郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

數(shù)字PCR技術(shù)在布魯菌病療效判定中的應(yīng)用價(jià)值

郭瑛 韓冰 王麗 孫華麗 劉貴明 蔣榮猛

目的 探討數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)血清布魯菌含量對(duì)療效判定的應(yīng)用價(jià)值。方法 選擇2015年1月至2016年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院收治的15例布魯菌病恢復(fù)期患者，即布魯菌病急性期患者經(jīng)過(guò)規(guī)范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者為研究對(duì)象，用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)血清布魯菌含量，并同時(shí)做血培養(yǎng)和布魯菌凝集試驗(yàn)，比較三種試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果 15例患者布魯菌病恢復(fù)期患者血清凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，14例患者未在血清中檢測(cè)出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，并且血培養(yǎng)陽(yáng)性。剩余14例患者血培養(yǎng)陰性。結(jié)論 數(shù)字PCR技術(shù)為發(fā)現(xiàn)和確診布魯菌病現(xiàn)癥感染病例提供了快速、快捷的方法，但仍需大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。

布魯菌??；數(shù)字PCR技術(shù)

布魯菌病是一種古老的人畜共患性疾病，由布魯菌感染引起，以長(zhǎng)期發(fā)熱、肝脾大、關(guān)節(jié)疼痛和慢性化為特征的人畜共患傳染病，曾被命名為波狀熱和地中海熱。在世界范圍內(nèi)均有分布。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年新增約50萬(wàn)病例[1]。我國(guó)主要流行于內(nèi)蒙古自治區(qū)、吉林省、黑龍江省、新疆維吾爾自治區(qū)、西藏自治區(qū)等。布魯菌病有多種傳播途徑，臨床表現(xiàn)多樣，病程可長(zhǎng)達(dá)數(shù)月至數(shù)年。部分布魯菌病患者在治療過(guò)程中或治療后，仍有自覺(jué)布魯菌病癥狀，如發(fā)熱、乏力、盜汗和肌肉關(guān)節(jié)痛等。此時(shí)，早期正確鑒別診斷是治療失敗、復(fù)發(fā)還是重新感染是后續(xù)治療成功的關(guān)鍵。目前，布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)缺乏快速、簡(jiǎn)便的方法，仍以分離培養(yǎng)和血清凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)為主要檢測(cè)手段。布魯菌分離培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上主要采用血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)。但是培養(yǎng)陽(yáng)性率低，要求條件高，且存在生物安全性風(fēng)險(xiǎn)，臨床因?qū)嶒?yàn)室條件限制不能常規(guī)開展。在我國(guó)，臨床常規(guī)開展的血清凝集試驗(yàn)主要為虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)和試管凝集試驗(yàn)。RBT主要檢測(cè)血清中總抗體，技術(shù)簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，被廣泛作為初篩試驗(yàn)使用。陽(yáng)性診斷價(jià)值較低，對(duì)于沒(méi)有布魯菌暴露危險(xiǎn)因素患者診斷價(jià)值較高，對(duì)于反復(fù)暴露和既往感染患者診斷價(jià)值有限。試管凝集試驗(yàn)(SAT)常被用作布魯菌病的診斷技術(shù)，主要檢測(cè)IgG、IgM和IgA。但是各國(guó)具有診斷意義的抗體滴度標(biāo)準(zhǔn)不一致，未找到合適的抗體滴度診斷標(biāo)準(zhǔn)，且慢性期敏感性較低。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(Coombs)主要檢測(cè)血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補(bǔ)充。Coombs在慢性期和復(fù)發(fā)患者中診斷價(jià)值優(yōu)于血清凝集試驗(yàn)，敏感性和特異性較高。但該項(xiàng)檢測(cè)方法操作復(fù)雜、耗時(shí)，需要一定的設(shè)備，難以在臨床常規(guī)開展。ELISA能夠檢測(cè)血清中IgM和IgG抗體。單獨(dú)檢測(cè)IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，但是，當(dāng)患者體內(nèi)存在高滴度的IgG抗體時(shí)，干擾對(duì)IgM抗體的檢出。不僅如此，類風(fēng)濕因子也可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。PCR技術(shù)自出現(xiàn)以來(lái)，被廣泛應(yīng)用于感染性疾病的診斷。美國(guó)指南推薦PCR技術(shù)作為布魯菌病診斷初篩試驗(yàn)，以IS711為引物的PCR試驗(yàn)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)血清中布魯菌含量，應(yīng)用前景廣闊。但普通PCR技術(shù)檢測(cè)敏感性低，且為相對(duì)定量，結(jié)果不夠精確。布魯菌血培養(yǎng)技術(shù)耗時(shí)、陽(yáng)性率低，且存在生物安全風(fēng)險(xiǎn)。布魯菌血清凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和普通PCR技術(shù)均存在一定的局限性。本文初步探討利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)血清布魯菌DNA含量對(duì)布魯菌病恢復(fù)期的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年1月至2016年5月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院收治的15例布魯菌病恢復(fù)期患者，即布魯菌病急性期患者經(jīng)過(guò)規(guī)范抗生素治療6周后仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 符合布魯菌病急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)：①流行病學(xué)史：發(fā)病前與家畜和畜產(chǎn)品、布魯菌培養(yǎng)物等有密切接觸史，或生活在布魯菌病流行區(qū)的居民等。②有發(fā)熱、乏力、多汗、肌肉和關(guān)節(jié)痛，或伴有肝、脾和淋巴結(jié)腫大等臨床表現(xiàn)。③實(shí)驗(yàn)室分離出布魯菌，試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)或布魯菌病抗人-球免疫球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性。④病史≤6個(gè)月。

1.2.2 非急性期：符合布魯菌病急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)，并接受抗生素治療6周后，仍有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀的患者。

1.3 數(shù)字PCR試驗(yàn)方法

1.3.1 主要試劑:血液DNA提取試劑盒購(gòu)自qiagen公司，QX200 ddPCR EvaGreen Supermix，微滴發(fā)生卡(DG8TM Cartridges)，微滴發(fā)生油(QX200TM Droplet Generation Oil for EvaGreen)購(gòu)自伯樂(lè)公司，引物在上海生工公司合成。

1.3.2 數(shù)字PCR:引物針對(duì)IS711基因設(shè)計(jì)[2]，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度252 bp,引物序列如下，BF:CATGCGCTATGTCTGGTTAC；BmR：AGTGTTTCGGCTCAGAATAAT。模板DNA提取按照試劑盒的說(shuō)明書。布魯菌基因組DNA由中國(guó)疾控中心布病室贈(zèng)予。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)包括空白對(duì)照孔，陽(yáng)性對(duì)照孔，陰性對(duì)照孔，樣品孔?？瞻讓?duì)照孔模板用無(wú)菌水替代，陽(yáng)性對(duì)照孔模板是布魯菌的基因組DNA，陰性對(duì)照孔模板是健康人基因組DNA，樣品孔模板是15名患者血清提取的DNA。

1.3.3 配制數(shù)字PCR反應(yīng)體系:Eva Green Supermix 12 μl,模板DNA 33 ng，上下游引物2 pmol，加水至24 μl。吸取20 μl轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡的sample行(中間行)，油滴行加入70 μl微滴發(fā)生油，蓋上膠墊后，平穩(wěn)放置在微滴生成儀中，開始生產(chǎn)微滴。將生成微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板，反應(yīng)條件：95℃ 變性5 min，95℃30 s，57℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)，4℃ 5 min，90℃ 5 min，4℃保存。將反應(yīng)完成的96孔板平穩(wěn)放入微滴讀取儀中，打開quanta soft軟件，輸入樣品信息后，點(diǎn)擊run。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 15例布魯菌病恢復(fù)期患者中，男5例，女10例;年齡21～56歲。布魯菌乳膠凝集試驗(yàn)由北京地壇醫(yī)院完成，本組病例均為陽(yáng)性。血培養(yǎng)陽(yáng)性1例。

2.2 流行病學(xué)史 15例患者均來(lái)自疫區(qū)或從事畜牧業(yè)相關(guān)工作。

2.3 臨床表現(xiàn) 15例患者有明顯的布魯菌病自覺(jué)癥狀，主要為發(fā)熱、腰痛肌肉和關(guān)節(jié)痛、乏力等。見表1。

2.4 血清布魯菌定量檢測(cè) 有自覺(jué)癥狀的15例布魯菌病恢復(fù)期患者中，1例血清布魯菌DNA定量明顯升高，2.34拷貝/μl，且血培養(yǎng)陽(yáng)性。其余患者均未檢測(cè)出布魯菌DNA。

表1 15例布魯菌病恢復(fù)期患者的臨床癥狀

3 討論

布魯菌病經(jīng)過(guò)規(guī)范6～8周抗生素治療后，95%的患者病情有不同程度的好轉(zhuǎn)，進(jìn)入恢復(fù)期。然而，少部分患者仍自覺(jué)有布魯菌病相關(guān)臨床癥狀，如發(fā)熱、乏力、盜汗、腰痛和關(guān)節(jié)痛等。此時(shí)，需要對(duì)布魯菌病恢復(fù)期患者進(jìn)行正確診斷，鑒別是治療失敗、復(fù)發(fā)還是重新感染，將決定臨床醫(yī)生的治療決策。目前，診斷布魯菌病主要依靠分離培養(yǎng)和凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和普通PCR技術(shù)。

布氏桿菌分離培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。臨床上主要采用血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，急性期患者血培養(yǎng)敏感性為18.4%～90%，慢性期敏感性差，30%～70%[3-5]。骨髓培養(yǎng)比血培養(yǎng)靈敏度高，尤其是對(duì)已經(jīng)應(yīng)用抗生素患者[6]。培養(yǎng)陽(yáng)性率主要取決于疾病分期、抗生素應(yīng)用和培養(yǎng)方法等[7]。

布氏桿菌分離培養(yǎng)存在生物安全性問(wèn)題。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在過(guò)去的25年中，實(shí)驗(yàn)室布氏桿菌感染率為18%～31%[8]。目前僅應(yīng)用于科研，臨床因?qū)嶒?yàn)室條件限制不能常規(guī)開展。

RBT主要檢測(cè)血清中總抗體，技術(shù)簡(jiǎn)單，價(jià)格便宜，被廣泛作為初篩試驗(yàn)使用。Skendros等[9]研究顯示，在急性期，RBT敏感性接近100%，特異性87.5%，陰性預(yù)測(cè)值接近100%，而陽(yáng)性預(yù)測(cè)值只有11.4%。然而，Arabaci等[10]對(duì)急性期患者研究發(fā)現(xiàn)，RBT敏感性48.1%，特異性96.1%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為1，陰性預(yù)測(cè)值低于0.5。由此可見，不同地區(qū)RBT急性期診斷價(jià)值存在差異。Al Dahouk等[11]認(rèn)為，慢性期RBT敏感性差，約70%?？傮w而言，RBT對(duì)于沒(méi)有布氏桿菌暴露危險(xiǎn)因素患者診斷價(jià)值較高，對(duì)于反復(fù)暴露和既往感染患者診斷價(jià)值有限[12]。

SAT常被用作布魯菌病的診斷技術(shù)，主要檢測(cè)IgG、IgM和IgA。WHO指南推薦其為初篩試驗(yàn)，我國(guó)指南認(rèn)定為確診試驗(yàn)。但是，無(wú)論作為初篩試驗(yàn)，還是確診試驗(yàn)，SAT均存在一定問(wèn)題：(1)具有診斷學(xué)意義的抗體滴度尚未確定。WHO指南推薦SAT≥1∶160為布魯菌病診斷標(biāo)準(zhǔn)。我國(guó)指南規(guī)定急性期診斷標(biāo)準(zhǔn)為SAT滴度≥1∶100，慢性期≥1∶50。(2)敏感性一般。據(jù)統(tǒng)計(jì)，SAT在急性期診斷敏感性從37.4%～90%[10,13]不等。慢性期敏感性差，為27.5%[14]。但恢復(fù)期SAT滴度較急性期升高4倍或以上，診斷價(jià)值較高[15]。

Coombs主要檢測(cè)血清中不完全和非凝集抗體，作為SAT的補(bǔ)充。Coombs在慢性期和復(fù)發(fā)患者中診斷價(jià)值優(yōu)于血清凝集試驗(yàn)，敏感性和特異性較高。不僅如此，Roushan等[6,10]研究認(rèn)為，Coombs對(duì)于急性期診斷價(jià)值優(yōu)于SAT、RBT和ELISA等。腦脊液Coombs對(duì)于合并腦膜炎患者診斷價(jià)值較大[14,16]。但該項(xiàng)檢測(cè)方法操作復(fù)雜、耗時(shí)，需要一定的設(shè)備，難以在臨床常規(guī)開展。

ELISA能夠檢測(cè)血清中IgM和IgG抗體。Roushan等[6,10]研究顯示，單獨(dú)檢測(cè)IgM抗體可為急性期患者提供可靠的診斷，敏感性和特異性與SAT和Coombs相近。但是，單一檢測(cè)血清中布氏桿菌抗體，可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果[16,17]。例如，當(dāng)患者體內(nèi)存在高滴度的IgG抗體時(shí)，干擾對(duì)IgM抗體的檢出。不僅如此，類風(fēng)濕因子也可導(dǎo)致假陰性結(jié)果，試驗(yàn)前應(yīng)將其除去。ELISA對(duì)慢性期和復(fù)發(fā)患者的診斷價(jià)值優(yōu)于SAT，與Coombs相似，但試驗(yàn)方法更為簡(jiǎn)單[15,18]。

當(dāng)前，用編碼BCSP31設(shè)計(jì)的B4/B5引物常被用于人布魯菌病診斷。Casanova等[17,19]研究發(fā)現(xiàn)，診斷布魯菌病急性期敏感性為98.3%，特異性為100%。對(duì)慢性期和復(fù)發(fā)患者也有一定診斷價(jià)值[20]。Fadeel等[18,21]報(bào)道了一個(gè)多重PCR實(shí)驗(yàn)(Bruce-ladder)用于從種水平上鑒定所有布氏桿菌，包括布氏桿菌的6個(gè)陸生種、海洋種和疫苗株S19、RB51、Revl。另有研究對(duì)比了分別以IS711、bcsp31、per設(shè)計(jì)的探針和引物的實(shí)時(shí)PCR，結(jié)果證明依據(jù)IS711設(shè)計(jì)引物和探針的PCR在鑒別布氏桿菌時(shí)表現(xiàn)最好的靈敏性、特異性、高效性和重復(fù)性[19,22]。Castano等[20,23]研究顯示，在布魯菌病流行地區(qū)，用以B4/B5為引物的傳統(tǒng)PCR作為布魯菌病初篩試驗(yàn)，以IS711為引物的實(shí)時(shí)PCR作為確證試驗(yàn)，不僅可用于布魯菌病診斷，還可鑒定種型，具有廣闊應(yīng)用前景。

目前，我國(guó)布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷主要依靠RBT初篩，SAT進(jìn)行確診。但是，SAT試驗(yàn)作為確診試驗(yàn)存在不足，表現(xiàn)在：(1)無(wú)論急性期還是慢性期，具有診斷價(jià)值的抗體滴度閾值尚未確定，缺乏大規(guī)模樣本驗(yàn)證。(2)在疾病早期，由于抗體合成需要至少1周時(shí)間，SAT滴度可能<1∶160[3,4,23]。因此，對(duì)于急性期患者，一份SAT檢測(cè)結(jié)果滴度<1∶160，不能除外布魯菌病。臨床高度懷疑布魯菌病應(yīng)在1～2周后復(fù)查。(3)SAT對(duì)于慢性期診斷特異性一般。32%的患者即使經(jīng)過(guò)正規(guī)治療，隨訪1年后，SAT滴度仍≥1∶80[12]。因此，布魯菌診斷必須結(jié)合患者病史、臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合判定。當(dāng)前，開展新型實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)迫在眉睫。

PCR技術(shù)作為病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)開始廣泛應(yīng)用于臨床。第一代PCR技術(shù)通常采用電泳的方法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，存在操作繁瑣，容易出現(xiàn)交叉污染，只適用于定性研究等局限。為了克服傳統(tǒng)PCR的不足，并滿足生物學(xué)研究中對(duì)核酸定量分析的要求，1992年誕生了第二代PCR，即熒光定量PCR。熒光定量PCR在PCR擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)反應(yīng)體系中引入的熒光信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)分析，通過(guò)三個(gè)參數(shù)(熒光信號(hào)、-Cq值、DNA模板起始濃度)間的關(guān)系，確定靶標(biāo)基因相對(duì)于外部參照(標(biāo)準(zhǔn)曲線或?qū)φ諛颖?的含量或表達(dá)水平。由于熒光定量PCR的結(jié)果曲線依賴-Cq值、PCR擴(kuò)增效率和參照系，2009年由科學(xué)家們協(xié)商制訂的定量PCR實(shí)驗(yàn)指南明確了定量PCR試驗(yàn)流程標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制的必要性；更具意義的是指南還給出了規(guī)范定量PCR流程和質(zhì)控環(huán)節(jié)的check-list，其核心目標(biāo)旨在規(guī)范各實(shí)驗(yàn)室的數(shù)字PCR技術(shù)流程，統(tǒng)一試驗(yàn)技術(shù)思路、保證熒光定量PCR試驗(yàn)信息的透明度，以確保定量PCR試驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性、可靠性。然而對(duì)于-Cq值、PCR擴(kuò)增效率和參照系的依賴仍是定量PCR技術(shù)的最大技術(shù)瓶頸，在這個(gè)意義上的定量也只能是相對(duì)的、間接的。而且在靶核酸分子風(fēng)度低、樣本間模板濃度差異細(xì)微的情況下，定量PCR的檢測(cè)靈敏度和精確度都受到了限制，已不能滿足臨床實(shí)驗(yàn)室診斷的要求。

在這樣的背景下，第三代PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)屬于第三代PCR技術(shù)。QX200微滴發(fā)生器可將含有核酸分子的熒光PCR反應(yīng)體系分割成數(shù)萬(wàn)個(gè)納升級(jí)的微滴，核酸分子在各微滴中隨機(jī)分級(jí)，每個(gè)微滴或不含特檢核酸靶分子，或者至少一個(gè)待檢核酸靶分子，且每個(gè)微滴都是一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，QX200微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為“1”，沒(méi)有熒光信號(hào)的微滴判讀為“0”，從而將熒光模擬信號(hào)數(shù)字化，因此該技術(shù)被稱為數(shù)字PCR。最終根據(jù)泊松分布原理及陽(yáng)光微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子的拷貝數(shù)濃度，上述過(guò)程中熒光信號(hào)產(chǎn)生原理與定量PCR相同，可以采用具有序列特異性TapMan探針，也可以采用成本更低的新型核酸嵌入式染料-EvaGreen，因此，定量PCR與數(shù)字PCR的銜接是無(wú)縫的。

全新的數(shù)字化終點(diǎn)檢測(cè)方式和分子技術(shù)的定量手段，賦予QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)卓越的性能，即無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照，對(duì)影響PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了檢測(cè)靈敏度、精確度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，并實(shí)現(xiàn)了真正意義上的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR技術(shù)較普通PCR技術(shù)而言，敏感性更高，且能夠定量，是今后早期快速檢測(cè)布魯菌的發(fā)展方向。

本研究初步探討分析15例布魯菌恢復(fù)期病例的臨床資料和數(shù)字PCR檢測(cè)血清布魯菌DNA定量檢測(cè)結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，15例患者布魯菌血清凝集試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性，說(shuō)明凝集試驗(yàn)抗體可能為既往感染后產(chǎn)生的IgG抗體，并不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染。14例患者未在血清中檢測(cè)出布魯菌DNA，僅有1例患者血清布魯菌DNA定量檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明部分布魯菌病恢復(fù)期患者血清中布魯菌含量很低或不存在。因此，對(duì)于規(guī)范治療進(jìn)入恢復(fù)期仍然有自覺(jué)癥狀的患者，可以利用數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)血清布魯菌DNA的含量，為布魯菌病的后續(xù)治療提供依據(jù)。同時(shí)，數(shù)字PCR檢測(cè)血清布魯菌DNA陽(yáng)性患者，血培養(yǎng)也是陽(yáng)性，表明數(shù)字PCR可以取代血培養(yǎng)作為恢復(fù)期是否還有布魯菌存在的一種方法，但只是初步探討，尚需要擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。對(duì)于血清布魯菌數(shù)字PCR檢測(cè)陽(yáng)性的患者，考慮存在現(xiàn)癥布魯菌感染，臨床應(yīng)繼續(xù)給予抗布魯菌治療。

臨床資料顯示，血清布魯菌DNA檢測(cè)陽(yáng)性病例較陰性病例有明顯的高熱癥狀(體溫39.5℃)，且布魯菌血培養(yǎng)陽(yáng)性，提示存在菌血癥。14例血清布魯菌DNA定量檢測(cè)陰性患者有不同程度發(fā)熱，但無(wú)高熱，體溫37.3～38℃，血培養(yǎng)陰性，提示可能不存在布魯菌菌血癥。14例患者都存在不同程度的腰痛、關(guān)節(jié)痛和睪丸腫痛等自覺(jué)布魯菌病臨床癥狀，分析靶器官損傷可能不是布魯菌直接損傷所致，而是由遲發(fā)型免疫反應(yīng)所致，與文獻(xiàn)報(bào)道[9,10]相符。對(duì)于布魯菌數(shù)字PCR檢測(cè)陰性，但仍有自覺(jué)癥狀的患者，是否需要繼續(xù)治療，需綜合患者臨床表現(xiàn)，紅細(xì)胞沉降率、C-反應(yīng)蛋白、血清凝集試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮，評(píng)估是否需要繼續(xù)治療。

1 Al Dahouk S,Nockler K.Implication of laboratory diagnosis on brucellosis therapy.Expert Rev Anti Infect Ther,2011,9:833-845.

2 Kamal IH1,Al Gashgari B,Moselhy SS,et al.Two-stage PCR assay for detection of human brucellosis in endemic areas.BMC Infect Dis,2013,21:145.

3 Franco MP,Mulder M,Gilman RH,et al.Human brucellosis.Lancet Infect.Dis,2007,7：775-786.

4 Zai X,Yang Q,Liu K,et al.A comprehensive proteogenomic study of the human Brucellar vaccine strain 104M.BMC Genomics,2016,17:402.

5 Gomez MC,Nieto JA,Rosa C,et al.Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic.Clin Vacc Immunol,2008,15:1031-1033.

6 Roushan MK,Amiri MJ,Larly A,et al.Follow-up standard agglutination and 2-mercaptoethanol tests in 175 clinical cured cases of human brucellosis.International Journal of Infectious Diseases,2010,14:e250-e253.

7 Mantur B,Parande A,Amarnath S,et al.ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis.Am J Trop Med Hyg,2010,83:314-318.

8 Ko J,Splitter GA.Molecular host-pathogen interaction in brucellosis: current understanding and future approaches to vaccine development for mice and humans.Clin Microbiol Rev,2003,16:65.

9 Skendros P,Pappas G,Boura P.Cell-mediated immunity in human brucellosis.Microbes Infect,2011，13:134.

10 Arabaci F,Oldacay M.Evaluation of serological diagnostic tests for human Brucellosis in an endemic area.Journal of Microbiology and Infectious Diseases,2012，2:50-56.

11 Al Dahouk S,Tomaso H,Nockler K,et al.Laboratory-based diagnosis of brucellosis-a review of the literature.Part Ⅰ: techniques for direct detection and identification of Brucella spp.Clin Lab,2003,49:487-505.

12 Andriopoulos P,Kaloqerakou A,Rebelou D,et al.Prevalence of Brucella antibodies on a previously acute brucellosis infected population: sensitivity,specificity and predictive values of Rose Bengal and Wright standard tube agglutination tests.Infection,2015,43:325-330.

13 Gomez MC,Nieto JA,Rosa C,et al.Evaluation of seven tests for diagnosis of human brucellosis in an area where the disease is endemic.Clin Vacc Immunol,2008,15:1031-1033.

14 Mantur B,Parande A,Amarnath S,et al.ELISA versus conventional methods of diagnosing endemic brucellosis.Am J Trop Med Hyg,2010,83:314-318.

15 Espinosa BJ,Chacaltana J,Mulder M,et al.Comparison of culture techniques at different stages of brucellosis.Am J Trop Med.Hyg,2009,80:625-627.

16 Karsen H,Tekin Koruk S,Duygu F,et al.Review of 17 Cases of Neurobrucellosis: Clinical Manifestations,Diagnosis,and Management.Arch Iran Med,2012,15:491-494.

17 Casanova A,Ariza J,Rubio M,et al.Brucellacapt versus classical tests inthe serological diagnosis and management of human brucellosis.Clin.Vaccine Immunol,2009,16:844-851.

18 Fadeel MA,Hoffmaster AR,Shi J,et al.Comparison of four commercial IgM and IgG ELISA kits for diagnosing brucellosis.J Med Microbiol,2011,60:1767-1773.

19 Queipo-Ortuno MI,Morata P,Ocon P,et al.Rapid diagnosis of human brucellosis by peripheral-blood PCR assay.J Clin Microbiol,1997,35:2927-2930.

20 Castano MJ，Solera J.Chronic brucellosis and persistence of Brucella melitensis DNA.J Clin Microbiol,2009,47:2084-2089.

21 Lopez-Goni I,Garcia-Yoldi D,Marin CM,et al.Evaluation of a multiplex PCR assay (Bruce-ladder) for molecular typing of all Brucella species,including the vaccine strains.J Clin Microbiol,2008,46:3484-3487.

22 Bounaadja L,Albert D,Chenais B,et al.Real-time PCR for identification of Brucella spp: a comparative study of IS711,bcsp31 and pertarget genes.Vet Microbiol,2009,137:156-164.

23 Memish Z,Mah MW,Al Mahmoud S,et al.Brucella bacteraemia: clinical and laboratory observations in 160 patients.J Infect,2000,40:59-63.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.013

項(xiàng)目來(lái)源：首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院院內(nèi)科研基金(編號(hào)：DTQL201404)

010000 呼和浩特市，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑部(郭瑛);首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國(guó)家臨床重點(diǎn)專科(韓冰、孫華麗、蔣榮猛);中科院北京基因組研究所(王麗、劉貴明)

蔣榮猛，100015 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院感染性疾病診療與研究中心，感染病科國(guó)家臨床重點(diǎn)?？?；

E-mail:13911900791@163.com

R 516.7

A

1002-7386(2017)15-2292-04

2017-02-14)