劉 斌，陳曉宇，黃銀君，牟克斌，張云娟，胡永浩

（1. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2. 天津威特生物醫(yī)藥有限責任公司，天津 300301；3. 福建省浦城縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，福建浦城 353400）

口蹄疫基因工程疫苗不同佐劑水相配比優(yōu)化研究

劉 斌1，2，陳曉宇2，黃銀君2，牟克斌2，張云娟3，胡永浩1

（1. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅蘭州 730070；2. 天津威特生物醫(yī)藥有限責任公司，天津 300301；3. 福建省浦城縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，福建浦城 353400）

[目的]選擇一種適合口蹄疫基因工程疫苗生產的佐劑。[方法]通過ISA 206和ISA201 VG油佐劑乳化后物理性狀檢驗，參照現(xiàn)有口蹄疫滅活疫苗乳化工藝，選用ISA 206和ISA201 VG油佐劑，分別用4.6:5.4、1:1、5.4:4.6的水相和油相比例進行乳化，制備疫苗，于2~8 ℃保存15個月，分別于第3、6、9、12、15個月取樣，進行疫苗物理性狀檢驗。[結果] ISA201VG佐劑疫苗物理性狀好于ISA 206油佐劑；疫苗水相和油相最佳配制比例為1:1；疫苗的外觀、劑型、穩(wěn)定性和黏度均符合產品的質量要求。[結論] ISA201VG佐劑可以作為口蹄疫基因工程疫苗佐劑使用。

乳化；疫苗；佐劑；口蹄疫

佐劑是指加入到疫苗制劑后能有效促進、增強或延長機體對抗原特異性免疫應答的物質。佐劑的選擇是疫苗乳化工藝的基礎，穩(wěn)定的疫苗乳劑能有效提高動物抵抗疫病的能力。因此，選擇合適的佐劑，確定最佳的水相與油相比例，對于疫苗的穩(wěn)定性具有重要的意義。目前，市場的口蹄疫滅活疫苗均采用ISA 206佐劑進行乳化，新型的基因工程疫苗暫時還未見適合的乳化佐劑。ISA 201 VG佐劑是一種針對基因工程產品研發(fā)的一種新型佐劑。與ISA 206相比，ISA 201VG可以更有效地改善免疫反應和保護力，可用于制備針對病原體族交叉保護型疫苗，誘導產生更高水平的IgG2a和TCD8+[1]。因此，本研究采用新型ISA 201VG與原ISA 206佐劑進行乳化后疫苗的物理性狀對比實驗，已確定更適合基因工程疫苗產品的乳化佐劑。

水包油包水劑型（W/O/W）是目前口蹄疫疫苗的主要劑型[2]，從內到外依次具有內水相、內-水油界面膜、油相、外-油水界面膜、外水相等。這種性質使它能將一些性質不同的物質溶解在不同的相中，從而起到緩釋、隔離、保護的作用。因此在化妝品[3]、生物制劑[4]、食品[5]等領域都得到廣泛應用。乳劑的穩(wěn)定性包括復合界面膜、優(yōu)化油相組成、穩(wěn)定內水相、改進制備工藝等方面[6-7]。穩(wěn)定的乳劑狀態(tài)，能刺激動物產生長久持續(xù)的免疫反應，直接關系到產品質量，所以多數疫苗生產企業(yè)將質量控制中的物理性狀檢驗列為重中之重。

1 材料與方法

1.1 試劑

中間品純化抗原，由天津威特生物醫(yī)藥有限責任公司發(fā)酵工程疫苗生產線提供；油佐劑ISA 206和ISA 201 VG，購自賽彼科（上海）特殊化學品有限公司；其他分析純試劑，均購自國藥集團。

1.2 儀器與設備

移液器，購自德國 Eppendorf公司；醫(yī)用離心機（型號L720R-3），購自湘儀公司；潔凈工作臺（型號SW-CJ-2FD），購自蘇凈安泰公司；小型乳化機，購自德國FLUKO公司；黏度儀，購自美Brookf i eld公司。

1.3 方法

1.3.1 水相和油相配制比例。以中間品檢驗合格抗原作為水相，ISA 206和ISA 201 VG油佐劑為油相。分別按照水相和油相為4.6:5.4、1:1、5.4:4.6進行疫苗乳化，分ISA 206組與ISA 201 VG組，每組3批，編號為BC01（水油比為4.6:5.4）、BC02（水油比為1:1）、BC03（水油比為5.4:4.6）。將乳化后的疫苗分裝，2~8℃保存；分別于第3、6、9、12、15個月取樣，進行物理性狀檢驗。

1.3.2 疫苗乳化。參照賽彼科公司提供的使用MontanideTMISA佐劑制備水包油包水型（W/O/W）乳劑方法制備。

1.3.3 物理性狀檢驗

1.3.3.1 外觀。眼觀乳白色略帶黏滯性乳狀液。

1.3.3.2 劑型。采用滴液實驗，取1只清潔吸管，將乳化后的ISA 206和ISA 201 VG乳劑滴入清潔冷水中，液體停留在水面判定為水包油型（W/O）；液滴溶入水中判定為油包水型（O/W）；一部分停留在水面形成白色圈狀，另一部分溶于水中，呈云霧狀擴散，判定為水包油包水型（W/O/W）。

1.3.3.3 穩(wěn)定性。采用離心分層后的水相體積衡量，吸取疫苗10 mL加入離心管中，以3 000 r/min離心15 min，讀取離心管中的底部析出的水相的體積，管底析出的水相不超過0.5 mL為合格。

1.3.3.4 黏度。按《中國獸藥典》（2010年版）附錄，使用黏度計法進行檢驗，先將存放在2~8 ℃的冷庫中的乳劑置（20±0.1）℃水浴鍋內30 min；如果直接取樣檢測，則不作水浴處理。將乳劑充分搖勻，然后倒入300 mL錐形燒杯，將黏度儀轉子浸入乳劑中；將轉子以一定的角速度旋轉，待顯示屏上cP數值穩(wěn)定后，記錄黏度值。黏度小于200 cP判定為合格。

2 結果

2.1 外觀

所有乳劑眼觀均為乳白色略帶粘滯性乳狀液（表1、表2）。

2.2 劑型

所有乳劑滴入水中均呈現(xiàn)云霧中擴散，判定劑型為水包油包水型（W/O/W）（表1、表2）。

2.3 穩(wěn)定性

以ISA 206和ISA 201 VG油佐劑為油相不同比例的乳劑，保存15個月，兩種佐劑顯示結果大致相同。通過穩(wěn)定性檢驗表明BC02（水相與油相比例1:1）組疫苗乳化效果最好，在12個月保存期內，物理性狀穩(wěn)定，未出現(xiàn)分層、破乳現(xiàn)象，第15個月離心檢驗中略有水相析出。在第15個月，疫苗離心后析出水相略有升高，但外觀、劑型、穩(wěn)定性、黏度仍符合標準要求；BC01和BC03組疫苗在保存期內均有不同程度分層，保存至第9個月時，BC01離心油相析出較多，BC03離心水相析出較多（表1、表2）。

2.4 黏度

所有乳劑通過黏度計檢測，黏度均未超過40 cP，符合小于200 cP口蹄疫疫苗質量標準（表1、表2）。

表1 ISA 206乳化疫苗物理性狀檢驗結果

表2 ISA 201 VG乳化疫苗物理性狀檢驗結果

3 討論

動物疫苗常用來接種免疫動物，它有助于動物機體抵御外來病原體、毒素等的入侵。在疫苗的研發(fā)過程中需要從多個因素對其進行衡量。一種好的疫苗除了具有高效性、穩(wěn)定性、持久性外，還必須具備安全性，即被免疫動物所受到的刺激小、副反應小等。這就使疫苗研究涉及到其重要的組成部分，佐劑的選擇與配比。佐劑最初被發(fā)現(xiàn)可增強疫苗的免疫效力。能通過增強局部炎癥反應，提高對免疫反應的誘導。其特有的貯庫效應能使抗原緩慢且持續(xù)性地進入機體，通過緩釋減少對機體的刺激，延長抗原作用時間，保持長久穩(wěn)定的免疫效果，防止抗原過快退化[8-10]。同時佐劑能增強抗原呈遞，提高免疫應答，有些佐劑還具有靴向效應。有效的佐劑應增強抗原呈遞并促進T細胞與B細胞的激活?？乖Ａ粼谧⑸洳课换蛄馨徒Y的持久性成為影響免疫反應效果持續(xù)性的重要因素。佐劑效應己被證明，抗原從注射部位釋放的速率是維持抗原特異性免疫應答的關鍵因素[11]。根據佐劑的作用機制，選擇佐劑可以從以下幾方面進行參考：①發(fā)病機制清楚，佐劑可根據疫苗進行選擇，達到防護免疫反應的效果；②免疫學和發(fā)病機制尚不清楚，從引發(fā)不同免疫反應的佐劑中進行選擇；③利用己有研究將佐劑聯(lián)用，根據所需加強不同的免疫反應，從而達到更好的佐劑效應[12]。

本試驗從不同佐劑與水相油相配制比例的選擇上對口蹄疫基因工程疫苗進行了研究，旨在從物理性狀檢驗判定一種與之匹配的新型基因工程疫苗的佐劑。除此之外，還需根據動物免疫抗體的檢驗結果來進行評價。

基層防疫工作者在疫苗的使用中，能從疫苗的顏色、狀態(tài)簡單判斷一種疫苗是否符合注射標準、是否污染、是否過期。從成品檢驗的物理性狀檢驗來分析疫苗的乳化工藝，能最直觀、簡便、快速的判斷疫苗的優(yōu)劣。一個成熟的疫苗乳化工藝，關系到整個產品的質量，它需要從乳化的溫度控制、攪拌攪拌、壓力、油水相混合等因素進行綜合衡量，這就需要與其相匹配的檢驗方法與標準。一種新型基因工程疫苗從工藝開發(fā)到檢驗標準制定都是漫長的過程，需要借鑒與參考同類產品的技術來進行工藝研究，才能生產出合格而又優(yōu)質的產品，使其早日面市，這也將為口蹄疫疫苗的多元化發(fā)展提供一種新的思路。

[1] LI D，ZHOU C X，SHE D L，et al. The comparison of the eff i cacy of swine FMD vaccine emulsif i ed with oil adjuvant of ISA 201VG or ISA 206 VG [J]. Journal of Biosciences and Medicines，2013，1（3）：22-25.

[2] PERVAIZ D，RAMYA K，NURU S，et al. Montanide IS 201 adjuvanted FMD vaccine induces improved immune responses and protection in cattle [J]. Vaccine，2013，31（33）：3327-3332.

[3] TADROS T F. Future development in cosmetic formulations [J]. Int J Cosmet Sci，1992，14（3）：93-111.

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[6] NISSIM G. Progress in stabilization and transport phenomena of double emulsions in food applications [J]. Lebensmitted Wissenschaft and Technologie，1997，30（3）：222-235.

[7] KANOUNI M，BOSANO H L，NAOULI N. Preparation of a stable double emusion（W/O/W）：role of the interfacial fi lms on the stability of the system [J]. Advances in Colloid and Interface Science，2002，99（3）：229-254.

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[12] JOHN C C，ALAN R C. Adjuvants a Classif i cation and Review of Their Modes of Action [J]. Vaccine，1997，15（3）：248-256.

（責任編輯：朱迪國）

Optimization of Water Mixture Ratio of Different Adjuvants of FMD Gene Engineering Vaccine

Liu Bin1，2，Chen Xiaoyu2，Huang Yinjun2，Mu Kebin2，Zhang Yunjuan3，Hu Yonghao1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070；2. Tianjin Witte Biological Medicine Co. Ltd，Tianjin 300301；3. Pucheng Animal Health Inspection Institution，Pucheng，F(xiàn)ujian 264000）

[Objective] In order to choose an adjuvant suitable for foot-and-mouth disease（FMD）of the genetic engineering vaccine. [Methods] By ISA 206 and ISA201 VG emulsif i ed oil adjuvants after physical properties test，according to the existing FMD inactivated vaccines emulsification process，choosing the ISA 206 and ISA201 VG oil adjuvant，using the proportion of water and oil phase emulsif i cation of 4.6:5.4，1:1 and 5.4:4.6 respectively，the vaccine was prepared and then was saved at 2~8 ℃. The samples were tested of vaccine physical characteristics at the third，sixth，ninth，12th and 15th month，respectively. [Results] It′s showed that ISA201VG adjuvant vaccine was better than ISA 206 oil adjuvants in physical properties. The best preparation ratio of vaccine water phase and oil phase was 1:1. The appearance，formulation，stability and viscosity of the vaccine were all satisfactory in product quality. [Conclusion] ISA201VG adjuvant could be used as the disease gene engineering vaccine adjuvant.

emulsify；vaccine；adjuvant；FMD

S851.3

：A

：1005-944X（2017）07-0096-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.027

天津市支持科研院所來津發(fā)展項目（16PTYJNC00060）

胡永浩