劉麗元，周靖航，張夢(mèng)華，李金霞，方季青，譚世新，王愛芳，黃錫霞，王雅春

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新疆褐牛基因外顯子多態(tài)性及其與SCS和泌乳性狀關(guān)聯(lián)性分析

劉麗元1,2，周靖航2，張夢(mèng)華1，李金霞1，方季青3，譚世新4，王愛芳4，黃錫霞1，王雅春5

（1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；3新疆烏魯木齊種牛場(chǎng)，烏魯木齊 830000；4新疆天山畜牧生物工程股份有限公司，新疆昌吉831100；5中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193）

【目的】探索和基因多態(tài)性與新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分及泌乳性狀的相關(guān)性，旨在尋找與新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分及泌乳性狀相關(guān)的分子標(biāo)記?！痉椒ā恳孕陆疄豸斈君R種牛場(chǎng)、新疆天山畜牧生物工程股份有限公司共169頭新疆褐牛母牛為試驗(yàn)對(duì)象，以2008—2015年間的生產(chǎn)性能測(cè)定記錄（包括乳脂率、乳蛋白率、總固體含量、乳糖率和體細(xì)胞計(jì)數(shù)等）和305 d產(chǎn)奶量為試驗(yàn)數(shù)據(jù)，基于課題組前期15頭中國(guó)荷斯坦牛DNA混池重測(cè)序的結(jié)果篩選外顯子區(qū)域10個(gè)SNPs，采用基質(zhì)輔助激光電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（sequenom massArray genotype）分型技術(shù)驗(yàn)證10個(gè)SNP位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，運(yùn)用SAS8.1軟件GLM過(guò)程對(duì)這10個(gè)SNP突變與新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分（SCS）、305 d產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體的關(guān)聯(lián)程度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?！窘Y(jié)果】10個(gè)SNP位點(diǎn)均具有多態(tài)性，χ2檢驗(yàn)表明群體中9個(gè)SNP位點(diǎn)符合Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明基因兩個(gè)位點(diǎn)（T98741711C和G98736141A）均與新疆褐牛305 d產(chǎn)奶量達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001），其中TT型和GG型個(gè)體的產(chǎn)奶量最高；（C45667492G）位點(diǎn)與新疆褐牛乳糖率達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)（＜0.005），其中GG型個(gè)體的乳糖率最高；（T14533269A）位點(diǎn)與新疆褐牛乳脂率和總固體含量達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)（＜0.005），與SCS達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001），其中TT型個(gè)體的乳脂率和總固體含量均最高，AA型個(gè)體的SCS極顯著高于AT和TT型；（C26758055G）位點(diǎn)與新疆褐牛乳蛋白率和總固體含量達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001），其中GG型個(gè)體顯著高于CC和GC型個(gè)體。連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建的結(jié)果發(fā)現(xiàn)10個(gè)SNPs構(gòu)建了兩個(gè)單倍型模塊，其中SNP1和SNP2位點(diǎn)之間處于連鎖不平衡狀態(tài)（2＞0.3），SNP4和SNP10位點(diǎn)之間處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)（2＞0.6），隨后分析了單倍型與SCS和泌乳性狀之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)單倍型與新疆褐牛SCS和泌乳性狀無(wú)顯著關(guān)聯(lián)（＞0.001）?！窘Y(jié)論】 初步發(fā)現(xiàn)了和與新疆褐牛SCS和泌乳性能相關(guān)，結(jié)果可為新疆褐牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記輔助選育提供參考和依據(jù)。

新疆褐牛；SCS；泌乳性狀；MassArray；關(guān)聯(lián)分析

0 引言

【研究意義】分子育種技術(shù)在家畜育種中的應(yīng)用，不僅可以增加選擇強(qiáng)度、提高選擇準(zhǔn)確性，同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)早期個(gè)體的基因型選擇[1-2]。而分子育種技術(shù)應(yīng)用的前提是找到影響家畜經(jīng)濟(jì)性狀的主效基因，本研究以初步探索、、、、和多態(tài)性與新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分及泌乳性狀的相關(guān)性，以期為新疆褐牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記輔助育種提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】近十年來(lái)，遺傳標(biāo)記育種、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、克隆技術(shù)等高新生物技術(shù)的研究取得了一定的進(jìn)展，給奶牛育種工作帶來(lái)了新機(jī)遇。眾多的分子標(biāo)記中，SNP（single nucleotide polymorphism）標(biāo)記是當(dāng)前遺傳標(biāo)記研究中最多的，作為目前最具發(fā)展?jié)摿Φ姆肿訕?biāo)記，因其在基因組中數(shù)量多、分布廣，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因組制圖、疾病相關(guān)性分析、群體遺傳學(xué)及藥物研究等眾多領(lǐng)域[3]。目前，越來(lái)越多的泌乳性狀QTL和候選基因被相繼報(bào)道[4-5]，如王麗娟等[6]發(fā)現(xiàn)第4外顯子C8377G位點(diǎn)與產(chǎn)奶量顯著相關(guān)，VIILALA等[7]發(fā)現(xiàn)上F279Y突變顯著影響乳蛋白率和乳脂率，LEONARD等[8]對(duì)13 662頭牛群體進(jìn)行多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)第8 514位點(diǎn)突變與乳脂率和乳蛋白率性狀存在顯著關(guān)聯(lián)，王杰等[9]研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)荷斯坦牛內(nèi)含子上的多態(tài)性與乳脂率和乳蛋白率顯著關(guān)聯(lián)，張曉東等[10]研究發(fā)現(xiàn)，外顯子8的多態(tài)性與中國(guó)荷斯坦牛的乳脂率顯著相關(guān)，賈晉等[11]研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型之間的305 d產(chǎn)奶量和乳脂率有顯著差異外，還發(fā)現(xiàn)該基因?qū)θ榈鞍茁视绊戯@著。季敏等[12]采用直接測(cè)序和PCR-RFLP技術(shù)研究檳榔江水牛變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多態(tài)性與產(chǎn)奶量及乳脂率等產(chǎn)奶性狀具有顯著相關(guān)性。研究表明，利用候選基因策略尋找影響產(chǎn)奶性狀的主效基因進(jìn)而應(yīng)用于奶牛的遺傳改良，從分子遺傳角度來(lái)說(shuō)是可行的[13]。【本研究切入點(diǎn)】新疆褐牛為乳肉兼用型品種，其作為新疆地區(qū)特有的品種資源，具有高乳蛋白、高乳脂、低體細(xì)胞數(shù)、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性好，乳肉平衡等優(yōu)秀特質(zhì)。產(chǎn)奶量和乳成分性狀（主要包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖率等）作為奶牛生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟(jì)性狀，屬典型微效多基因控制的數(shù)量性狀，不僅對(duì)奶業(yè)發(fā)展有巨大影響[14]，而且在新疆褐牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展中也占有重要地位。乳房炎是世界奶業(yè)的常見疾病，對(duì)牛產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)都會(huì)造成較大影響，通常以體細(xì)胞數(shù)為指示性狀，選育提高乳房炎抗性是增加奶牛生產(chǎn)效益的重要措施?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF-MS）是近年來(lái)應(yīng)用在生物大分子檢測(cè)領(lǐng)域的一項(xiàng)新技術(shù)，在基因組SNP的分型檢測(cè)中具有高精準(zhǔn)度、靈敏度高、一次可檢測(cè)多個(gè)SNPs且成本低和周期短等優(yōu)點(diǎn)。該分型技術(shù)是在單堿基延伸的基礎(chǔ)上與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合從而進(jìn)行分型，其原理是通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，檢測(cè)延伸產(chǎn)物分子量的大小，應(yīng)用專用的分析軟件進(jìn)行突變位點(diǎn)的分型。目前，國(guó)內(nèi)外已有很多文獻(xiàn)報(bào)道生物質(zhì)譜技術(shù)在SNP分型方面的應(yīng)用，研究表明，質(zhì)譜檢測(cè)法與其他檢測(cè)方法相比，準(zhǔn)確性更高[15-17]。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】將分子育種技術(shù)應(yīng)用于新疆褐牛育種工作中勢(shì)在必行，但目前對(duì)新疆褐牛泌乳性狀相關(guān)基因的研究還相對(duì)較少，因此，本文根據(jù)前期中國(guó)荷斯坦牛重測(cè)序結(jié)果選取了10個(gè)SNPs位點(diǎn)，探索這些SNPs的遺傳多態(tài)性，并分析其與新疆褐牛SCS、305d產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體數(shù)之間的相關(guān)性，試圖尋找新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分和泌乳性狀的有效分子標(biāo)記，為今后新疆褐牛乳用性能分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究以新疆地區(qū)新疆烏魯木齊種牛場(chǎng)和新疆天山畜牧生物工程股份有限公司2個(gè)牛場(chǎng)169頭具有DHI測(cè)定記錄、年齡及胎次等數(shù)據(jù)的新疆褐牛母牛作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，同時(shí)采集奶樣和血樣。奶樣自2008年至2015年期間每月采集一次送至新疆維吾爾自治區(qū)奶業(yè)辦公室進(jìn)行DHI測(cè)定，獲得乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體以及體細(xì)胞計(jì)數(shù)等表型數(shù)據(jù)；血液為2014年分別在兩個(gè)牛場(chǎng)采集，EDTA抗凝，用于基因型檢測(cè)。

1.1.2 性狀表型記錄 產(chǎn)奶性狀記錄包括305 d產(chǎn)奶量（不足305 d的產(chǎn)奶量根據(jù)付雪峰[18]制定的新疆褐牛305 d產(chǎn)奶量校正系數(shù)進(jìn)行校正）、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體和體細(xì)胞計(jì)數(shù)（Somatic cell counts，SCC）。在進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，利用公式將體細(xì)胞數(shù)轉(zhuǎn)換為呈正態(tài)分布的體細(xì)胞評(píng)分（Somatic cell score，SCS）：SCS=log2(SCC/100000)+3，并保留2位有效數(shù)字。對(duì)DHI測(cè)定記錄的質(zhì)控遵循以下標(biāo)準(zhǔn)[19]：305 d產(chǎn)奶量為1 000—18 000 kg；乳脂率為2%—7%；乳蛋白率為2%—6%；乳糖率為2%—5.5%；總固體為9%—18%；SCC為1—100 000。

1.1.3 影響因素水平劃分 數(shù)據(jù)來(lái)自新疆烏魯木齊種牛場(chǎng)和新疆天山畜牧生物工程股份有限公司，由于新疆天山畜牧生物工程股份有限公司樣本量較少，在分析時(shí)不考慮場(chǎng)效應(yīng)；年份和季節(jié)均以自然產(chǎn)犢年季劃分，以中國(guó)氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)公布的新疆地區(qū)近30年的平均氣溫記錄，依據(jù)候溫法將新疆地區(qū)的季節(jié)劃分為春季（4—5月）、夏季（6—8月）、秋季（9月）、冬季（10月至次年3月），各月份、各季節(jié)平均氣溫見表1和表2；胎次按自然胎次劃分6個(gè)水平（1—6胎及以上）；泌乳月劃分為12個(gè)水平。

表1 1981-2010年各月份平均氣溫

表2 1981-2010年各季節(jié)平均氣溫

1.2 方法

1.2.1 血液基因組DNA提取 利用苯酚-氯仿抽提法進(jìn)行基因組DNA提取，TE緩沖液溶解后，利用NANODROP2000紫外分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，將合格DNA放置于-20°冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA池重測(cè)序篩選SNP 課題組前期以15頭新疆褐牛為試驗(yàn)對(duì)象，運(yùn)用DNA混池重測(cè)序技術(shù)篩選到大量SNPs（表3），為保證后續(xù)試驗(yàn)的可行性和準(zhǔn)確性，將對(duì)篩選出的SNPs進(jìn)行進(jìn)一步的篩選，篩選條件如下：①變異位點(diǎn)位于外顯子區(qū)域；②變異類型選取錯(cuò)義突變；③一個(gè)基因出現(xiàn)多個(gè)位點(diǎn)變異的SNPs；④樣本基因型為雜合變異；⑤測(cè)序深度大于40，測(cè)序深度越深，變異位點(diǎn)準(zhǔn)確性越高。

表3 10個(gè)SNPs相關(guān)信息

文中選擇錯(cuò)義突變SNP的原因：錯(cuò)義突變是編碼某種氨基酸的密碼子經(jīng)堿基替換以后，變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變。而氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，氨基酸的改變可能會(huì)改變其編碼的蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)對(duì)基因的表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，蛋白質(zhì)的改變會(huì)引起基因的功能變化[20]。

1.2.3 SNP分型 將上一步確定的SNP利用Illumina公司的MassARRAY Genotype分型技術(shù)進(jìn)行SNP分型。主要步驟如下[21]：（1）引物設(shè)計(jì)：對(duì)目的SNP做PCR多重設(shè)計(jì)，使每一個(gè)SNP具有一對(duì)擴(kuò)增引物及一個(gè)延伸引物，以便待分型的多個(gè)核苷酸片段能夠在相同的反應(yīng)體系中做多重PCR反應(yīng)；（2）多重PCR擴(kuò)增；（3）SAP反應(yīng)；（4）延伸反應(yīng)；（5）去鹽。將結(jié)束反應(yīng)的板內(nèi)均勻填充樹脂并放置10 min晾干，每個(gè)孔加入16 μL DEPC水，并在Dimpe板上緩慢扣放樣本板，輕輕敲打使樹脂能夠落入樣本孔中，離心均勻1 h。

根據(jù)已知SNP位點(diǎn)序列信息，使用Sequenom MassArray Assay Design軟件對(duì)待測(cè)SNPs進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物設(shè)計(jì)中包括PCR擴(kuò)增引物和單堿基延伸引物。引物設(shè)計(jì)完成后經(jīng)軟件測(cè)試可以使用后交由生物公司進(jìn)行引物合成。共設(shè)計(jì)10對(duì)引物，10個(gè)SNPs由DNA混池全基因組重測(cè)序結(jié)果提供，表4為各位點(diǎn)引物信息表。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 計(jì)算基因型頻率、等位基因型頻率并檢測(cè)各位點(diǎn)的哈代-溫伯格平衡情況。運(yùn)用SAS 8.1的GLM過(guò)程對(duì)基因型與SCS和泌乳性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析的線性模型為：

Yijklm=μ+Gi+Lj+Sk+Pl+eijklm

式中，Y為產(chǎn)奶性狀表型值（305 d 產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體數(shù)和SCS）；為群體均值；G為基因型效應(yīng)；L為年季組合效應(yīng)；S為胎次效應(yīng)；P為泌乳月效應(yīng)；e為隨機(jī)誤差。

為保證多重比較過(guò)程總的I型錯(cuò)誤概率低于0.05和0.01，將顯著性水平校正為＜0.005（顯著）和＜0.001（極顯著）。

表4 引物信息表

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)奶性狀描述性統(tǒng)計(jì)

根據(jù)2008年至2015年課題組對(duì)兩個(gè)新疆褐牛牛群進(jìn)行性能測(cè)定數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析得出SCS和泌乳性狀的簡(jiǎn)單統(tǒng)計(jì)量，結(jié)果見表5。

表5 泌乳性狀及SCS描述性統(tǒng)計(jì)量

2.2 基因型檢測(cè)

利用MassArray技術(shù)對(duì)新疆褐牛169個(gè)樣本10個(gè)SNPs進(jìn)行基因型分型，通過(guò)質(zhì)譜軟件統(tǒng)計(jì)分析得到了分型結(jié)果，10個(gè)SNPs均具有多態(tài)性，且未識(shí)別出的堿基數(shù)較少，基因多態(tài)性以AG、CT基因型為主，可以進(jìn)行下一步SNP位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)奶性狀遺傳效應(yīng)的研究。

2.3 群體等位基因頻率和基因型頻率

利用Excel統(tǒng)計(jì)上述10個(gè)SNPs的等位基因頻率和基因型頻率，并進(jìn)行哈代-溫伯格平衡檢驗(yàn)，結(jié)果見表6。χ2檢驗(yàn)表明SNP1、SNP2、SNP3、SNP4、SNP6、SNP 7、SNP 8、SNP 9和SNP 10這9個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（＞0.05）。SNP5、SNP6和SNP9位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)镃，其等位基因頻率分別為0.985、0.912、0.736，其中SNP5、SNP6、SNP9位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CC，其優(yōu)勢(shì)基因型頻率分別為0.975、0.843、0.534；SNP1位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為CT，優(yōu)勢(shì)基因型頻率為0.435。SNP2、SNP3、SNP4、SNP7位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)锳，其優(yōu)勢(shì)等位基因頻率分別為0.607、0.801、0.710、0.984，其中SNP3、SNP4、SNP7位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AA，其優(yōu)勢(shì)等位基因型頻率分別為0.641、0.503、0.968；SNP2位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為AG，其基因型頻率為0.448。SNP8和SNP10位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)等位基因?yàn)門，其優(yōu)勢(shì)等位基因頻率分別為0.984、0.587，其中SNP8位點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)基因型為TT，其基因型頻率為0.968，SNP10的優(yōu)勢(shì)基因型為CT，其基因型頻率為0.439。SNP5、SNP6、SNP7、SNP8位點(diǎn)處于低度多態(tài)（PIC＜0.25），其余6個(gè)位點(diǎn)均處于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。

2.4 10個(gè)SNPs與泌乳性狀及SCS的關(guān)聯(lián)分析

表7顯示10個(gè)SNPs不同基因型對(duì)新疆褐牛305 d產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、總固體數(shù)及SCS的影響。由表可知，SNP1和SNP2位點(diǎn)對(duì)新疆褐牛305 d 產(chǎn)奶量有極顯著影響（＜0.001），基因型為TT和GG的個(gè)體305 d 產(chǎn)奶量最高。SNP3位點(diǎn)對(duì)乳脂率和總固體含量有顯著影響（＜0.005），對(duì)SCS有極顯著影響（＜0.001），其中純合型TT個(gè)體乳脂率和總固體均最高，而雜合型AT個(gè)體兩個(gè)指標(biāo)均較低，AA型個(gè)體SCS最高。SNP6對(duì)乳蛋白率和總固體性狀均有極顯著影響（＜0.001），其中GG型個(gè)體具有較高的乳蛋白率和總固體含量。SNP9位點(diǎn)對(duì)乳糖率有顯著影響（＜0.005），其中基因型為GG的個(gè)體乳糖率顯著高于CC型，而GC型顯著高于CC型。

關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，SNP1和SNP2與新疆褐牛305 d產(chǎn)奶量達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001）；SNP3與乳脂率和總固體達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)（＜0.005），與SCS性狀達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001）；SNP6與乳蛋白率和總固體均達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)（＜0.001）；SNP9與乳糖率達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)（＜0.005）。

表6 新疆褐牛10個(gè)位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率及χ2檢驗(yàn)

2.5 單倍型與連鎖不平衡分析

運(yùn)用Haploview軟件對(duì)所有SNPs進(jìn)行了單倍型與連鎖不平衡分析，如圖1所示，得出10個(gè)SNP位點(diǎn)的連鎖不平衡檢測(cè)結(jié)果。圖的上方為標(biāo)記在基因中的位置，紅色方塊表示D’＞0.8，方塊顏色越淺表示D’值越低，加框的標(biāo)記處于同一單倍型域中。圖2為單倍型組成，連線表示單倍型域可能的單倍型組合，下方數(shù)字是單倍型域間主要的單倍型組合的比例。由圖2可以看出，本研究群體中，10個(gè)SNPs共構(gòu)成2個(gè)單倍型模塊，分別命名為Block1、Block2，其中Block2處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)（2＞0.6）。Block1包含SNP4和SNP10，其中D’和2值為1.000和0.587，因此Block1為連鎖不平衡狀態(tài)，構(gòu)成3種單倍型，其中TA、CG和CA單倍型頻率分別為0.596、0.292、0.121；Block2包含SNP1和SNP2，其中D’和2值為1.000和0.921，因此Block2為強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)，構(gòu)成3種單倍型，其中AC、GT和GC單倍型頻率分別為0.607、0.373、0.019，兩個(gè)單倍型模塊之間的連鎖不平衡系數(shù)D’為0.36（圖2）。

表7 10個(gè)SNP與泌乳性狀及SCS的關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

同一組數(shù)據(jù)不同小寫字母表示差異顯著（＜0.005）；同一組數(shù)據(jù)不同大寫字母表示差異極顯著（＜0.001）

Different letter of small (＜0.005) and capital (＜0.001) letters among the genotypes of the same SNP indicate significant difference

圖1 10個(gè)SNPs連鎖不平衡估計(jì)

圖2 單倍型域中的單倍型組成

2.6 單倍型與泌乳性狀及SCS關(guān)聯(lián)分析

運(yùn)用SAS8.1軟件進(jìn)行單倍型與新疆褐牛SCS及泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果如表8可知，共存在5種單倍型（本研究群體中未發(fā)現(xiàn)GGCC個(gè)體），在進(jìn)行各單倍型與新疆褐牛泌乳性狀的關(guān)聯(lián)分析時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)單倍型與泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性，可能是由于樣本量較少，或者是還有其他標(biāo)記與本研究的SNPs位點(diǎn)緊密連鎖影響著新疆褐牛SCS和泌乳性狀。

表8 單倍型與泌乳性狀和SCS的關(guān)聯(lián)分析（最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）

＜0.005表示差異顯著；＜0.001表示差異極顯著

＜0.005 indicate significant difference;＜0.001 indicate highly significant difference

3 討論

3.1 SNPs遺傳多態(tài)性分析

采用MassArray技術(shù)對(duì)運(yùn)用DNA混池重測(cè)序結(jié)果篩選的SNPs進(jìn)行個(gè)體基因分型并檢測(cè)其多態(tài)性。結(jié)果得知，10個(gè)位點(diǎn)均有多態(tài)性，卡方檢驗(yàn)表明其中9個(gè)位點(diǎn)符合哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明新疆褐牛在人工選育、遷移和遺傳漂變等因素作用下，這些位點(diǎn)仍處于動(dòng)態(tài)平衡中，反映了這些位點(diǎn)的選擇壓力不強(qiáng)；僅SNP5位點(diǎn)不符合哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，說(shuō)明該位點(diǎn)在新疆褐牛群體中具有較大的選擇潛力。SNP5、SNP6、SNP7和SNP8位點(diǎn)均處于低度多態(tài)，且有效等位基因數(shù)目較少，即這4個(gè)位點(diǎn)在新疆褐牛群體中遺傳變異為低等水平，4個(gè)位點(diǎn)位于和基因上，推測(cè)新疆褐牛在長(zhǎng)期的育種選擇及進(jìn)化過(guò)程中，兩個(gè)基因所受的選擇壓力不大；其余6個(gè)位點(diǎn)均處于中度多態(tài)，遺傳變異較大。因此，綜上所述，在新疆褐牛泌乳性狀的選育過(guò)程中應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)人工選擇的強(qiáng)度。

3.2 SNPs與泌乳性狀及SCS關(guān)聯(lián)分析

本文涉及的6個(gè)基因與牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性研究鮮有報(bào)道，本研究旨在初步探索這些基因與新疆褐牛SCS和泌乳性狀的相關(guān)性。其中，SNP1和SNP2位于牛7號(hào)染色體上（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨基肽酶2），該基因是氨基肽酶M2家族中的一個(gè)多功能酶，是參與ER抗原加工的另一個(gè)氨基肽酶，具有高度多態(tài)性。有研究表明，與一種以高血壓和蛋白尿?yàn)樘卣鞯脑衅诰C合征——先兆子癇有關(guān)，在可能發(fā)生先兆子癇女性的前三個(gè)月胎盤中，表達(dá)常發(fā)生改變[22]，其次，關(guān)于人類鳥槍彈樣脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變、乳腺癌和妊娠高血壓疾病等方面的研究居多[23-25]。本研究初次探索了該基因與新疆褐牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性，結(jié)果表明SNP1和SNP2均與新疆褐牛305d產(chǎn)奶量達(dá)到極顯著相關(guān)，對(duì)于SNP1，TT基因型個(gè)體的305d產(chǎn)奶量顯著高于CC型個(gè)體；對(duì)于SNP2，GG基因型個(gè)體305d產(chǎn)奶量顯著高于AA基因型個(gè)體。

SNP3位于上，位于牛20號(hào)染色體上，由24個(gè)外顯子組成。蛋白家族與RNA剪接體的功能相關(guān)，其表達(dá)模式和生物學(xué)功能研究至今未見實(shí)驗(yàn)性報(bào)道。本文初次研究了T14533269A位點(diǎn)與新疆褐牛泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性，結(jié)果表明該位點(diǎn)與乳脂率、總固體和SCS性狀達(dá)到顯著或極顯著關(guān)聯(lián)，對(duì)于乳脂率和總固體性狀，TT基因型個(gè)體顯著高于AA基因型個(gè)體。牛奶中體細(xì)胞數(shù)與奶牛乳房炎存在顯著的相關(guān)性，由于SCC分布是非正態(tài)的，通常將SCC轉(zhuǎn)化為體細(xì)胞評(píng)分來(lái)研究[26]。奶牛乳房炎是一種常見的奶牛疾病，對(duì)世界奶業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失極大，目前，已有許多學(xué)者開展了奶牛分子抗病育種研究工作，并取得了一定的成果。本研究得出T14533269A位點(diǎn)與新疆褐牛SCS性狀達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)，初次探討了與牛體細(xì)胞評(píng)分的關(guān)聯(lián)性。

SNP4和SNP10均位于上，結(jié)果表明兩位點(diǎn)與新疆褐牛產(chǎn)奶性狀無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)性。為鋅指蛋白基因本研究之前還未有該基因與中國(guó)荷斯坦牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)報(bào)道，2014年，SANTANA和OLIVEIRA等研究結(jié)果表明該基因與肉牛干物質(zhì)采食量有關(guān)[27-28]。JIANG等全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明鋅指蛋白中的一個(gè)位點(diǎn)（rs41627764）對(duì)北京地區(qū)中國(guó)荷斯坦牛乳脂率性狀有顯著影響[1]。

SNP5和SNP6位于上，為抗苗勒氏管激素II型受體，也叫苗勒管抑制物，屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βII型受體（）之一。最初分別由DI CLEMETE和BAARENDS等所在的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室用不同的方法于1994年克隆獲得[29-30]。關(guān)于基因大多是關(guān)于女性多囊性卵巢綜合征的研究[31-32]，而在牛上的研究相對(duì)較少，僅有的幾篇是關(guān)于牛卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)育研究[33-35]。CARTER等在瘤牛上研究了RNA表達(dá)與卵母細(xì)胞數(shù)量相關(guān)，且該基因與牛繁殖性能相關(guān)[36-37]。然而，目前該基因與牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性研究還未見報(bào)道。本研究得出SNP6與新疆褐牛乳蛋白率和總固體性狀達(dá)到極顯著關(guān)聯(lián)，而SNP5與新疆褐牛各產(chǎn)奶性狀未達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)。

SNP9與新疆褐牛乳糖率性狀達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)。該位點(diǎn)位于牛15號(hào)染色體上，ABAL等[38]研究表明，該基因可作為檢測(cè)人類子宮內(nèi)膜癌的分子標(biāo)記，COLAS等[39]研究結(jié)果表明，該基因在人類子宮內(nèi)膜腫瘤中的差異表達(dá)與其在相應(yīng)子宮液體樣品中的表達(dá)水平相關(guān)。但目前為止，關(guān)于該基因與奶牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)研究還未見報(bào)道。研究結(jié)果顯示，對(duì)于遺傳力低、只能在一個(gè)性別中表達(dá)、不能早期測(cè)量或測(cè)量難度大、成本高的性狀，標(biāo)記輔助選擇（MAS）相對(duì)于常規(guī)選擇法有較大優(yōu)勢(shì)。奶牛的產(chǎn)奶性狀（產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率）具有中等偏下的遺傳力，只在母牛表現(xiàn)且表現(xiàn)時(shí)間是在一胎產(chǎn)奶結(jié)束之后，因此，奶牛育種中實(shí)施MAS大有可為[40]。

3.3 單倍型與連鎖不平衡分析

有研究表明，與單標(biāo)記SNP相比，單倍型分析對(duì)復(fù)雜性狀的遺傳變異具有更好的效果[41]。隨著高通量SNPs檢測(cè)的出現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)的SNP量越來(lái)越多，需要進(jìn)行連鎖不平衡分析來(lái)估計(jì)有效群體的大小，長(zhǎng)距離連鎖不平衡可以用來(lái)估計(jì)近世代的有效群體大小，短距離連鎖不平衡可以用來(lái)估計(jì)遠(yuǎn)世代的有效群體大小[42-43]。本研究群體中，檢測(cè)的10個(gè)SNPs共構(gòu)成2個(gè)單倍型模塊，且均處于強(qiáng)連鎖不平衡狀態(tài)。由圖2可以看出，單倍型模塊與模塊之間連鎖程度較低，這可能是由于各個(gè)位點(diǎn)間物理位置相距較遠(yuǎn)所致。有研究表明，隨著物理距離的增加，LD呈遞減趨勢(shì)，但某些物理位置較遠(yuǎn)的SNP之間也可能存在強(qiáng)LD，?；蚪M不僅存在近距離的連鎖不平衡，而且遠(yuǎn)距離的標(biāo)記也以一定的模式存在連鎖不平衡[44]。

3.4 單倍型與泌乳性狀及SCS關(guān)聯(lián)分析

本研究未發(fā)現(xiàn)單倍型與新疆褐牛SCS和泌乳性狀的關(guān)聯(lián)性，可能是由于樣本量較少。何峰等研究結(jié)果表明單個(gè)位點(diǎn)乳脂量的效應(yīng)不顯著，而單倍型組合對(duì)乳脂量的效應(yīng)卻達(dá)到了顯著水平，由此可見，用多個(gè)SNPs構(gòu)建單倍型，進(jìn)而分析單倍型對(duì)產(chǎn)奶性狀的效應(yīng)，為以標(biāo)記輔助選擇為基礎(chǔ)的奶牛分子育種帶來(lái)更多的遺傳學(xué)信息[45]。

4 結(jié)論

本研究基于DNA混池重測(cè)序結(jié)果獲得的SNPs數(shù)據(jù)，篩選6個(gè)基因的10個(gè)SNP位點(diǎn)在169頭新疆褐牛群體中驗(yàn)證其遺傳多態(tài)性，并分析其對(duì)新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分和泌乳性狀的影響。初步發(fā)現(xiàn)了與新疆褐牛體細(xì)胞評(píng)分性狀有關(guān)，、和與新疆褐牛305 d產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和總固體性狀有關(guān)，其中A145332691T和C26758055G位點(diǎn)與新疆褐牛多個(gè)泌乳性狀達(dá)到顯著關(guān)聯(lián)，提示，這些SNPs可為新疆褐牛產(chǎn)奶性狀的分子標(biāo)記輔助選育提供參考依據(jù)，但各位點(diǎn)的遺傳效應(yīng)差異及突變對(duì)乳汁合成等生理生化反應(yīng)作用方面值得進(jìn)一步深入研究。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Genetic Effect Analysis of SNPs from 6 genes on SCS and Milk Production Traits in Xinjiang Brown Cattle

LIU LiYuan1,2, ZHOU JingHang2, ZHANG MengHua1, LI JinXia1, FANG JiQing3, TAN ShiXin4, WANG AiFang4, HUANG XiXia1, WANG YaChun5

(1College of Animal Science, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052;2School of Agriculture, Ningxia University, Yinchuan 750021;3Cattle Farm in Urumqi, Urumqi 830000;4Xinjiang Tianshan Animal Husbandry Biological Engineering Co., Ltd, Changji 831100, Xinjiang;5College of Animal Science and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193)

【Objective】The association between polymorphisms ofandgeneand somatic cell score (SCS) and milk production traits in Xinjiang brown cattle were studied in order to find out molecular markers association with SCS and/or milk production traits.【Method】Taking 169 Xinjiang brown cattle cows as experimental animals from Xinjiang Urumqi cattle farm and Xinjiang Tianshan Animal Husbandry and Biotechnology Co., Ltd. The experimental data including Dairy Herd Improvement records (including milk fat percentage, milk protein percentage, lactose percentage, total solid content and SCS) and milk yield of 305 d, 10 SNPs were selected from exon area based on the results of DNA sequencing of 15 Chinese Holstein cows in an initial study and genotyped by Sequenom MassARRAY Genotype technology, the association between SNPs or haplotype and SCS and milk yield traits were analyzed by the least squares method in the GLM procedure of SAS8.1.【Result】The results showed that the 10 SNPs were polymorphic, and 9 SNPs were in Hardy-Weinberg equilibrium. Association analysis results showed that two SNPs ingene (T98741711C and G98736141A) had a highly significant association with milk yield of 305 d in Xinjiang brown cattle(＜0.001), the milk yield of TT and GG genotype was the highest in T98741711C locus and G98736141A locus, respectively; C45667492G locus ingene had a significant association with milk lactose percentage (＜0.005), GG genotype was the highest;(T14533269A) had a significant association with milk fat percentage and total solid content(＜0.005) and had a highly significant association with SCS(＜0.001), milk fat percentage of TT genotype was the highest and SCS of AA genotype was higher than AT and TT genotypes;(C26758055G) had a highly significant association with milk protein percentage and total solid content(＜0.001), GG genotype was higher than CC and GC genotypes. The results of linkage disequilibrium analysis and haplotype construction revealed that the 10 SNPs constructed two haplotype blocks, among them, SNP1 and SNP2 were in linkage disequilibrium state(0.3＜2＜0.6), SNP4 and SNP10 in strong linkage disequilibrium state(2＞0.6). Then the correlation between haplotype and SCS and/or milk production traits was analyzed, and the results showed that haplotype had no significant association with SCS and milk production traits(＞0.001).【Conclusion】In this study, it was found that,,andgenes had a significant association with SCS and milk production traits, and the results of the study will provide a theoretical basis and reference for the molecular marker-assisted selection in Xinjiang Brown Cattle.

Xinjiang Brown Cattle; SCS; milk production traits; MassArray; association analysis

2016-11-03；接受日期：2017-04-28

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAD28B02）、現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（奶牛）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金（CARS-37）

劉麗元，E-mail：729124817@qq.com。通信作者黃錫霞，E-mail：au-huangxixia@163.com。通信作者王雅春，E-mail：wangyachun@cau.edu.cn