張圓，曹志鵬，毛瑞明，2，杜仲波，米麗，3，雒心怡，田美慧，朱寶利

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110122；2.遼寧省公安廳，遼寧沈陽 110032；3.河北北方學(xué)院，河北張家口 075000）

HIF-1α、VEGF-A在心律失常大鼠心肌組織中的變化

張圓1，曹志鵬1，毛瑞明1，2，杜仲波1，米麗1，3，雒心怡1，田美慧1，朱寶利1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110122；2.遼寧省公安廳，遼寧沈陽 110032；3.河北北方學(xué)院，河北張家口 075000）

目的觀察大鼠心律失常后缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和心肌血管內(nèi)皮生長因子-A（vascular endothelial growth factor-A，VEGF-A）的表達(dá)變化，探討心律失常與冠狀動(dòng)脈供血不足引起的急性心肌缺血中兩指標(biāo)表達(dá)規(guī)律的不同。方法利用CaCl2誘導(dǎo)大鼠心律失常，應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測大鼠心律失常后6h內(nèi)HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)及變化情況。結(jié)果心律失常致死的大鼠心肌組織中HIF-1α及VEGF-A呈彌漫性表達(dá)，在心律失常發(fā)生的早期兩者表達(dá)均呈增加隨后下降；心律失常發(fā)生時(shí)即產(chǎn)生廣泛的心肌缺血且范圍不隨時(shí)間增大。結(jié)論HIF-1α和VEGF-A在心律失常大鼠心肌組織中均有表達(dá)，可為致死性心律失常和冠狀動(dòng)脈供血不足引起的急性心肌缺血的鑒別診斷提供依據(jù)。

法醫(yī)病理學(xué)；心律失常，心性；心?。蝗毖跽T導(dǎo)因子 1；血管內(nèi)皮生長因子-A；大鼠

心源性猝死（sudden cardiac death，SCD）在大多數(shù)國家是各年齡段心血管疾病的主要死因[1-3]。據(jù)報(bào)道，部分心源性猝死者的冠狀動(dòng)脈病變并不是很嚴(yán)重，心臟僅有非特異的缺血性改變，心功能指標(biāo)如腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）也并無特異性的升高，有些案例可能存在心肌缺血、壞死指標(biāo)如肌酸激酶（creatine kinase，CK）及其同工酶（CK-MB）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cardiac troponinⅠ，cTnⅠ）的表達(dá)，推測這類猝死極有可能由致死性心律失常引起[3-5]。同時(shí)包括心肌缺血及心肌梗死在內(nèi)的潛在心臟病變可引發(fā)心律失常[6]，心律失常反過來可以影響心泵功能從而減少心臟自身的血液供應(yīng)。這就說明心律失常與心肌缺血存在一定聯(lián)系，心律失常發(fā)生時(shí)很可能有心肌缺血的參與。通過研究兩者之間的聯(lián)系，不但能為致死性心律失常的法醫(yī)學(xué)鑒定及死亡機(jī)制研究提供科學(xué)依據(jù)，還對兩者之間的鑒別診斷有所裨益。目前，致死性心律失常的法醫(yī)學(xué)診斷由于缺乏明顯的病理學(xué)改變，主要通過排除非心源性死因來獲得[1]。心肌缺血相關(guān)指標(biāo)如缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）及血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）對于心肌缺血十分敏感并有一定特異性，是檢測心肌缺血是否發(fā)生的優(yōu)良指標(biāo)[7-10]。HIF和VEGF在冠狀動(dòng)脈供血不足引起的心肌病變中的表達(dá)規(guī)律已經(jīng)有所報(bào)道[7，8，11]，為明確心律失常后心肌組織中HIF和VEGF的表達(dá)規(guī)律，本實(shí)驗(yàn)通過檢測HIF家族中的HIF-1α及VEGF家族中的VEGF-A在CaCl2誘導(dǎo)大鼠心律失常模型中的表達(dá)特點(diǎn)，來研究心律失常中心肌缺血的參與程度，以期為心律失常的鑒定以及其與心肌缺血的鑒別診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（美國Proteintech公司），兔抗大鼠VEGF-A多克隆抗體（美國Abcam公司），SP-9001免疫組化染色試劑盒、ZLI9018濃縮型DAB試劑盒、多克隆山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RIPA裂解液（P0013B，上海碧云天生物技術(shù)有限公司），預(yù)染蛋白Marker（SM0671，立陶宛Fermentas公司），ECL發(fā)光液（SC-2048，美國Santa Cruz公司），RNAiso Plus（D9108A）、Prime-ScriptTMRT試劑盒（DRR037）、SYBR?PremixEx TaqTMⅡ（RR820A，日本TaKaRa公司）。

ML870 8通道PowerLab 8/30高速記錄儀（澳大利亞ADInstrument公司），ALC-IP900微量注射泵（上海奧爾科特生物科技有限公司），RM2235型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司），CX31型光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司），165-8001型電泳儀、轉(zhuǎn)印儀（美國BIO-RAD公司），紫外可見分光光度計(jì)（德國IMPLEN公司），TP600梯度PCR儀（日本TaKaRa公司），7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國Life Technologies公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性SD大鼠72只，體質(zhì)量300～350g。適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為生理鹽水對照組和CaCl2誘導(dǎo)心律失常實(shí)驗(yàn)組，每個(gè)組再分成6個(gè)亞組（0min、15min、30min、1h、3h和6h組），每個(gè)亞組6只大鼠。

1.2.2 CaCl2誘導(dǎo)大鼠心律失常模型的制作

參照Salimbeni等[12，13]建立大鼠心律失常動(dòng)物模型。采用4%水合氯醛溶液以0.75mL/100g腹腔注射麻醉，使大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，連接PowerLab記錄儀，采用標(biāo)準(zhǔn)第Ⅱ?qū)?lián)監(jiān)測心電。術(shù)前監(jiān)測正常心電5min。用手術(shù)刀切開頸部皮膚，鈍性分離頸部肌肉，暴露雙側(cè)頸靜脈。

實(shí)驗(yàn)組用微量注射泵經(jīng)頸靜脈按4 mg/100 g注射CaCl2溶液；15 min、30 min、1 h亞組每10 min注射一次；3h、6h亞組在第一小時(shí)每10min注射一次，之后每30min注射一次。注射后記錄心電圖變化，分別在0 min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h以兩倍劑量給入CaCl2溶液處死，并確保大鼠是由于致死性心律失常而致死。

生理鹽水對照組以等量生理鹽水代替CaCl2溶液，最后在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)頸椎脫位處死動(dòng)物。

動(dòng)物死后灌流，取出心臟。將心臟橫斷分為兩部分，一部分經(jīng)多聚甲醛固定用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色，另一部分-80℃保存用于Western印跡法及mRNA檢測。

1.2.3 切片的制作

取大鼠心肌，經(jīng)4%多聚甲醛（PBS溶液）固定，水洗、脫水、透明，石蠟包埋，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片，貼于經(jīng)3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyl-triethoxysilane，APES）處理后的載玻片上。

1.2.4 HE染色

切片脫蠟，水化，蘇木素染色7min，1%鹽酸乙醇分化后，自來水返藍(lán)30min，1%伊紅染色1 min，蒸餾水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.5 免疫組織化學(xué)染色

切片脫蠟至水。3%過氧化氫孵育40min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。滴加正常山羊血清工作液，孵育2 h。分別滴加1∶800兔抗大鼠HIF-1α抗體及1∶1000兔抗大鼠VEGF-A抗體，4℃過夜。滴加生物素二抗工作液，室溫孵育1h。滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育1 h。DAB顯色后經(jīng)蘇木素染核，1%鹽酸乙醇分化，自來水返藍(lán)。切片脫水、透明、中性樹膠封片。染色中以PBS代替一抗作空白對照。

1.2.6 Western印跡法

取心肌組織約100 mg，加液氮將組織研磨成粉末，加蛋白裂解液及苯氟甲砜（phenyl-methylsulphonyl fluoride，PMSF），冰上勻漿，超聲破碎，4℃下以16000×g離心20min，共3次，取上清液，用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品中加?×上樣緩沖液，置于100℃金屬浴中，加熱5min后進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（dodecyl sulfate sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上（110V，90min）。三羥甲基氨基甲烷緩沖液鹽-吐溫20（tris buffered saline with tween-20，TBST）緩沖液洗膜后，將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉中封閉2h。加入1∶1000兔抗大鼠HIF-1α抗體及1∶3000兔抗大鼠VEGF-A抗體，塑料薄膜封閉，4℃過夜。TBST洗膜后，加入1∶4 000山羊抗兔IgG，塑料薄膜封閉，室溫孵育2h。TBST洗膜后，滴加ECL發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光。

1.2.7 mRNA的檢測

取心肌組織100 mg，加入液氮研磨成粉末，以TRIzol法按照說明書應(yīng)用RNAiso Plus試劑盒提取細(xì)胞總RNA，用紫外可見分光光度計(jì)測定D260/D280值和RNA濃度，并將樣品部分RNA稀釋成0.5 μg/μL用于反轉(zhuǎn)錄。參照說明書應(yīng)用PrimeScriptTMRT試劑盒配制反轉(zhuǎn)錄體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。參照說明書應(yīng)用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ配制實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，上機(jī)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.3 結(jié)果判定及統(tǒng)計(jì)分析

Western印跡法以標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker為標(biāo)識(shí)，在70000～100000為HIF-1α目標(biāo)陽性譜帶，在40000～50000為VEGF-A目標(biāo)陽性譜帶。以各條帶平均光密度值與相應(yīng)GAPDH譜帶的平均光密度值的比值來分析各時(shí)間段蛋白量。通過2-ΔΔCt法以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算cDNA的相對含量，分析各時(shí)間段HIF-1α及VEGF-A mRNA的表達(dá)量。

采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較用最小顯著差異法（LSD檢驗(yàn)），數(shù)據(jù)應(yīng)用±s表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

圖1 大鼠心律失常后心肌HIF-1α免疫組織化學(xué)染色×400

2 結(jié)果

2.1 心電監(jiān)測結(jié)果

心電監(jiān)測結(jié)果顯示，生理鹽水對照組大鼠心電未發(fā)生明顯改變；實(shí)驗(yàn)組大鼠心電檢測結(jié)果可見不同類型的心律失常波形，大多數(shù)為竇性心動(dòng)過速、竇性停搏及各種類型的傳導(dǎo)阻滯，部分大鼠出現(xiàn)輕微的室性心律失常，當(dāng)通過兩倍劑量CaCl2處死大鼠時(shí)，可見到室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)和心室撲動(dòng)。

2.2 HE染色結(jié)果

對照組中各亞組的HE染色切片未見病理性改變，心肌結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核完整，橫紋可見。實(shí)驗(yàn)組中，15min亞組僅見少量心肌灶狀嗜伊紅染色增強(qiáng)；30min及1 h亞組可見大片狀心肌嗜伊紅染色；3 h亞組個(gè)別心肌細(xì)胞出現(xiàn)凝固性壞死；6h亞組心肌細(xì)胞腫脹明顯，橫紋不清，部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)凝固性壞死。實(shí)驗(yàn)組在30min、1h、3h亞組中可見心肌波浪樣變。

2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果以PBS代替一抗的空白對照切片，未見陽性染色。對照組大鼠心肌組織中，HIF-1α的染色見極個(gè)別細(xì)胞弱陽性表達(dá)，VEGF-A的染色未見表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α及VEGF-A在組織中彌漫表達(dá)。HIF-1α的表達(dá)隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，1h和3h亞組表達(dá)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，6 h亞組表達(dá)明顯減弱（圖1）。VEGF-A的表達(dá)同樣隨時(shí)間逐漸增強(qiáng)，在30 min亞組表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)明顯，1h及3h亞組強(qiáng)陽性表達(dá)，6h亞組表達(dá)明顯下降（圖2）。

此外，相同時(shí)間段中，HIF-1α及VEGF-A在左心室和右心室中的染色強(qiáng)度未見差異，HIF-1α及VEGF-A的表達(dá)范圍在不同實(shí)驗(yàn)亞組中未見改變，均呈彌漫表達(dá)。

圖2 大鼠心律失常后心肌VEGF-A免疫組織化學(xué)染色×400

2.4 Western印跡法結(jié)果

以GAPDH（相對分子量36 000）作為內(nèi)參，對HIF-1α及VEGF-A蛋白在心肌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行相對定量分析。

對照組中，兩指標(biāo)表達(dá)量很少，HIF-1α幾乎不表達(dá)，各時(shí)間段的表達(dá)量沒有差異。實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α及VEGF-A蛋白表達(dá)強(qiáng)度變化呈現(xiàn)時(shí)間規(guī)律性，從0min開始表達(dá)逐漸增強(qiáng)，30 min為表達(dá)的高峰，表達(dá)量急劇升高，6h顯著下降，表達(dá)量極少，低于對照組水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，HIF-1α各實(shí)驗(yàn)亞組與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF-A各實(shí)驗(yàn)組與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，30min、1h和3h亞組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，圖3，表1）。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

以對照組中0min的GAPDH作為內(nèi)參，對HIF-1α及VEGF-A mRNA在心肌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行相對定量分析。

對照組中，各時(shí)間段mRNA表達(dá)量一致且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)組中，HIF-1α mRNA的表達(dá)量在15min時(shí)迅速上升，1h下降，3h再次攀升，表達(dá)高峰出現(xiàn)在6h，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，除0min組外，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；VEGF-A mRNA的表達(dá)量從30min開始到3h逐漸上升，表達(dá)高峰出現(xiàn)在3h，6h下降，各實(shí)驗(yàn)組與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，30min、1h、3h亞組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表2）。

圖3 大鼠心律失常后各時(shí)間點(diǎn)HIF-1α和VEGF-A蛋白表達(dá)的Western印跡法結(jié)果

表1 不同時(shí)間點(diǎn)心肌HIF-1α和VEGF-A表達(dá)譜帶的灰度值變化（n=6，±s）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)心肌HIF-1α和VEGF-A表達(dá)譜帶的灰度值變化（n=6，±s）

注：1）與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，P<0. 05；2）與相鄰上個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

時(shí)間點(diǎn)HIF-1αVEGF-A對照組實(shí)驗(yàn)組對照組實(shí)驗(yàn)組0min0.028±0.0080.064±0.0071）0.075±0.0120.211±0.040 15min0.020±0.0070.097±0.0201）0.177±0.0360.331±0.0742）30min0.034±0.0110.302±0.0441）2）0.185±0.0440.553±0.0861）1h0.033±0.0110.269±0.0471）0.151±0.0070.489±0.0341）3h0.029±0.0040.239±0.0441）0.168±0.0180.497±0.0691）6h0.034±0.0070.012±0.0011）2）0.187±0.0150.106±0.0222）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α和VEGF-A mRNA表達(dá)的相對表達(dá)量（n=6，±s）

表2 不同時(shí)間點(diǎn)HIF-1α和VEGF-A mRNA表達(dá)的相對表達(dá)量（n=6，±s）

注：1）與對照組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，P<0. 05；2）與相鄰上個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，P<0.05

時(shí)間點(diǎn)HIF-1α mRNAVEGF-A mRNA對照組實(shí)驗(yàn)組對照組實(shí)驗(yàn)組0min1.000±0.0000.999±0.0511.000±0.0000.792±0.021 15min0.592±0.0111.281±0.1111）2）0.816±0.0340.730±0.082 30min0.694±0.0351.276±0.0251）0.739±0.0541.163±0.0501）2）1h0.748±0.0251.152±0.0721）0.905±0.0021.404±0.0941）3h0.726±0.0111.229±0.0991）0.919±0.0031.650±0.1191）2）6h0.877±0.0651.498±0.0821）0.790±0.1170.687±0.0952）

3 討論

HIF-1是Semenza等[6]在研究EPO基因3′端增強(qiáng)子時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種只有在缺氧時(shí)才會(huì)與之連接的蛋白復(fù)合體。HIF是一種與DNA相連接的異源二聚體蛋白[14]，由α亞基和β亞基組成，α亞基（主要是α1亞基）在缺氧的條件下發(fā)揮主要作用[15]。在正常狀態(tài)下HIF-1α?xí)杆俚乇籈3泛素連接酶復(fù)合體降解[16]，而在缺氧的狀態(tài)下HIF-1α逃避了這種降解得以積累[17]。VEGF-A可以調(diào)節(jié)血管的新生與再生以及淋巴管的生成。HIF和VEGF均與缺血缺氧相關(guān)，可以在心肌缺血區(qū)域表達(dá)[18]。Nangaku等[19]研究發(fā)現(xiàn)，心肌中HIF的過表達(dá)能限制梗死區(qū)域，改善心臟功能并在缺血后血管新生中起作用。

鈣離子對于心肌的電活動(dòng)及心內(nèi)傳導(dǎo)非常重要，鈣離子濃度異常可以引起心律失常已得到廣泛認(rèn)同。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一系列由高鈣血癥引起的心電異常，包括竇性停搏、房室阻滯、心動(dòng)過速、室性顫動(dòng)等[20-22]。在實(shí)驗(yàn)中雖然不能控制注入CaCl2后所引起大鼠心律失常的類型，但可以保證的是，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用兩倍劑量CaCl2處死動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)惡性室性心律失常，如室性心動(dòng)過速、室性顫動(dòng)、心室撲動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)并不是針對某種特定的心律失常進(jìn)行研究，而是注重非特異性的致死性心律失常與心肌缺血的聯(lián)系。1985年Bayés等[23]曾分析157例猝死患者的動(dòng)態(tài)心電圖，發(fā)現(xiàn)83.4%為室性快速型心律失常，16.5%為緩慢型心律失常；對其中的131例室性快速型心律失常患者進(jìn)一步歸類，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性室性纖維性顫動(dòng)占8.28%、室性心動(dòng)過速占62.42%、尖端扭轉(zhuǎn)型心律失常占12.7%，并且大部分室性纖維性顫動(dòng)繼發(fā)于室性心動(dòng)過速或是心室撲動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中，在大鼠最后致死過程中發(fā)生的心律失常類型與上述報(bào)道一致，說明應(yīng)用CaCl2誘導(dǎo)心律失?？梢院芎玫啬M致死性心律失常的死亡過程。

CaCl2誘導(dǎo)心律失常的大鼠心肌HE染色并無特異性的改變，只能看到包括嗜伊紅染色增強(qiáng)、波浪樣變在內(nèi)的非特異性改變，這些改變在急性心肌缺血中同樣可以見到。這樣的結(jié)果提示心律失常中可能存在著心肌缺血的改變，但并不能得出確切的結(jié)論。Zhu等[7]通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，HIF、VEGF在心肌出現(xiàn)早期缺血改變的部位表現(xiàn)出強(qiáng)陽性，在出現(xiàn)壞死且不伴有炎癥浸潤的部位表達(dá)相對較弱，在缺乏形態(tài)學(xué)改變的SCD案例的心肌組織中偶見弱陽性表達(dá)。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF-A在心肌中呈現(xiàn)彌漫性表達(dá)，并且左、右心室在同一時(shí)間段沒有明顯區(qū)別，隨著時(shí)間的增加表達(dá)強(qiáng)度增加，但表達(dá)范圍未見改變。有文獻(xiàn)[8，9]報(bào)道，通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支造成冠狀動(dòng)脈供血不足引起急性心肌缺血的大鼠心肌組織中，HIF-1α的陽性表達(dá)首先出現(xiàn)在左心室缺血區(qū)心內(nèi)膜下，隨著缺血時(shí)間的延長，缺血范圍不斷擴(kuò)大，HIF-1α的表達(dá)范圍也就逐漸增大，并由心內(nèi)膜向心外膜滾動(dòng)表達(dá)；VEGF-A最初為弱陽性表達(dá)，隨著缺血時(shí)間增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，3h時(shí)廣泛表達(dá)于缺血區(qū)、缺血周邊區(qū)等心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞；兩者在右心室中未見陽性表達(dá)。上述改變與冠狀動(dòng)脈的垂直供血方式有關(guān)，當(dāng)相應(yīng)冠狀動(dòng)脈阻塞時(shí)，其支配的區(qū)域發(fā)生缺血。通過對比免疫組織化學(xué)染色結(jié)果可以得出結(jié)論，致死性心律失常大鼠心肌內(nèi)HIF-1α和VEGF-A呈彌漫性表達(dá)，而冠狀動(dòng)脈供血不足引起的急性心肌缺血中，HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)集中在特定的冠狀動(dòng)脈支配區(qū)域。

通過Western印跡法結(jié)果可以得出HIF-1α和VEGF-A蛋白的表達(dá)特點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)初期，HIF-1α表達(dá)立即上升，這說明心律失常一旦發(fā)生，心肌缺血就會(huì)相伴產(chǎn)生，而VEGF-A的表達(dá)升高則略有延遲。在缺氧狀態(tài)下培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)HIF-1可以使VEGF的量增加[24]，推測VEGF-A表達(dá)上的延遲來源于HIF-1對VEGF-A表達(dá)的誘導(dǎo)。6h時(shí)兩指標(biāo)均出現(xiàn)明顯下降甚至低于對照組表達(dá)水平，這是由于長時(shí)間的心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞合成mRNA的功能下降，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在壞死的心肌細(xì)胞中，兩指標(biāo)不表達(dá)[11，25]。HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)貫穿整個(gè)心律失常的過程，說明整個(gè)過程中心肌處于持續(xù)缺血的狀態(tài)，最終使心肌由于長期缺血而合成mRNA的功能下降。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α的mRNA轉(zhuǎn)錄并不會(huì)立即增高，在15min才出現(xiàn)增高，mRNA的表達(dá)與蛋白質(zhì)的表達(dá)有不同步的現(xiàn)象，推測0 min時(shí)HIF-1α蛋白量的升高正是由于早期缺血，是HIF-1α的積累作用，之后HIF-1α蛋白量的升高則來源于其表達(dá)的增加。HIF-1α和VEGFA mRNA的表達(dá)升高同樣說明在心律失常的整個(gè)過程中都有心肌缺血的參與。再次對比相關(guān)報(bào)道[8，9]中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)規(guī)律在冠狀動(dòng)脈供血不足引起的心肌缺血和心律失常中的不同；在心律失常致死的大鼠心肌組織中，兩種指標(biāo)在早期的變化更為急驟，蛋白量的高峰出現(xiàn)較早，之后表達(dá)出現(xiàn)下降但仍處于高水平，而急性心肌缺血組在缺血發(fā)生后兩種指標(biāo)的蛋白量不斷升高且變化比較平穩(wěn)，高峰出現(xiàn)較晚；6h時(shí)急性心肌缺血和心律失常中HIF-1α和VEGF-A蛋白量均下降，且在心律失常中下降幅度更大。推測可能是在心律失常的早期，由于心肌缺血是彌漫性的，對保護(hù)性指標(biāo)的需求量瞬間增大，通過蛋白的積累和大范圍心肌細(xì)胞表達(dá)量的增加，使HIF-1α和VEGF-A的蛋白量在短時(shí)間內(nèi)急劇增加；冠狀動(dòng)脈供血不足引起的急性心肌缺血中缺血較為局限，僅局部缺血區(qū)的心肌細(xì)胞表達(dá)HIF-1α和VEGF-A，所以早期兩種指標(biāo)的變化較平穩(wěn)。后期心律失常中缺血發(fā)生的范圍并沒有變化，雖然兩種指標(biāo)仍是高表達(dá)，但由于不斷消耗和心肌細(xì)胞的損傷使得蛋白量出現(xiàn)了下降；冠狀動(dòng)脈結(jié)扎引起的心肌缺血隨著時(shí)間的增加面積擴(kuò)大，產(chǎn)生指標(biāo)的細(xì)胞逐漸增多，兩種指標(biāo)的表達(dá)量不斷增加。

通過研究大鼠心律失常后心肌組織中HIF-1α和VEGF-A的表達(dá)規(guī)律，我們可以確定在心律失常發(fā)生時(shí)可以引起心肌缺血，并且參與整個(gè)致死過程。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)心肌缺血發(fā)生的區(qū)域和特點(diǎn)均與由冠狀動(dòng)脈病變引起的急性心肌缺血不同：一是在致死性心律失常中，心肌缺血的發(fā)生是彌漫性的，心肌各處缺血情況無差別，而冠狀動(dòng)脈病變引起的急性心肌缺血其缺血區(qū)域集中在發(fā)生病變的冠狀動(dòng)脈支配區(qū)；二是心肌缺血發(fā)生在心律失常全過程中，早期即出現(xiàn)廣泛的嚴(yán)重心肌缺血，在這個(gè)過程中心肌缺血的區(qū)域并不發(fā)生變化，只是程度隨時(shí)間加重，而由冠狀動(dòng)脈病變引起的急性心肌缺血是漸進(jìn)性的，早期范圍小，隨著缺血時(shí)間延長范圍也逐漸擴(kuò)大。

盡管在表達(dá)上VEGF-A略有延遲，但是至少在心律失常發(fā)生后的30 min可以檢測到HIF-1α和VEGF-A的蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)錄水平的升高。這種反應(yīng)迅速的指標(biāo)對致死性心律失常的死因鑒定提供了較為客觀、及時(shí)的依據(jù)。通過檢測一些敏感的、早期的缺氧、缺血相關(guān)指標(biāo)如HIF-1α和VEGF-A，來明確心肌缺血的范圍和時(shí)間發(fā)展模式，結(jié)合心功能指標(biāo)及形態(tài)學(xué)檢查，推斷此類心源性猝死是否由致死性心律失常引起，并且有助于致死性心律失常和冠狀動(dòng)脈供血不足引起的急性心肌缺血的鑒別診斷。

[1]Basso C，Burke M，F(xiàn)ornes P，et al.Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death[J].Virchows Arch，2008，452（1）：11-18.

[2]Wilms HR，Midgley DJ，Morrow P，et al.Evaluation of autopsy and police reports in the investigation of sudden unexplained death in the young[J]. Forensic Sci Med Pathol，2012，8（4）：380-389.

[3]Wang H，Yao Q，Zhu S，et al.The autopsy study of 553 cases of sudden cardiac death in Chinese adults[J].Heart Vessels，2014，29（4）：486-495.

[4]亢登峰，李曉英，王英元.1294例心源性猝死的回顧性分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5（1）：63-65.

[5]王雷，陳驍，王曄，等.178例心源性猝死法醫(yī)組織病理學(xué)診斷分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2007，23（3）：210-212.

[6]Semenza GL，Wang GL.A nuclear factor induced by hypoxia via de novo protein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a site required for transcriptional activation[J].Mol Cell Biol，1992，12（12）：5447-5454.

[7]Zhu BL，Tanaka S，Ishikawa T，et al.Forensic pathological investigation of myocardial hypoxia-inducible factor-1 alpha，erythropoietin and vascular endothelial growth factor in cardiac death[J].Leg Med（Tokyo），2008，10（1）：11-19.

[8]杜中波，毛瑞明，高衛(wèi)民，等.大鼠急性心肌缺血早期缺氧誘導(dǎo)因子-1α的表達(dá)[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（5）：327-332.

[9]毛瑞明，杜中波，高衛(wèi)民，等.大鼠急性心肌缺血后血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)變化[J].法醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（3）：179-184.

[10]Blanco Pampín J，García Rivero SA，Otero Cepeda XL，et al.Immunohistochemical expression of HIF-1alpha in response to early myocardial ischemia[J].J Forensic Sci，2006，51（1）：120-124.

[11]Lee SH，Wolf PL，Escudero R，et al.Early expression of angiogenesis factors in acute myocardial ischemia and infarction[J].N Engl J Med，2000，342（9）：626-633.

[12]Salimbeni A，Manghisi E，F(xiàn)regnan GB，et al.Synthesis and antiarrhythmic activity of new 3-[2-（omegaaminoalkoxy）phenoxy]-4-phenyl-3-buten-2-onesand related compounds[J].J Med Chem，1987，30（5）：773-780.

[13]Grimaldi G，Maggi CA，Meli A.Influence of some psychotropic agents on CaCl2-induced arrhythmias in the rat[J].J Pharm Pharmacol，1981，33（3）：194.

[14]Wang GL，Jiang BH，Rue EA，et al.Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2tension[J].Proc Natl Acad Sci USA，1995，92（12）：5510-5514.

[15]Gu YZ，Hogenesch JB，Bradfield CA.The PAS superfamily：sensors of environmental and developmental signals[J].Annu Rev Pharmacol Toxicol，2000，40：519-561.

[16]Jewell UR，Kvietikova I，Scheid A，et al.Induction of HIF-1alpha in response to hypoxia is instantaneous[J].FASEB J，2001，15（7）：1312-1314.

[17]Jaakkola P，Mole DR，Tian YM，et al.Targeting of HIF-alpha to the von Hippel-Lindau ubiquitylation complex by O2-regulated prolyl hydroxylation[J].Science，2001，292（5516）：468-472.

[18]Shibuya M，Claesson-Welsh L.Signal transduction by VEGF receptors in regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Exp Cell Res，2006，312（5）：549-560.

[19]Nangaku M，Izuhara Y，Takizawa S，et al.A novel class of prolyl hydroxylase inhibitors induces angiogenesis and exerts organ protection against ischemia[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2007，27（12）：2548-2554.

[20]Carpenter C，May ME.Case report：cardiotoxic calcemia[J].Am J Med Sci，1994，307（1）：43-44.

[21]Kiewiet RM，Ponssen HH，Janssens EN，et al. Ventricular fibrillation in hypercalcaemic crisis due to primary hyperparathyroidism[J].Neth J Med，2004，62（3）：94-96.

[22]Chang CJ，Chen SA，Tai CT，et al.Ventricular tachycardia in a patient with primary hyperparathyroidism[J].Pacing Clin Electrophysiol，2000，23（4 Pt 1）：534-537.

[23]Bayés de Luna A，Coumel P，Leclercq JF.Ambulatory sudden cardiac death：mechanisms of production of fatal arrhythmia on the basis of data from 157 cases[J].Am Heart J，1989，117（1）：151-159.

[24]Levy AP，Levy NS，Loscalzo J，et al.Regulation of vascular endothelial growth factor in cardiac myocytes[J].Circ Res，1995，76（5）：758-766.

[25]Zhao D，Zhu BL，Ishikawa T，et al.Real-time RT-PCR quantitative assays and postmortem degradation profiles of erythropoietin，vascular endothelial growth factor and hypoxia-inducible factor 1 alpha mRNA transcripts in forensic autopsy materials[J]. Leg Med（Tokyo），2006，8（2）：132-136.

The Changes of HIF-1α and VEGF-A in Myocardial Tissue of Rats with Arrhythmias

ZHANG Yuan1,CAO Zhi-peng1,MAO Rui-ming1,2,DU Zhong-bo1,MI Li1,LUO Xin-yi1,TIAN Mei-hui1, ZHU Bao-li1
（1.School of Forensic Medicine,China Medical University,Shenyang 110122,China;2.Public Security Department of Liaoning Provincial,Shenyang 110032,China;3.HeBei North University,Zhangjiakou 075000, China）

ObjectiveTo observe the expression changes of hypoxia inducible factor-1α（HIF-1α）and vascular endothelial growth factor-A（VEGF-A）in rats with arrhythmias,and to explore the differences of the expression pattern in the two indicators of acute myocardial ischemia caused by arrhythmias and coronary insufficiency.MethodsThe arrhythmia was induced by CaCl2,and the expression changes of HIF-1α and VEGF-A were detected by immunohistochemistry,Western blotting and real-time PCR within 6 h after the arrhythmia in rats.ResultsThe expression of HIF-1α and VEGF-A showed diffuse in the myocardial tissue of rats died from arrhythmias.Both of them increased in the early arrhythmia, then decreased.Extensive myocardial ischemia happened at the beginning of arrhythmia occurrence and its range didn’t expand with time.ConclusionThe expressions of HIF-1α and VEGF-A in myocardium of the rats with arrhythmia can provide evidence for the differential diagnosis of acute myocardial ischemia caused by fatal arrhythmia and coronary insufficiency.

forensic pathology;arrhythmias,cardiac;myocardium;hypoxia inducible factor 1;vascular endothelial growth factor-A;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.002

1004-5619（2017）03-0225-07

2015-09-14）

（本文編輯：鄒冬華）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81273343）

張圓（1988—），女，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：zhangyuan0917@qq.com

朱寶利，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)教學(xué)、研究及鑒定；E-mail：zhu1127@hotmail.com