劉宏毅, 葉小真, 陳慧潔, 李慧敏, 丁 奕, 楊澤慧, 馮麗貞

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建 福州 350002)

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桉樹焦枯病菌CpSit1基因的鑒定與表達(dá)

劉宏毅1, 葉小真2, 陳慧潔1, 李慧敏1, 丁 奕1, 楊澤慧1, 馮麗貞1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)金山學(xué)院，福建 福州 350002)

利用Blast及TCDB數(shù)據(jù)庫對桉樹焦枯病菌(Calonectriapseudoreteaudii)的Cpsit1基因進(jìn)行鑒定；再利用SMART數(shù)據(jù)庫和ProtParam、TMHMM、PHD、ProComp 9.0在線分析工具對Cpsit1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、跨膜螺旋、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測分析；最后采用qRT-PCR方法對CpSit1基因在焦枯病菌侵染桉樹過程中的表達(dá)情況進(jìn)行分析.結(jié)果表明：CpSit1基因長度為1 780 bp，其編碼的蛋白序列共有592個氨基酸殘基組成，并將其鑒定為鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運蛋白.其保守結(jié)構(gòu)域為MFS_1；共含有14個跨膜螺旋；在二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占45.10%，延伸鏈占26.01%，無規(guī)則卷曲占28.89%.通過qRT-PCR相對定量的方法分析焦枯病菌侵染桉樹24、48和72 h后CpSit1基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，CpSit1基因在這3個時段均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，但24 h的表達(dá)量明顯大于48和72 h.說明桉樹焦枯病菌CpSit1基因在病原菌侵染寄主的過程中通過調(diào)控鐵載體-鐵化合物的轉(zhuǎn)運來完成鐵元素的攝入，協(xié)助其在寄主中的定植.

桉樹; 焦枯病; 鐵載體轉(zhuǎn)運蛋白; 生物信息學(xué)分析; 表達(dá)分析

在大多數(shù)原核生物和所有真核生物中，鐵元素是各種生命活動的必需元素.地殼中，鐵元素的儲量豐富，但是其難溶性大大限制了真菌對鐵的直接吸收.在生境中鐵元素含量較低時，大多數(shù)微生物和部分植物通過分泌鐵載體與Fe3+結(jié)合為鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[1].大多數(shù)真菌存在4種異羥肟酸型鐵載體，即鐮孢氨酸、糞生素、鐵色素和羅丹明酸，主要由非核糖體肽合成酶(NRPSs, non-ribosomal peptide synthetases)合成[2].鐵載體-鐵轉(zhuǎn)運蛋白屬于MFS超家族，在缺鐵的生境下通過轉(zhuǎn)運鐵載體-鐵化合物為微生物的生長發(fā)育提供鐵元素.SIT轉(zhuǎn)運蛋白具有典型的MFS結(jié)構(gòu)域，家族成員大多數(shù)由400～600個氨基酸殘基組成，N端和C端均位于胞內(nèi)[3].目前已知的SIT轉(zhuǎn)運蛋白均含有14個跨膜α螺旋，多出的2個跨膜螺旋是由胞內(nèi)中間的環(huán)狀區(qū)插入膜中產(chǎn)生的[4].大部分微生物都通過獨特的代謝途徑來獲取生境中的鐵元素.大多數(shù)病原真菌主要通過還原鐵吸收系統(tǒng)或通過分泌鐵載體來獲取鐵元素.目前研究證明SIT轉(zhuǎn)運蛋白作為鐵載體-鐵化合物在運輸載體中發(fā)揮著重要作用，如禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)FgSit1基因編碼的SIT轉(zhuǎn)運蛋白負(fù)責(zé)調(diào)控鐵載體-鐵化合物FC-Fe3+的吸收[5]；構(gòu)巢曲霉(Emericellanidulans)的SIT轉(zhuǎn)運蛋白MIRB與鐵載體-鐵化合物三乙酰鐮孢氨酸的轉(zhuǎn)運有關(guān)[6]；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Arn1p轉(zhuǎn)運蛋白通過轉(zhuǎn)運生境中的鐵載體-鐵化合物來獲取鐵元素[7].

桉樹焦枯病(Calonectriapseudoreteaudii)是熱帶和亞熱帶地區(qū)桉樹種植區(qū)最為嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重影響桉樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[8].桉樹焦枯病菌是由麗赤殼屬(Calonectria)真菌引起的病害，其無性態(tài)為帚梗柱孢屬(Cylindrocladium)真菌[9].據(jù)統(tǒng)計，Calonectria現(xiàn)有集群13個，共71種.研究[10-12]表明C.pseudoreteaudii是福建省內(nèi)最早發(fā)現(xiàn)的、分布最廣、致病力最強(qiáng)的病原菌株，并對C.pseudoreteaudii基因組測序及桉樹組織誘導(dǎo)48 h的焦枯病菌轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)Cp_Cap02212基因發(fā)生上調(diào)倍數(shù)高達(dá)746倍.為了探討該基因在焦枯病菌侵染桉樹過程中所起的作用，本文通過多種生物信息學(xué)軟件對其編碼基因、蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位等進(jìn)行分析，并對其功能進(jìn)行預(yù)測，最后通過實時熒光定量PCR對其在焦枯病菌侵染桉樹24、48、72 h 3個階段的表達(dá)情況進(jìn)行分析，為揭示桉樹焦枯病菌的致病機(jī)理提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株 為C.pseudoreteaudiiYA51,由福建農(nóng)林大學(xué)森林保護(hù)研究所于福建永安桉樹焦枯病危害區(qū)采集分離獲得.基因組NCBI 檢索編號為MOCD01000000.

1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑 本試驗選用桉樹抗焦枯病品系尾細(xì)桉M1(Eucalyptusurophylla×E.tereticornis)的葉片對焦枯病菌(C.pseudoreteaudii)進(jìn)行培養(yǎng).含桉樹組織PDB培養(yǎng)基：將桉樹葉片研磨成粉末狀，以0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入200 mL的PDB培養(yǎng)基中，高溫滅菌.總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR、實時熒光定量PCR的試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 以Cp_Cap02212的蛋白序列為探針序列，與NCBI的nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對，獲得初步鑒定結(jié)果；再將Cp_Cap02212的蛋白序列與TCDB數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對其所屬蛋白家族進(jìn)行鑒定，并命名.

CpSit1轉(zhuǎn)運蛋白的理化性質(zhì)利用ProtParam進(jìn)行分析；應(yīng)用SMART數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線比對，分析其結(jié)構(gòu)域；采用在線分析工具TMHMM分析跨膜螺旋；采用在線分析工具PBIL和PHD分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，該分析基于ASTP和MaxHom.亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位預(yù)測采用ProComp 9.0在線工具.

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 從TCDB數(shù)據(jù)庫中下載MFS家族典型亞家族的蛋白序列，通過MEGA7.0軟件[13]進(jìn)行多重比對，并采用臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000次，其余參數(shù)均為默認(rèn)值.

1.2.3 桉樹焦枯病菌菌株培養(yǎng) 將桉樹焦枯病菌接種于PDA培養(yǎng)基(瓊脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%)中，培養(yǎng)10 d后用直徑為6 mm的打孔器取獲菌餅；分別接種于含桉樹組織的PDB培養(yǎng)基(含20 μL氨芐青霉素)中，作為處理組；不含桉樹組織的作為對照組.每個處理組及對照組各有3個培養(yǎng)基，每個培養(yǎng)基中加入3個菌餅；然后置于搖床中搖晃培養(yǎng)，分別于24、48和72 h取出相應(yīng)的對照組和處理組，用微孔濾膜收集菌絲，濾紙濾干后用錫紙包裹，于-80 ℃冰箱中保存.

1.2.4CpSit1基因表達(dá)分析 采用RNAprep Pure Plant Kit離心柱型試劑盒提取總RNA，提取完成后用Denovix公司生產(chǎn)的超微量核算濃度檢測儀檢測RNA濃度及質(zhì)量；對于RNA濃度符合RT-PCR要求的處理組，用FastQuant RT Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，樣品于-20 ℃冰箱中保存.引物設(shè)計采用Beacon Design 7.9軟件，委托生工生物工程有限公司合成.CpSit1基因的引物序列為F-GAAACCCAGCGATTGATG，R-TAACCTCCTTCCAGAACAG；內(nèi)參基因(β-tublin)的引物序列為F-CTATCTTCCGTGGTAAGG，R-TAGGTGGAGTTCTTGTTC.

采用Talent qPCR PreMix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL體系.2×Talent qPCR Mix 10.0 μL；上游引物0.6 μL；下游引物0.6 μL；cDNA模板1.0 μL；50×ROX Reference Dye 0.4 μL；RNase-Free ddH2O 7.4 μL.加樣完成后采用兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性30 min，1個循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸15 s，40個循環(huán).反應(yīng)程序完成后采用2-△△CT方法進(jìn)行分析.

2 結(jié)果與分析

2.1CpSit1基因鑒定

將Cp_Cap02212蛋白序列與nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastp比對，發(fā)現(xiàn)與Phaeoacremoniumminimum的SIT轉(zhuǎn)運蛋白序列的一致性高達(dá)64%.通過與TCDB數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，Cp_Cap02212的蛋白序列與構(gòu)巢曲霉SIT轉(zhuǎn)運蛋白MIRB的蛋白序列的一致性為37%，相似性達(dá)到57.8%，推測其可能為鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運蛋白，并命名為CpSit1.CpSit1基因的堿基序列長度為1 780 bp，位于基因組中Scaffold 21正鏈538882-541073的位置，該基因含有1個外顯子，不含有內(nèi)含子，其蛋白序列由592個氨基酸殘基組成.

2.2 CpSit1蛋白理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

圖1 CpSit1蛋白親水性與疏水性分析Fig.1 Hydrophobicity and hydrophilicity analysis of CpSit1 in C.pseudoreteaudii

利用ProtParam在線分析CpSit1蛋白的理化性質(zhì)，分子質(zhì)量為66 294.60 u，理論等電點為6.61；該蛋白在280 nm處的光密度值為2.423～2.431，不穩(wěn)定系數(shù)為28.28(<40)，屬于穩(wěn)定蛋白；其平均疏水性為0.486，表明CpSit1蛋白為疏水性蛋白(圖1).通過ProComp 9.0在線分析發(fā)現(xiàn)，CpSit1蛋白位于細(xì)胞膜上的可能性較高.

2.3 CpSit1蛋白結(jié)構(gòu)

通過與SMART數(shù)據(jù)庫比較發(fā)現(xiàn)，其在靠近N端78～501個氨基酸(E-value：3.4e-14)位置有一個MFS_1保守結(jié)構(gòu)域，在靠近C端557～576個氨基酸的位置存在一個未知的跨膜區(qū)(圖2).通過PHD對CpSit1蛋白二級結(jié)構(gòu)(圖3)的分析發(fā)現(xiàn)，α-螺旋占45.10%，延伸鏈占26.01%，無規(guī)則卷曲占28.89%.其N端和C端主要由無規(guī)則卷曲和延伸鏈組成，而α螺旋與無規(guī)則卷曲、延伸相間分布在中間位置.通過TMHMM分析發(fā)現(xiàn)，CpSit1蛋白的N端位于胞內(nèi)的可能性高達(dá)99.427%，共有14個α-跨膜螺旋，具有典型的MFS折疊.CpSit1蛋白共有接近299個氨基酸殘基位于跨膜螺旋上，這與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測中α螺旋所占比例相接近.前60個氨基酸殘基位于跨膜螺旋的可能性幾乎為零，說明其存在信號肽的可能性極低.以上結(jié)果表明桉樹焦枯病菌的CpSit1蛋白具有明顯的SIT轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)而可能具有SIT蛋白的活性和功能.

圖2 CpSit1轉(zhuǎn)運蛋白保守結(jié)構(gòu)域

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過TCDB數(shù)據(jù)庫對MFS超家族進(jìn)行檢索，從中選取出7個亞家族，分別為4個鐵載體(鐵)轉(zhuǎn)運蛋白、3個12跨膜螺旋藥物(H+)反向轉(zhuǎn)運蛋白、2個14跨膜螺旋藥物(H+)反向轉(zhuǎn)運蛋白、2個糖轉(zhuǎn)運蛋白、2個硝酸鹽亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白、2個磷酸(H+)同向轉(zhuǎn)運蛋白、1個陽離子(陰離子)同向轉(zhuǎn)運蛋白，共16個MFS超家族蛋白(表1).如圖4所示，各亞家族根據(jù)其分類落在不同的分支上，其中CpSit1轉(zhuǎn)運蛋白與4個SIT轉(zhuǎn)運蛋白位于同一分支上，分別為構(gòu)巢曲霉(E.nidulans)的MIRB、MIRC蛋白和釀酒酵母(S.cerevisiae)的ARN1、ARN2蛋白.其中，CpSit1轉(zhuǎn)運蛋白與MIRB位于同一分支上，說明這2個轉(zhuǎn)運蛋白的親緣關(guān)系較為接近，且與TCDB數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果較符合.SIT家族與DHA2家族位于同一分支，其余5個亞家族位于同一分支上.這可能與SIT、DHA2家族均含有14個跨膜螺旋有關(guān)，而其余5個亞家族的跨膜螺旋數(shù)量均為12個.

圖3 CpSit1轉(zhuǎn)運蛋白跨膜螺旋Fig.3 Transmembrane helix of CpSit1 transporter

2.5CpSit1基因表達(dá)

通過qRT-PCR相對定量的方法分析焦枯病菌侵

染桉樹24、48和72 h后CpSit1基因的表達(dá)情況(圖5)，結(jié)果顯示，CpSit1基因在24、48和72 h均發(fā)生上調(diào)表達(dá)，其中24 h上調(diào)倍數(shù)最高，達(dá)到23.99倍，明顯高于48和72 h.48和72 h的上調(diào)倍數(shù)低于2倍，差異表達(dá)不顯著.說明CpSit1基因主要在侵染初期和定植過程中通過調(diào)控鐵載體-鐵化合物的轉(zhuǎn)運為焦枯病菌提供鐵元素.

表1 MFS家族典型亞家族

圖4 系統(tǒng)發(fā)育分析

3 小結(jié)與討論

本研究通過生物信息學(xué)方法鑒定出桉樹焦枯病菌(C.pseudoreteaudii)的第1個SIT轉(zhuǎn)運蛋白CpSit1，其蛋白序列共由592個氨基酸殘基組成.TCDB數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，其可能為鐵載體-鐵:H+同向轉(zhuǎn)運蛋白.CpSit1蛋白保守結(jié)構(gòu)域為MFS_1結(jié)構(gòu)域，且蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲為主.根據(jù)TMHMM在線分析，發(fā)現(xiàn)CpSit1蛋白共有14個跨膜螺旋，為典型的MFS折疊.根據(jù)搖桿開關(guān)和門控運輸理論[14-15]，推測CpSit1蛋白與底物結(jié)合后，其N端或C端的7個跨膜螺旋圍繞著底物結(jié)合位點一側(cè)關(guān)閉，另一側(cè)開放，以進(jìn)行轉(zhuǎn)運.

本研究通過qRT-PCR進(jìn)行驗證，結(jié)果顯示，CpSit1基因在焦枯病菌侵染桉樹24 h后即發(fā)生表達(dá)，達(dá)到23.99倍，明顯高于48和72 h；48和72 h的上調(diào)倍數(shù)低于2倍，差異表達(dá)不顯著.表明桉樹焦枯病菌的CpSit1基因在病原菌侵染寄主的過程中通過調(diào)控轉(zhuǎn)運鐵載體-鐵化合物的轉(zhuǎn)運來完成鐵元素的攝入，協(xié)助其在寄主中的定植；SIT轉(zhuǎn)運蛋白作為鐵載體-鐵化合物的運輸途徑，與病原真菌的生長發(fā)育和致病性存在密切聯(lián)系，這與前人的研究結(jié)果[16-20]一致.

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Identification and expression analysis ofCpSit1 gene inCalonectriapseudoreteaudii

LIU Hongyi1, YE Xiaozhen2, CHEN Huijie1, LI Huimin1, DING Yi1, YANG Zehui1, FENG Lizhen1

(1.College of Forestry; 2.College of Jinshan, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Cpsit1 was identified by Blast and TCDB database, and then the physicochemical property, transmembrane helix, secondary structure and subcellular localization ofCpSit1 were analyzed and predicted by SMART database, ProtParam, TMHMM, PHD and ProComp 9.0 online service. Finally expression ofCpSit1 gene was detected by qRT-PCR within 24, 48 and 72 hCalonectriapseudoreteaudiiinfection of Eucalyptus. Results showed thatCpsit1 was identified as proton-coupled symporter for siderophore, with CpSit1 gene being 1 780 bp and encoding 592 amino acids. And the conserved domain ofCpSit1 is MFS_1. α-helix accounted for 45.10% of the secondary structure, with extension chain and random coil reaching 26.01% and 28.89%, respectively. QRT-PCR results revealed that expressions of CpSit1 gene were all upregulated within 24, 48 and 72 hC.pseudoreteaudiiinfection, and the expression level in 24 h was significantly higher than the other 2 stages. It proved thatCpSit1 gene could mediate the iron metabolism pathway ofC.pseudoreteaudiiby regulating siderophore and assistC.pseudoreteaudiiin the process of colonization.

Eucalyptus;Calonectriapseudoreteaudii; siderophore-iron transporter; bioinformatics; gene expression

2017-01-18

2017-05-17

福建省財政廳資助項目(K81150002、K81139238、K8112004A).

劉宏毅(1990-)，男，碩士研究生.研究方向：森林病理學(xué).Email:fjliuhongyi@126.com.通訊作者葉小真(1983-)，女，講師，博士.研究方向：森林病理學(xué).Email：lisayxz@163.com.

S763.15

A

1671-5470(2017)04-0418-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.010