孫新六

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室，山東 泰安 271000)

幽門螺桿菌感染者IL-8-251多態(tài)性及胃液相關(guān)細胞因子分泌

孫新六

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院中心實驗室，山東 泰安 271000)

目的 探討幽門螺桿菌感染者IL-8-251各基因型與胃液中血管生成相關(guān)的細胞因子分泌之間的相關(guān)性。方法 摘取正常人和胃癌患者胃黏膜組織以PCR-RFLP技術(shù)對IL-8-251進行基因分型；ELISA法檢測胃分泌液中IL-8、VEGF和MMP-9細胞因子濃度。結(jié)果 HP(-)正常對照組中，AA型：IL-8(14.4±1.2)μmol/l，VEGF(2.31±0.48)μmol/l，MMP-9(20.4±5.3)μmol/l；TT型：IL-8 (8.7±2.6)μmol/l，VEGF(1.28±0.33)μmol/l，MMP-9(8.9±3.5)μmol/l。HP(+)對照組：AA型：IL-8(22.6±5.3)μmol/l，VEGF(3.22±0.62)μmol/l，MMP-9(27.2±6.7)μmol/l；TT型：IL-8(14.2±3.6)μmol/l，VEGF(1.44±0.38)μmol/l，MMP-9(10.6±4.4)μmol/l。HP(-)胃癌組：AA型：IL-8(32.8±6.6)μmol/l， VEGF(3.81±0.72)μmol/l，MMP-9(46.2±8.3)μmol/l；TT型: IL-8(22.3±4.5)μmol/l, VEGF(1.83±0.42)μmol/l, MMP(20.2±4.6)μmol/l。HP(+)胃癌組：AA型：IL-8(38.2±5.6)μmol/l，VEGF(4.62±0.76)μmol/l，MMP-9(62.6±13.2)μmol/l；TT型：IL-8(28.6±3.8)μmol/l，VEGF(2.54±0.45)μmol/l，MMP-9(32.1±6.8)μmol/l。結(jié)論 伴隨HP感染者IL-8-251 AA型胃液中血管生成相關(guān)細胞因子IL-8、VEGF和MMP-9分泌增強，提示IL-8-251 AA型且HP感染者可能更易促使胃癌的發(fā)生發(fā)展。

幽門螺桿菌；白介素8；單個核苷酸多態(tài)性；細胞因子

幽門螺桿菌(helicobacter pylori，HP)是胃癌發(fā)生的重要危險因子，但幽門螺桿菌感染者中只有一小部分人發(fā)展成胃癌，這與宿主易感性和基因多態(tài)性相關(guān)[1]。白細胞介素8(IL-8)在胃黏膜炎癥反應(yīng)中起著重要作用，IL-8基因多態(tài)性在胃癌的發(fā)生中起著重要作用[2]，可能在其癌化過程中激活多種血管形成相關(guān)的細胞因子，本研究的目的是闡明IL-8基因多態(tài)性對血管形成相關(guān)細胞因子的影響，從而探討胃癌形成的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象與試劑 均自2010年2月至2015年8月在我院進行胃部內(nèi)鏡篩查和住院病例，受檢者4周內(nèi)均未服用過抗生素藥物。其中幽門螺桿菌感染者220例，其中正常者78例，胃癌142例；幽門螺桿菌未感染者264例，其中正常者160例，患癌104例。研究對象本人對此實驗均知情，并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會認可。研究對象均禁食一晚，清晨空胃內(nèi)鏡檢查時抽取3 ml胃液，2000 r/min離心10 min,去粘液層獲取胃液,以NaOH溶液調(diào)pH≈7.0，-20℃冰箱保存待測。同時在非損害的胃黏膜處內(nèi)窺鏡下摘取小塊組織，以生理鹽水漂洗干凈，-20℃冰箱保存。PCR擴增試劑盒與MunI核酸內(nèi)切酶均購自大連Takara公司。

1.2 幽門螺桿菌感染標(biāo)準(zhǔn) 分別采用快速尿素酶試驗(RUT)、免疫組織化學(xué)和14C-尿素酶呼吸測試(14C-UBT)三種方法對研究對象進行幽門螺桿菌感染檢測，至少有兩種檢測方法結(jié)果顯示為陽性才確定該研究對象為幽門螺桿菌感染者。

1.3 胃黏膜組織DNA提取 胃黏膜組織采用蛋白酶K消化、酚/氯仿/異戊醇方法提取組織DNA：胃活檢標(biāo)本剪碎勻漿后加入10 μl蛋白酶K和300 μl消化緩沖液(200 mM Tris- HCl, 25 mM EDTA,300 mM氯化鈉,1.2%十二烷基硫酸鈉)添加到活檢標(biāo)本, 55 ℃水浴孵育消化12 h。2000 r/min離心10 min，取上清液，加等體積的異丙醇沉淀DNA,離心棄上清，沉淀物加70%的乙醇漂洗。離心后沉淀物輕微干燥,溶解于200 μl TE緩沖液中，調(diào)DNA濃度約為500 ng/μl,-20 ℃保存。

1.4 IL-8-251基因分型 IL-8-251多態(tài)性采用PCR-限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)性檢測。PCR引物：上游引物P1：5’-CACTGGAATTAATGTCTTAGTACCA-3’，下游引物P2：5’-AAGCTTGTGTGCTCTGCTGTCTCT-3’。反應(yīng)體系(25 μl)：模板DNA取100 ng,Taq酶加1U，各引物終濃度為10uM。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；30個循環(huán)：95℃變性40 s,58 ℃復(fù)性40 s, 72 ℃延伸1 min。最后72 ℃充分延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，在凝膠紫外透射儀中觀察拍照。

1.5 MunI酶切分析 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，在10μl酶切反應(yīng)體系中加入1 μl含1單位MunI內(nèi)切酶液和1 μg PCR純化產(chǎn)物，37 ℃水浴酶切反應(yīng)2 h,在3%瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色，在凝膠紫外透射儀中觀察拍照。

1.6 胃液細胞因子檢測 采用ELISA商品試劑盒檢測胃液中IL-8、MMP-9和VEGF等因子濃度，酶標(biāo)板孔中分別加入100 μl待測胃液樣品和系列稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，同時設(shè)好空白和陰性對照，37 ℃水浴孵育1 h,棄液，以PBS液漂洗三次。加針對相應(yīng)抗原的一抗100 μl，同樣水浴孵育和漂洗，再加入HRP酶標(biāo)的二抗100 μl，水浴1 h，PBS漂洗后，再加入反應(yīng)底物，37 ℃反應(yīng)20 min,中止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上以450 nm波長測量各孔OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品測值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，再求出各個待測樣品細胞因子的濃度。

1.7 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)以SPSS18.0分析，以卡方檢驗對IL-8-251基因期望頻率和觀察頻率做hardy-Weinberg平衡檢測，實驗組和對照組HP感染率和IL-8-251等位基因頻率以χ2檢驗，并計算出風(fēng)險率(OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)。各基因型細胞因子濃度數(shù)據(jù)進行Kruskal-Wallis檢驗，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IL-8基因分型 IL-8基因PCR純化產(chǎn)物用MunI酶切后，呈現(xiàn)AA、AT和TT三種類型，AA型為500 bp和298 bp兩片段，TT型為798 bp一個片段，AT型為798 bp、500 bp和298 bp三個片段(圖1)。并經(jīng)過測序確證IL-8 251位點的堿基變異。

圖1 IL-8-251基因內(nèi)切酶分析

2.2 HP感染及IL-8-251多態(tài)性 相對于健康對照組，胃癌組幽門螺桿病感染率高，差異顯著(P<0.001)，IL-8-251A/T等位基因比例在胃癌中相對較高，兩組差異顯著(P<0.05)，顯示HP感染和IL-8-251 A基因位點均是胃癌發(fā)生的相關(guān)風(fēng)險因子。

表1 HP感染和IL-8-251等位基因在正常組與胃癌組中分布

2.3 胃液細胞因子濃度 在幽門螺桿菌感染組，胃液中MMP-9濃度、IL-8濃度和VEGF濃度看，相對于HP非感染正常對照組增高，經(jīng)t檢驗兩組差異顯著，顯示HP感染能增加胃液中MMP-9、IL-8和VEGF分泌。

表2 胃液中細胞因子濃度(μmol/L)

表3 胃液中各基因型細胞因子分泌(μmol/L)

**：每一基因型中，細胞因子濃度在四組中差異顯著(P<0.01)。

3 討 論

幽門螺桿菌是胃癌發(fā)生的重要危險因素，幽門螺桿菌感染人胃黏膜,與胃和十二指腸的慢性萎縮性胃炎等疾病密切相關(guān),可導(dǎo)致消化性潰瘍和胃癌[3]。幽門螺桿菌感染率雖高,但大多數(shù)人保持無癥狀，幽門螺桿菌感染者中只有一小部分人最終發(fā)展成胃癌，機體敏感性可能提高幽門螺桿菌感染后致胃癌的風(fēng)險。白細胞介素8(interleukin-8，IL-8)在幽門螺桿菌引發(fā)的胃黏膜炎癥反應(yīng)中起著重要的作用。IL-8能增強中性粒細胞趨化性，激活吞噬細胞釋放活性氧自由基引起胃黏膜損傷[4]。幽門螺桿菌脂多糖(LPS)和幽門螺桿菌表面蛋白能夠激活巨噬細胞和單核細胞，產(chǎn)生炎性和免疫調(diào)節(jié)細胞因子如TNF-α和IL-1β，它們可引起胃黏膜上皮細胞病損。本實驗顯示幽門螺桿菌感染者胃液中IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)濃度相對于非感染者顯著增加。這些細胞因子促使胃黏膜血管生成和血管擴張，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可降解細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮基底膜，促使胃腫瘤血管生成，提高癌細胞養(yǎng)分和氧氣的供應(yīng)，促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[5]。幽門螺桿菌胃感染可誘導(dǎo)慢性活動性胃炎最后可致胃黏膜萎縮和腸化生，增加胃癌風(fēng)險。IL-8-251等位基因可分為AA、AT和TT三種多態(tài)性， IL-8-251 AA基因型與胃癌的血管生成相關(guān)，AA型可提高胃癌發(fā)生的風(fēng)險。幽門螺桿菌感染的臨床表現(xiàn)與多種因素相關(guān),包括細菌毒力因素,環(huán)境因素和遺傳因素。本實驗顯示HP感染和IL-8-251 A基因位點均是胃癌發(fā)生的相關(guān)風(fēng)險因子?；蚨鄳B(tài)性在不同民族呈現(xiàn)不同頻率，這可能解釋幽門螺桿菌感染致胃癌呈現(xiàn)種族差異性。IL-8-251基因多態(tài)性與血管生成相關(guān)因子的表達相關(guān)，實驗顯示IL-8-251 A A型可提高胃液中白細胞介素(IL)8，MMP-9和VEGF三種細胞因子水平，IL-8-251 AA型更易發(fā)展成胃癌。幽門螺桿菌感染組胃液中MMP-9濃度、IL-8濃度和VEGF濃度,相對于HP非感染正常對照組增高。相對于HP(-)對照組，HP(+)對照組、HP(-)胃癌組和HP(+)胃癌組胃液中MMP-9、VEGF和IL-8細胞因子水平上升，三種細胞因子在IL-8-251 AA型中表達增加。IL-8-251基因的A / T堿基型與三種細胞因子合成相關(guān)聯(lián)。幽門螺桿菌胃感染，胃黏膜處有淋巴細胞和漿細胞滲透，中性粒細胞被白介素8誘導(dǎo)合成活性自由基,如一氧化氮，它們具有分子誘變的潛力，可能導(dǎo)致胃上皮細胞突變[6]。幽門螺桿菌感染可促使輔助性T1細胞(Th1)免疫反應(yīng)發(fā)生，幽門螺桿菌能誘導(dǎo)促炎的Th1細胞因子如TNF-α、干擾素γ分泌，促進胃黏膜萎縮、胃酸過少和腸上皮化生。幽門螺桿菌間接刺激活化細胞毒素，幽門螺桿菌感染促使胃上皮細胞分泌白細胞介素8，誘導(dǎo)中性粒細胞和單核細胞的浸潤而致慢性胃炎。IL-8還通過促進iNOS的表達，產(chǎn)生NO及超氧負離子參與炎癥反應(yīng)[7]。幽門螺桿菌可激活NF-KB、AP-1轉(zhuǎn)錄因子，促進胃黏膜炎癥反應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)IL-8-251AA型感染HP毒株(cagA+)更易誘發(fā)胃炎和胃癌，cagA可以激活Ras→ERK信號通路，cagA+幽門螺桿菌可產(chǎn)生更強烈的炎癥反應(yīng)和胃黏膜上皮細胞DNA損傷[8]。胃癌發(fā)生機制中，IL-8有三種作用，其一促進血管內(nèi)皮細胞生長，使血管形成；其二促進腫瘤細胞生長和擴散；其三參與胃黏膜炎癥反應(yīng)，并釋放多種生長因子和各種活化酶。三種機制加速胃癌變。IL-8的受體CXCR和CXCR2過表達與胃癌相關(guān)，IL-8與其結(jié)合可促進表皮生長因子受體(EGFR)磷酸化而促進胃癌變。鑒于IL-8和幽門螺桿菌在致胃癌中作用，可以考慮使用靶向IL-8的受體CXCR1、CXCR2的抑制劑和HP殺菌藥物預(yù)防胃癌。

實驗表明，幽門螺桿菌感染和IL-8-251多態(tài)性可影響胃液中血管形成相關(guān)細胞因子分泌。通過監(jiān)測幽門螺桿菌感染和IL-8-251基因分型，可以篩選出胃癌易發(fā)人群，進行早期干預(yù)措施進行胃癌預(yù)防。

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IL-8-251 polymorphism in patients with Helicobacter pylori infection and related cytokine secretion in gastric juice

SUN Xin-liu

(Central Laboratory of Taian Central Hospital, Taian 271000,China)

Objective：To investigate the correlation between IL-8-251 genotypes and the secretion of cytokines related to blood vessels in gastric juice. Methods：The gastric mucosal tissue was obtained with endoscopy and the genotype of IL-8-251 and analyzed with PCR-RFLP;also the concentration of IL-8, VEGF and MMP-9 in gastric juice were detected with ELISA. Results:HP(-) control group:AA type:IL-8 (14.4±1.2)μmol/l, VEGF(2.31±0.48)μmol/l, MMP-9 (20.4±5.3)μmol/l; TT type: IL-8 (8.7±2.6)μmol/l, VEGF (1.28±0.33)μmol/l, MMP-9 (8.9±3.5) μmol/l；HP(+) control group:AA type:IL-8 (22.6±5.3)μmol/l, VEGF(3.22±0.62)μmol/l, MMP-9 (46.2±8.3)μmol/l;TT type:IL-8 (14.2±3.6)μmol/l, VEGF (26.4±3.8)μmol/l, MMP-9 (42.6±8.3)μmol/l. HP(-)gastric cancer group:type AA:IL-8 (32.8±6.6)μmol/l, VEGF (3.81±0.72)μmol/l MMP-9(46.2±8.3 )μmol/l; TT type:IL-8 (22.3±4.5)μmol/l, VEGF (1.83±0.42) μmol/l， MMP (20.2±4.6) μmol/l. HP (+) group of gastric cancer:AA type:IL-8 (38.2±5..6) μmol/l, VEGF (4.62±0.76)μmol/l, MMP-9 (62.6±13.2)μmol/l;TT type:IL-8 (28.6±3.8) μmol/l, VEGF(2.54±0.45)μmol/l, MMP-9 (32.1±6.8)μmol/l. Conclusion: The cytokines related to blood vessels(IL-8、VEGF and MMP-9)in gastric juice secretion of IL-8-251 type AA group with HP infection increases, which suggest that AA type with HP infection may occur more likely to induce gastric cancer.

helicobacter pylori;IL-8;single nucleotide polymorphism;cytokines

孫新六(1970—)，男，安徽安慶人，碩士，主要從事臨床分子生物學(xué)研究工作。

R446.1

A

1004-7115(2017)07-0737-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.07.006

2017-04-02)