李媚，曾平，袁宇，覃琴，陳熠嘉，廖安平

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西高?；瘜W(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006）

響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)右旋糖酐腸膜明串珠菌的發(fā)酵培養(yǎng)基

李媚，曾平，袁宇，覃琴，陳熠嘉，廖安平*

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣西高校化學(xué)與生物轉(zhuǎn)化過程新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530006）

為提高右旋糖酐的產(chǎn)率，對腸膜明串珠菌CICC-21725發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)中心設(shè)計(jì)原理，采用響應(yīng)面法確定培養(yǎng)基成分間交互作用及最優(yōu)組成。結(jié)果表明：優(yōu)化后各培養(yǎng)基成分為蔗糖80.0 g/L，蛋白質(zhì)7.0 g/L，磷酸氫二鈉1.5 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，在pH7.1、25℃、150 r/min時發(fā)酵21 h，右旋糖酐產(chǎn)率可達(dá)92.79%，與單因素優(yōu)化后的右旋糖酐產(chǎn)率相比，提高了7.2%。紅外光譜及核磁共振分析表明，發(fā)酵產(chǎn)物為右旋糖酐。

腸膜明串珠菌；右旋糖酐；培養(yǎng)基優(yōu)化；響應(yīng)面法

右旋糖酐是由葡萄糖單元構(gòu)成的高分子微生物多糖[1]，在食品、化學(xué)分析、醫(yī)藥等行業(yè)具有重要利用[2-6]。右旋糖酐具有無毒安全等優(yōu)點(diǎn)，是一類獲得美國食品與藥品管理局批準(zhǔn)，可以在食品中使用的多糖。在食品行業(yè)，作為増稠劑用于冰激凌和果醬生產(chǎn)；面包生產(chǎn)中提高保水性及膨脹度；可作為低熱量糖類用于果汁、飲料中；啤酒生產(chǎn)中，替代部分麥芽糖提高發(fā)泡性；目前工業(yè)上主要采用腸膜明串珠菌為工程菌，胞外利用蔗糖合成右旋糖酐[7-8]。微生物法產(chǎn)右旋糖酐引起國外學(xué)者廣泛關(guān)注[9-12]，微生物法首先要為菌體生長和酶產(chǎn)生提供有利條件，培養(yǎng)基組成優(yōu)化是提高微生物產(chǎn)酶量、降低發(fā)酵生產(chǎn)成本的重要途徑[10]。響應(yīng)面法可獲得因素與響應(yīng)值間的連續(xù)關(guān)聯(lián)模型，因而被廣泛地應(yīng)用于菌體的發(fā)酵優(yōu)化和模型建立中[7-9]。本試驗(yàn)采用腸膜明串珠菌（CICC-21725），在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化以提高右旋糖酐的產(chǎn)率，為該菌的應(yīng)用提供可靠數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

腸膜明串珠菌（CICC-21725）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；LT-XT恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：瑞士AdolfKuhner公司；Nicolet IS10傅里葉紅外光譜儀：美國 Thermo 公司；13C（150MHz），1H（600 MHz）核磁共振光譜儀：美國Varian公司。種子培養(yǎng)基：蔗糖130 g/L，蛋白胨2.0 g/L，磷酸氫二鈉1.4 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L（以上藥品均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

配制腸膜明串珠菌種子培養(yǎng)液/發(fā)酵培養(yǎng)液→調(diào)節(jié)pH7.1并滅菌→種子培養(yǎng)液接種培養(yǎng)（從斜面固體培養(yǎng)基上取3環(huán)）→發(fā)酵培養(yǎng)液接種培養(yǎng)（按發(fā)酵液的10%取種子液）→產(chǎn)物稀釋后離心分離菌體→乙醇沉淀→離心及無水乙醇洗滌→離心后干燥→稱量產(chǎn)物重量計(jì)算右旋糖酐產(chǎn)率。

1.3 分析方法

1.3.1 右旋糖酐產(chǎn)率測定

準(zhǔn)確稱取一定培養(yǎng)時間的培養(yǎng)液，采用乙醇沉淀分離右旋糖酐，沉淀物分別用無水乙醇和丙酮多次洗滌離心，干燥；同時測出種子液帶入的右旋糖酐量。右旋糖酐量產(chǎn)率Y按（1）式計(jì)算。

式中：m為培養(yǎng)初始液中蔗糖量，g；2.111為蔗糖轉(zhuǎn)化為右旋糖酐理論量的換算因數(shù)；m1為培養(yǎng)完成液中獲得的右旋糖酐量，g；m0為加入的種子液帶入培養(yǎng)液中的右旋糖酐量，g。

1.3.2 右旋糖酐產(chǎn)物紅外光譜分析和核磁共振分析

將干燥的右旋糖酐產(chǎn)品與KBr混合壓片制得樣品，進(jìn)行紅外光譜分析。發(fā)酵產(chǎn)物采用美國瓦里安公司的600 MHz光譜儀（VMNRS）進(jìn)行核磁共振氫譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 蔗糖濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響

選取培養(yǎng)基初始液中蔗糖依次為50.0、100.0、150.0、200.0、250 g/L，其它組分：蛋白質(zhì) 2.0 g/L、Na2HPO41.5 g/L、KH2PO45.0 g/L，其余為二次蒸餾水。按1.2試驗(yàn)方法，在25℃、150 r/min，培養(yǎng)21 h，考查蔗糖濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，試驗(yàn)選定范圍內(nèi)，蔗糖濃度為100.0 g/L時，右旋糖酐產(chǎn)率最高。當(dāng)蔗糖濃度超過100.0 g/L，右旋糖酐產(chǎn)率隨著蔗糖濃度的增加而減少，增加發(fā)酵液中蔗糖含量使?jié)B透壓變大從而影響菌體生長，所以蔗糖濃度選擇100.0 g/L。

2.2 蛋白胨對右旋糖酐產(chǎn)率的影響

選取蛋白胨為 3.0、5.0、7.0、9.0、11.0 g/L 時，蔗糖、Na2HPO4、KH2PO4依次為 100.0、1.5、0.3 g/L，按 1.2 試驗(yàn)方法，在25℃、150 r/min培養(yǎng)21 h，考查蛋白胨濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖2。

圖1 蔗糖濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響Fig.1 The change of sucrose concentration on the influence of dextran yield

圖2 蛋白質(zhì)濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響Fig.2 The change of peptone concentration on the influence of dextran yield

由圖2可知，試驗(yàn)選定范圍內(nèi)，蛋白胨濃度為7.0 g/L時，右旋糖酐產(chǎn)率最大，蛋白胨是腸膜明串珠菌生長繁殖氮源，當(dāng)?shù)鞍纂撕窟^高對菌體的生長產(chǎn)生毒副作用而影響產(chǎn)物的合成，所以蛋白胨濃度選擇7.0 g/L。

2.3 磷酸二氫鈉對右旋糖酐產(chǎn)率的影響

選取 Na2HPO4為 0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 g/L 時，蔗糖、蛋白胨、KH2PO4依次為 100.0、7.0、0.1 g/L，按 1.2 方法，在25℃、150 r/min培養(yǎng)21 h?？疾榱姿岫溻c濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 磷酸氫二鈉濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響Fig.3 The change of Na2HPO4concentration on the influence of dextran yield

無機(jī)鹽是微生物生長所需的元素，一定濃度無機(jī)鹽可促進(jìn)菌體的生長，同時對發(fā)酵液pH值起調(diào)節(jié)作用。由圖3結(jié)果可知，當(dāng)Na2HPO4含量在0.5 g/L～1.5 g/L時，右旋糖酐產(chǎn)率隨著Na2HPO4含量增加而提高，但是Na2HPO4濃度達(dá)到3 g/L時，由于Na2HPO4的濃度過高影響了菌體的生長、抑制右旋糖酐轉(zhuǎn)化酶活性，右旋糖酐產(chǎn)率急劇下降。所以Na2HPO4濃度為1.5 g/L較為適宜。

2.4 磷酸二氫鉀對右旋糖酐產(chǎn)率的影響

選取 KH2PO4濃度為 0.1、0.3、0.5、0.7、1.4 g/L 時，蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4分別為 100.0、7.0、1.5 g/L，按1.3方法，在25℃、150 r/min培養(yǎng)21 h。考察KH2PO4含量對右旋糖酐產(chǎn)率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 磷酸二氫鉀濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的影響Fig.4 The change of KH2PO4concentration on the influence of dextran yield

由圖4可知，在試驗(yàn)研究范圍內(nèi)，當(dāng)KH2PO4濃度為0.3 g/L時，右旋糖酐產(chǎn)率最高，達(dá)到92.2%，KH2PO4濃度超過0.3 g/L后，隨著KH2PO4濃度增加右旋糖酐收率下降，特別是當(dāng)KH2PO4濃度達(dá)到1.4 g/L時，右旋糖酐產(chǎn)率急劇下降到13.8%，KH2PO4濃度過高影響腸膜明串珠菌生長，同時抑制右旋糖酐蔗糖酶的活性，從而阻礙了右旋糖酐的合成，所以KH2PO4濃度取0.3 g/L較為適宜。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化腸膜明串珠菌的發(fā)酵條件

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，考察蔗糖濃度、蛋白胨濃度、磷酸氫二鈉濃度和磷酸二氫鉀濃度對右旋糖酐產(chǎn)率的交互影響，以右旋糖酐產(chǎn)率為響應(yīng)值Y，設(shè)計(jì)如表1所示四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert8.0對表2試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元方程的回歸擬合，得到產(chǎn)率Y對自變量A、B、C和D的回歸方程如式（2）所示。

對回歸擬合模型進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface method

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The design of experiment and result of response surface

由表3可知，回歸擬合模型P＜0.000 1，擬合模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.157＞0.05，差異不顯著，表示此模型合理且不必在引入更高次的項(xiàng)；模型擬合系數(shù)R2為0.996 6，R2adj為0.993 2，擬合模型能闡明99.32%的響應(yīng)值的改變。變異系數(shù)為0.29，較小，說明擬合模型置信度較高。因此擬合模型用于右旋糖酐合成的培養(yǎng)基組合分析和預(yù)測是可靠的。

由表 4 可知，通過模型因素 A、A2、B2、C2和 D2極顯著，說明培養(yǎng)基中蔗糖濃度對右旋糖酐收率有高度顯著的影響，各影響因素對于右旋糖酐收率的影響并非是線性關(guān)系。由表4中F值大小可知，各因素對右旋糖酐收率影響強(qiáng)度為A＞B＞D、C。因素 A、B、C、D與產(chǎn)率的響應(yīng)面及其等高線見圖5～圖10。

表4 回歸系數(shù)方差分析Table 4 Variance analysis for each regression coefficient

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析獲得腸膜明串珠菌（CICC-21725）最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4依次是 80.25、6.97、1.50、0.30 g/L，右旋糖酐產(chǎn)率最大響應(yīng)值為92.84%。將優(yōu)化得到各組分中的蔗糖濃度和蛋白胨濃度調(diào)整為80.0 g/L和7.0 g/L后進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到右旋糖酐的平均產(chǎn)率為92.79%，與擬合模型理論預(yù)測值較相近。

圖5 蔗糖和蛋白胨的濃度影響右旋糖酐產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of sucrose and peptone concentration on the influence of dextran yield

圖6 蔗糖和磷酸氫二鈉濃度影響右旋糖酐產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of sucrose and Na2HPO4concentration on the influence of dextran yield

圖7 蔗糖和磷酸二氫鉀濃度影響右旋糖酐產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface of sucrose and KH2PO4concentration on the influence of dextran yield

2.6 腸膜明串珠菌發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征

紅外光譜分析：將干燥的右旋糖酐產(chǎn)品與KBr混合壓片制得樣品，傅里葉變換紅外光譜儀掃描，掃描波數(shù)在 4 000 cm-1～400 cm-1處，分辨率是 8 cm-1，結(jié)果見圖11。

圖9 蛋白胨和磷酸二氫鉀濃度影響右旋糖酐產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface of peptone and KH2PO4concentration on the influence of dextran yield

圖10 磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀濃度影響右旋糖酐產(chǎn)率的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface of Na2HPO4and KH2PO4concentration on the influence of dextran yield

由圖11可知，在3 700 cm-1～3 100 cm-1處是-OH鍵的伸縮振動吸收峰，在2 923 cm-1處是C-H鍵的伸縮振動吸收峰，在1 646 cm-1處是因結(jié)合水引起的-OH鍵的伸縮及彎曲振動吸收峰，在1 419 cm-1和1 368 cm-1處分別為右旋糖酐上CH2和C-H的變形振動吸收峰，在1 152 cm-1和907 cm-1處分別是糖苷鍵和C-O-C的伸縮振動吸收峰，在1 012 cm-1和845 cm-1處的是右旋糖酐的特征峰，其中845 cm-1處有峰表明發(fā)酵產(chǎn)物為α-型右旋糖酐[13-14]。

1H NMR：將腸膜明串珠菌的發(fā)酵產(chǎn)物溶于D2O中，分別用600MHz的VMNRS超導(dǎo)核磁共振波譜儀進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖12。

圖11 腸膜明串珠菌產(chǎn)物的紅外掃描圖譜Fig.11 FT-IR spectrum of Leuconostoc Mesenteroides product

圖12 發(fā)酵產(chǎn)物的1H NMR圖Fig.12 1H NMR spectrum of Leuconostoc Mesenteroides product

由圖 12可知，在 4.95 ppm 處的為 α-（1，6）糖苷鍵 C1 上異頭氫 H1 的吸收峰，在 3.96、3.89、3.70、3.56、3.49 ppm 處分別為此單元上 H5、H6、H3、H2、H4 的吸收峰。在大于4.95 ppm處沒有其它的異頭氫的吸收，說明該產(chǎn)品為α-（1，6）糖苷鍵連接的直鏈右旋糖酐[15-16]。

3 結(jié)論

通過腸膜明串珠菌（CICC-21725）發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn)及Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)和分析得到右旋糖酐的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4、KH2PO4依次是 80.0、7.0、1.50、0.30 g/L。用優(yōu)化后的培養(yǎng)液組成調(diào)節(jié)pH為7.1時，在25℃和150 r/min的搖床中發(fā)酵21 h得到右旋糖酐的產(chǎn)率為92.79%，并且分別用傅里葉紅外光譜和VMNR1H NMR對產(chǎn)品進(jìn)行表征，結(jié)果表明該產(chǎn)品是由α-（1，6）糖酐鍵連接的無支鏈的α右旋糖酐。

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Optimization of the Fermentation Medium of Leuconostoc Mesentoroides（CICC-21725）by Response Surface Methodology

LI Mei，ZENG Ping，YUAN Yu，QIN Qin，CHEN Yi-jia，LIAO An-ping*
（School of Chemistry and Chemical Engineering of Guangxi University for Nationalities，Guangxi Key Laboratory Cultivation Base for Polysaccharide Materials and their Modification，Key Laboratory of Chemical and Biological Transformation Process of Guangxi Higher Education Institutes，Nanning 530006，Guangxi，China）

In order to improve the yield of dextran，the fermentation midium of Leuconostoc Mesenteroides CI－CC-21725 had been optimized.On the basis of single factor experiments，according to the principle of design center，the response surface method was adopted to determine the interaction between medium composition and the optimal composition of medium composition.The medium optimized results indicated when sucrose，peptone，disodium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate were 80.0，7.0，1.5 g/L and 0.3 g/L，adjusted pH to 7.1，fermentation 21 h at 25℃ and 150 r/min，dextran yield could reach 92.79%.The dextran yield increased 7.2%compared with the best ruslt after single factor optimization.Infrared spectrum and nuclear magnetic resonance（NMR）analysis showed that the fermentation products was dextran.The dextran yield was also improved after the medium composition had optimized through the response surface method.

Leuconostoc Mesenteroides；dextran；medium optimization；response surface method

2016-08-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.038

廣西高校人才小高地建設(shè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（桂教人[2011]47）；廣西科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金（桂科轉(zhuǎn)13109067）；廣西民族大學(xué)-廣西化工研究院研究生聯(lián)合培養(yǎng)基地專項(xiàng)資金（研究生聯(lián)合培養(yǎng)機(jī)制改-2013年113000100030001）

李媚（1972—），女（壯），副教授，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：化學(xué)與生物過程強(qiáng)化。

*通信作者：廖安平（1964—），男（漢），教授，碩士生導(dǎo)師，博士。