張旭標 林濤 曾永親 鄭定容

膠質瘤中間質細胞衍生因子-1及神經生長因子的表達及臨床意義

張旭標 林濤 曾永親 鄭定容

目的 探討間質細胞衍生因子-1(SDF-1)及神經生長因子(NGF)在膠質瘤中的表達及臨床意義。方法 收集手術切除的人腦膠質瘤病理標本86例為觀察組，其中觀察組按不同病理級別分為Ⅰ級15例為Ⅰ組，Ⅱ級24例為Ⅱ組，Ⅲ級26例為Ⅲ組，Ⅳ級21例為Ⅳ組，同期隨機選擇顱腦外傷患者正常腦組織標本84例為對照組，2組組織均使用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)技術檢測SDF-1與NGF mRNA，同時采用免疫組化法檢測2組組織中SDF-1與NGF蛋白的表達情況。比較2組組織中SDF-1與NGF mRNA及蛋白表達情況。結果 觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于對照組(P<0.05)；Ⅳ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅲ組；Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅱ組；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅰ組，膠質瘤組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率隨病理級別的增高而增高(P<0.05)；膠質瘤組織中SDF-1 mRNA表達量及蛋白陽性率呈正相關(r=0.95，P<0.05)，NGF mRNA表達量及蛋白陽性率呈正相關(r=0.96，P<0.05)；SDF-1和NGF高表達均是預測膠質瘤預后不良的獨立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表達與膠質瘤患者整體不良預后顯著相關。結論 膠質瘤中SDF-1與NGF高表達對病變進展有一定促進作用，二者與腫瘤的病理級別密切相關，兩者相互作用，SDF-1與NGF在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為膠質瘤的臨床檢測及治療提供新思路。

膠質瘤；間質細胞衍生因子-1；神經生長因子；實時熒光定量聚合酶鏈式反應；免疫組化

膠質瘤是最常見的顱內原發(fā)性惡性腫瘤之一，膠質瘤的生長方式為浸潤性生長，藥物治療與手術治療圴預后差，發(fā)率非常高，其致殘率及致死率均很高[1]。膠質瘤發(fā)病原因尚不明確，其病變進展中出現(xiàn)多種蛋白表達失調[2]；間質細胞衍生因子-1(SDF-1)及神經生長因子(NGF)基因及蛋白表達是近年來腫瘤學領域的研究熱點之一，有研究認為SDF-1與NGF與多種惡性腫瘤的預后特別是腫瘤的轉移有關[3]，通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)定量與免疫組化定性技術，探討SDF-1與NGF基因及其蛋白表達水平與膠質瘤的惡性程度的關系及臨床診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2015年1月廣東三九腦科醫(yī)院神經外科手術切除的人腦膠質瘤病理標本86例為觀察組，男43例，女43例；年齡13～75歲，平均年齡(45.6±12.2)歲；患者術前未接受放化療等治療，均無其他腫瘤病史，均排除肝、腎、肺、心臟和血液性疾病，患者均有齊全完整的臨床資料，所有病理標本均取出一部分成制作成石蠟切片，通過HE染色后，由病理科組織兩名經驗豐富病理醫(yī)生進行雙盲鏡檢讀片，按2007版WHO制定的中樞神經系統(tǒng)腫瘤分類標準[4]，對標本進行組織學及病理學分級，其中Ⅰ級15例為Ⅰ組，Ⅱ級24例為Ⅱ組，Ⅲ級26例為Ⅲ組，Ⅳ級21例為Ⅳ組，同期隨機選擇顱腦外傷后行顱內減壓患者的手術中切取正常腦組織標本84例為對照組，男42例，女42例；年齡12～76歲，平均年齡(46.2±11.9)歲。2組年齡和性別比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 觀察組患者組織標本為外科手術切取的腦膠質瘤標本，對照組患者組織標本為顱腦外傷手術切除的正常腦組織標本。2組均在術中各取2份標本，其中一份標本通過甲醛固處理備用，另外一份標本通過液氮固定處理備用。

1.2.1 免疫組化法檢測:SDF-1和NGF表達檢測：SDF-1和NGF表達的檢測采用采用免疫組化SP法，步驟均嚴格按照試劑盒的說明書進行操作。結果標準判定：所有的免疫組化SP切片均由兩位病理學主治醫(yī)師以上的醫(yī)師對的染色結果進行評定，在高倍鏡下(400倍) 隨機抽取5個視野，判斷標準參照隋銳等[5]的計數(shù)方法計算陽性細胞率，陰性：比率<5%；弱陽性：比率5%～25%；陽性：比率26%～50%；強陽性>51%?？傟栃月剩喝蹶栃月?陽性率+強陽性率。見圖1。

圖1 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白在膠質瘤組織中表達情況(×400)

A:正常對照腦組織；B: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白低度表達；C: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白中度表達；D: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白高度表達

1.2.2 RT-PCR定量檢測:PCR引物序列：參照Tsuyoshi等[6]方法設計正反及探針義鏈，內參基因為甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均由FAM標記，由廣州中山大學達安基因有限公司合成，與設計的目的片段大小一致。各組份的檢測所需的標本均采用液氮固定處理的標本，并按照試劑盒說明進行SDF-1與NGF的RNA萃取，RT-PCR方法獲得cDNA片段，基因分析采用美國MJR Option(2) 實時熒光FQ-PCR分儀自帶的基因分析應用軟件及Gen Bank對比分析基因序列同源性，RNA表達量與內參基因的比值表示 mRNA的相對表達量。見表1。

表1 引物與探針序列

2 結果

2.1 2組患者SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率比較 觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者組織SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率比較

2.2 膠質瘤各組mRNA基因表達量及蛋白陽性率比較 Ⅳ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅲ組；Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅱ組；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率均高于Ⅰ組，膠質瘤組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率隨病理級別的增高而增高(P<0.05)；SDF-1 mRNA表達量與NGF mRNA表達量呈正相關(r=0.86，P<0.05)。見表3。

表3 SDF-1與NGF mRNA基因表達量及蛋白陽性率在TNM分期表達比較

2.3 SDF-1和NGF預后相關性分析 SDF-1和NGF高表達均是預測膠質瘤預后不良的獨立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表達與膠質瘤患者整體不良預后顯著相關。見表4、5。

WHO分級SDF?1高表達例生存期(月)SDF?1低表達例生存期(月)NGF高表達例生存期(月)NGF低表達例生存期(月)Ⅰ～Ⅱ1828．8±6．71139．4±7．91727．6±8．61240．6±8．5Ⅲ～Ⅳ2011．6±4．42718．8±6．82210．5±3．72520．5±7．3t值35．641．331．345．2P值<0．01<0．01<0．01<0．01

表5 SDF-1和NGF mRNA表達量風險級別分析

3 討論

神經膠質瘤是一種起源于膠質細胞的最常見的顱內原發(fā)性中樞神經系統(tǒng)腫瘤，約占顱內腫瘤50%，發(fā)病率居腦原發(fā)性惡性腫瘤首位[7]，呈浸潤性生長，常侵犯大腦的重要解剖和功能區(qū)域，難以治愈。目前，對神經膠質細胞瘤診斷及病情變化的判斷主要依靠主要依賴影像學檢查及術后病理診斷，但依然存在一定局限性，缺乏具有指導意義的腫瘤標記物，盡管近年來報到了許多與神經膠質細胞瘤相關的蛋白及因子，但關于這些蛋白對神經膠質細胞瘤診斷及預后的提示作用至今尚未達成共識[8]。

SDF-1是來源于骨髓基質細胞及其他相關的上皮細胞和間皮細胞所分泌的具有特殊化學誘導作用的生物因子，其產生與炎性反應無直接相關，是趨化因子 家族成員之一，參與腫瘤細胞趨化性、血管生成及腫瘤轉移的功能，有研究表明，SDF-1在多種腫瘤中均有表達，參與了腫瘤細胞的侵襲、轉移[9]。NGF存在于中樞神經系統(tǒng)內的海馬、腦干和大腦皮質中的神經元及膠質細胞之中，受體酪氨酸激酶 (Trk)家族和NGF家族呈高度特異性親和合，特別是 TrkA和NGF高度相結合[10]，NGF是神經系統(tǒng)重要的營養(yǎng)因子，是多功能性生長因子，對神經元與前體細胞發(fā)揮著促進生長、分化、再生與修復等重要作用[11]。本研究通過觀察SDF-1和NGF在膠質瘤的惡性程度的關系，為膠質瘤的臨床檢測及治療提供理論依據和新思路。

本研究結果表明，SDF-1和NGF在膠質瘤中的表達明顯高于正常腦組織中的表達，這提示膠質瘤在生長過程中，由于膠質瘤細胞的自我分泌作用，進入腦組織中，膠質瘤本身刺激其周圍的神經膠質細胞分泌SDF-1和NGF所致；胚胎發(fā) 育時期，腦組織中NGF mRNA表達量與膽堿能神經元中乙酰膽堿轉移酶的活性呈正相關，成年后消失，腦組織中神經損傷后NGF又重新大量表達[11]。腫瘤的發(fā)生是一個多因素參與、多基因突變、多步驟、多階段進展的復雜事件，本研究發(fā)現(xiàn)NGF與SDF-1的表達從正常組到膠質瘤Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級組逐漸增高，且差異均有顯著性； SDF-1是表達于腦組織中的趨化因子之一，在正常的腦組織中，維持較低的生物水平，不發(fā)揮遷移及趨化的作用，主要是由星形膠質細胞和神經元表達，當腦組織發(fā)生低氧、缺血和炎癥等病變后，SDF-1高度表達，趨化免疫系統(tǒng)的單核細胞—巨噬細胞向受損腦組織遷移并發(fā)揮相應的免疫生物學效應，SDF-1能夠激活機體的ERK-1/2和Akt信號通路，調節(jié)抗凋亡信號途徑促進細胞增殖。NGF是神經系統(tǒng)重要的營養(yǎng)因子之一，NGF是促進神經系統(tǒng)發(fā)育的必須因子，具有多功能性生長因子，其表達主要在神經系統(tǒng)，不僅可促進神經的生長和分化，而且對免疫和炎癥細胞具有確切的趨化和增殖活性，王向鵬等[12]研究表明，NGF在膠質瘤的發(fā)生和增殖過程中，除了膠質腫瘤細胞自身分泌還激活海馬和皮質等部位合成和釋放NGF。膠質腫瘤腦組織中NGF與SDF-1表達水平相關性分析結果表明，腦組織中SDF-1 mRNA表達量與NGF mRNA表達量呈正相關，SDF-1和NGF的表達與膠質瘤患者整體不良預后密切相關，NGF與SDF-1間的相互作用是影響膠質瘤細胞生長的重要因素，提示NGF與SDF-1相互協(xié)調促進神經膠質瘤的發(fā)生，共同參與了神經膠質瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及浸潤，膠質瘤細胞是一個復雜的細胞學和生物化學對損傷與再生的反應性調控過程，當損傷刺激后NGF與SDF-1即逆轉為高表達狀態(tài)。本試驗的結果可以看出NGF與SDF-1在腦膠質瘤中的表達風險級別回歸分析，NGF與SDF-1的表達水平與患者的年齡、性別和腫瘤的大小無明顯關系，而與膠質腫瘤的分化程度有密切關系，提示NGF與SDF-1的高表達是膠質腫瘤發(fā)生的重要的危險因素之一，NGF與SDF-1共同協(xié)同作用，在促進膠質腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移及浸潤中可發(fā)揮重要作用。

綜上所述 ，膠質瘤中SDF-1與NGF高表達對病變進展有一定促進作用，二者與腫瘤的病理級別密切相關，兩者相互作用，SDF-1與NGF在膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為膠質瘤的臨床檢測及治療提供新思路。

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Expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 and nerve growth factor in gliomas

ZHANGXubiao,LINTao,ZENGYongqin,etal.

DepartmentofNeurosurgery,Guangdong999BrainHospital,Guangzhou510510,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and nerve growth factor (NGF) in gliomas.Methods Eighty-six pathological specimens of human brain glioma that were collected in our hospital from January 2012 to February 2016 were enrolled as observation group,moreover,which was redivided into 4 subgroups according to different pathological grade,including 15 cases in grade Ⅰ group,24 cases in grade Ⅱ group,26 cases in grade Ⅲ group,21 cases in grade Ⅳ group,moreover,the other 84 cases of brain tissue specimens of patients with craniocerebral trauma were seclected as control group. The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA were detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR), at the same time,the expression levels of SDF-1 and NGF protein were detected by immunohistochemistry.Results The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA gene and protein in observation group were significantly higher than those in control group (P<0.05).The expression levels of SDF-1 gene,NGF mRNA and protein in grade Ⅳ group were significantly higher than those in grade Ⅲ group,which in grade Ⅲ group were significantly higher than those in grade Ⅱ group, moreover, which in grade Ⅱ group were significantly higher than those in grade Ⅰ group, besides,the expression levels of SDF-1, NGF mRNA gene and protein in glioma were increased with the increase of pathological grade (P<0.05). Moreover the expression levels of SDF-1 mRNA in gliomas were positively correlated to positive rates of protein (r=0.95,P<0.05),and the expression levels of NGF mRNA were positively correlated to positive rates of protein (r=0.96,P<0.05).Moreover the high expression of SDF-1 NGF was independent factors to predict poor prognosis of glioma (P<0.01),and the high expression of SDF-1 NGF was closely correlated to whole poor prognosis of patients with glioma.Conclusion The high expression of SDF-1 and NGF in gliomas has a certain role in promoting progression of disease,both of them are closely correlated with pathological grade,thus,both factors play an important role in pathogenesis and development of glioma,it is expected to provide new ideas for clinical detection and treatment of glioma.

glioma; stromal cell-derived factor-1; nerve growth factor; real-time quantitative polymerase chain reaction; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.002

510510 廣州市，廣東三九腦科醫(yī)院神經外科(張旭標、林濤、曾永親);廣東省深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院社區(qū)健康服務管理中心(鄭定容)

R 338.15

A

1002-7386(2017)15-2250-04

2016-11-12)