楊帆 林琳 趙克溫

臨床研究

運(yùn)用MLPA技術(shù)檢測(cè)男性不孕患者Y染色體微缺失的臨床應(yīng)用

楊帆 林琳 趙克溫

目的 調(diào)查男性不育患者中Y染色體微缺失的分布頻率及缺失位點(diǎn)。方法 選擇2015年1月至2016年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖中心收治的110例男性不育患者，抽取外周靜脈血DNA；運(yùn)用多重鏈接依賴(lài)性探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)檢測(cè)Y染色體微缺失情況，分析比較不同缺乏類(lèi)型組Y染色體缺失率及缺失位點(diǎn)的差異。結(jié)果 110例男性不育患者中，有36例檢出存在無(wú)精子因子（AZF）區(qū)不同程度微缺失，缺失率為32.7%；其中AZFc區(qū)缺失發(fā)生頻率最高，占總?cè)笔У?5.0%（27/36）；Y染色體微缺失患者無(wú)精、少精的發(fā)生率更高72.2%（26/36）。結(jié)論 男性不育患者尤其是無(wú)精癥／少精癥患者Y染色體微缺失發(fā)生率較高，應(yīng)在治療前進(jìn)行遺傳檢測(cè)及咨詢(xún)。

Y染色體微缺失； 多重連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增技術(shù)； 男性不育

多重連接依賴(lài)性探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)是一種高通量、針對(duì)待測(cè)核酸中靶序列進(jìn)行定性和半定量分析的技術(shù)，其原理是經(jīng)過(guò)探針的雜交、連接、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及毛細(xì)管電泳，對(duì)多個(gè)靶序列的擴(kuò)增產(chǎn)物量進(jìn)行相對(duì)定量分析。自推出以來(lái)，由于其高效檢測(cè)基因突變和拷貝數(shù)的能力已廣泛應(yīng)用于各種分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的研究。本研究應(yīng)用MLPA技術(shù)對(duì)男性不育患者Y染色體進(jìn)行檢測(cè)，旨在通過(guò)簡(jiǎn)單快捷的方法發(fā)現(xiàn)Y染色體異常，調(diào)查Y染色體微缺失的分布以及發(fā)生頻率，為輔助生殖提供必要的遺傳咨詢(xún)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 收集2015年1月至2016年12月本院婦產(chǎn)科生殖中心男性不育患者110例，年齡21～47歲，平均（29.9±6.1）歲；排除感染和抗精子抗體陽(yáng)性等原因造成的不育。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）精液分析標(biāo)準(zhǔn)分為：無(wú)精癥（連續(xù)3次精液檢測(cè)和睪丸穿刺均未見(jiàn)精子）、少精癥（精子密度＜15×106/mL）和精液正常。

1.2 儀器和試劑 QIAamp Blood DNA Mini基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；SALSA MLPA的P360-B1 Y染色體微缺失配套試劑盒購(gòu)自荷蘭MRC-Holland公司；3500xL Dx基因測(cè)序儀和ProFlex PCR擴(kuò)增儀均購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。1.3 方法

1.3.1 DNA提取 抽取患者2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，采用QIAamp Blood DNA Mini試劑抽提。

1.3.2 MLPA檢測(cè) P360-B1 Y染色體微缺失試劑盒包含55對(duì)探針（130～507nt），針對(duì)Y染色體無(wú)精子因子（AZF）區(qū)域內(nèi)的多個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STSs）；其中AZFa區(qū)包括RPS24P1、ARSEP、BPY1等區(qū)域的16個(gè)探針，AZFb區(qū)包括RBMY1J、DY2、KDM5D等區(qū)域的15個(gè)探針，AZFc區(qū)包括DAZ、BPY2、CDY等區(qū)域的12個(gè)探針。根據(jù)試劑盒要求，主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：DNA變性（98 ℃變性5 min、25 ℃冷卻）；分子雜交（95 ℃孵育1 min、60 ℃孵育16～20 h）；連接反應(yīng)（54 ℃15 min、98 ℃ 5 min、20 ℃冷卻）；特異性PCR擴(kuò)增（95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s；72 ℃延伸60 s，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸20 min，15 ℃冷卻）和擴(kuò)增產(chǎn)物的片段分析。運(yùn)用Coffalyser.Net軟件進(jìn)行MLPA結(jié)果分析，比較樣本結(jié)果與男性對(duì)照的劑量率值（DQ值），即0.8＜DQ＜1.2 為正常。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理數(shù)據(jù)，組間缺失差異采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 男性不育患者中Y染色體微缺失位點(diǎn)及分布在110例男性不育患者中，共檢測(cè)到36例患者存在Y染色體微缺失，缺失率為32.7%，主要涉及AZF的3個(gè)區(qū)域，其中AZFa缺失2例，缺失率為5.6%；AZFb缺失2例，缺失率為5.6%；AZFc缺失27例，缺失率為75.0%；AZFbc缺失3例，缺失率為8.3%；AZFac和AZFabc缺失各1例，缺失率均為2.7%。見(jiàn)表1。

表1 36例存在Y染色體微缺失患者的位點(diǎn)分布

2.2 無(wú)精癥和少精癥患者中Y染色體微缺失情況在110例男性不育患者中無(wú)精癥患者43例，少精癥患者24例，分別存在單純?nèi)笔?、單純重?fù)和重復(fù)+缺失3種缺失類(lèi)型。在檢測(cè)到Y(jié)染色體微缺失的36例患者中，無(wú)精癥和少精癥患者占26例，缺失率為38.8%（26/67），精子正常組中占10例，缺失率23.3%（10/43），無(wú)精癥和少精癥組患者Y染色體微缺失率高于精子正常組（P＜0.5）。見(jiàn)表2，圖1。

表2 不同缺失類(lèi)型的不同臨床表現(xiàn)

注：A為正常Y染色體；B為Y染色體缺失；C為Y染色體重復(fù)圖1 MLPA方法檢測(cè)Y染色體微缺失結(jié)果

3 討論

Y染色體長(zhǎng)臂上與精子發(fā)生密切相關(guān)的區(qū)域被稱(chēng)為AZF，分為AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)區(qū)域，區(qū)域基因片段缺失、重復(fù)是導(dǎo)致男性原發(fā)性不育的遺傳病因之一［1］。Y染色體微缺失的發(fā)生率是僅次于克氏綜合征的第二位遺傳因素，常規(guī)基因檢測(cè)是無(wú)精癥、少精癥診斷流程中的重要組成部分［2］。其中AZFc的缺失出現(xiàn)較多的表現(xiàn)型，包括唯支持細(xì)胞綜合征（SCOS）、無(wú)精癥、少精癥等。本研究結(jié)果表明，在Y染色體微缺失患者中AZFc缺失率最高為75.0%，AZFa和AZFb的缺失率分別為5.6%，5.6%，AZFbc的缺失率為8.3%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的AZFc區(qū)是主要缺失區(qū)域相符，缺失率略高于60%。對(duì)于AZFc微缺失是否會(huì)直接導(dǎo)致男性不育，多篇文獻(xiàn)報(bào)道存在不同見(jiàn)解［3-5］。AZFc區(qū)缺失患者可通過(guò)睪丸穿刺獲得精子，但是否會(huì)影響卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（ICSI）治療效果、影響胚胎質(zhì)量，目前也還存在爭(zhēng)議［6-7］。此外，本研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，AZF區(qū)域內(nèi)存在單個(gè)基因缺失，例如AZFa區(qū)的USP9Y、AZFc區(qū)的DAZ2。有文獻(xiàn)報(bào)道，USP9Y基因缺失的攜帶者表型差異巨大，提示此基因在精子生成過(guò)程中更多的是協(xié)調(diào)而非決定性的作用［8］。

本研究選用的Y染色體微缺失試劑可以同時(shí)檢測(cè)AZF的多個(gè)區(qū)域，可以有效檢測(cè)出插入的串聯(lián)重復(fù)序列。結(jié)果顯示，在Y染色體微缺失的36例患者中，無(wú)精癥和少精癥患者的Y染色體缺失率為38.8%（26/67），高于精子正常組的Y染色體缺失率23.3%（10/43）。該數(shù)值與相關(guān)報(bào)道中顯示的在無(wú)精癥和少精癥患者中Y染色體微缺失率介于1%～55%［9］相符。缺失率的范圍較大可能是因?yàn)槊總€(gè)研究的序列標(biāo)簽位點(diǎn)（STS）引物選擇不同，也有可能與人種、遺傳背景、環(huán)境等因素有關(guān)［10］。

目前，性染色體異常的臨床診斷主要依賴(lài)于核型分析，但核型分析操作繁瑣、檢測(cè)周期較長(zhǎng)；而熒光原位雜交（Fish）雖有高分辨率，但受其檢測(cè)范圍限制，對(duì)于微小的染色體缺失仍難以檢測(cè)。MLPA技術(shù)的局限性在于不能檢測(cè)染色體的平衡易位、不適合檢測(cè)未知的點(diǎn)突變等。但是，MLPA技術(shù)憑借其檢測(cè)通量大、重復(fù)性好、效率高等優(yōu)點(diǎn)可成為簡(jiǎn)單、便捷的篩查手段之一。通過(guò)增加MLPA檢測(cè)平臺(tái)，男性不育患者的診斷體系得到了很大程度的完善，可根據(jù)缺失區(qū)域?yàn)榛颊咧贫ê侠淼闹委煼桨柑峁┮罁?jù)，為輔助生殖提供遺傳咨詢(xún)。

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（本文編輯：李銀平）

Clinical application and research of MLPA technology to detect Y chromosome microdeletions

Yang Fan1, Lin Lin1, Zhao Kewen2.1Department of Clinical Laboratory, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 200025 Shanghai, China2Department of Pathophysiology, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, 200025 Shanghai, China

Objective To investigate Y chromosome microdeletions and their distribution characteristics among the male infertile patients. Methods 110 male infertility patients admitted to Reproductive Center of Obstetrics and Gynecology in Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine from January 2015 to December 2016 were Selected . The DNA was extracted from peripheral venous blood. Y chromosome microdeletion was detected by Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). The frequency and site of Y chromosome microdeletions were compared between azoospermia and oligospermia patients . Results Y chromosome microdeletions were found in 36 cases (32.7%) in 110 infertile patients . Microdeletion of AZFc region was the most frequent it was 75.0% of all microdeletions (27/36). The azoospermic and oligospermic incidence was higher in patients with Y chromosome microdeletions 72.2% (26/36). Conclusion The occurrence of Y chromosome microdeletions is higher in azoospermic and oligospermic patients, it is necessary for them to have the genetic detection and the genetic counsel before performing treatments.

Y Chromosome Microdeletion; Multiplex ligation-dependent probe amplification; Male Infertility

200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科（楊帆 林琳）200025 上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室（趙克溫）

趙克溫，Email：zkewen@shsmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.01.004

2017-01-18）