃腸病學(xué),2005,10(2):113-115.

[5]蘇麗,李楠.蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在炎癥性腸病研究中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中華消化病與影像雜志:電子版,2012,2(3):32-35.

[6]童明霞,繆應(yīng)雷.蛋白質(zhì)組學(xué)在炎癥性腸病研究中的應(yīng)用[J].世界華人消化雜志,2010(22):2333-2338.

[7]周強(qiáng),張言斌,湯春梅,等.克羅恩病與腸結(jié)核鑒別診斷對比分析[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué),2009,15(6):38-39.

[8]翟寶進(jìn),劉欣民,李雙英,等.顱內(nèi)動脈瘤患者血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的研究[J].中華神經(jīng)外科雜志，2010,26(10):891-895.

Proteomic differential expression in patients with Crohn's disease

Zhang Xu-hua
（Department of general surgery，Affiliated Hospital of Jinggangshan University of Jiangxi;Ji'an，Jiangxi，343000，China）

ObjectiveTo investigate the differences in serum of patients with Crohn disease protein.Methods20 cases in our hospital for treatment of Crohn's disease patients,the implementation of cross labeled by various CyDve dyes,the implementation of MALDI-TOF-MS based on2-D DIGE sequence identification operation.Results Of the two dimensional electrophoresis map comparison,found that patients with Crohn's disease the abnormal expression of protein spots are multiple,including 1 058 protein spots,compared to the normal adult group,there is increased 1.67 times(P<0.05),the protein identification by mass spectrometry that is a combination of pearl protein in serum.ConclusionHigh expression of Crohn's disease,combined with the existing pearl protein,suggesting that in the course of immune system imbalance may have some effect.

Krohn's disease;Proteomics;Protein binding

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.20.077