張佳佳 孟繁興 馬濤 王樂(lè) 陳志剛 陳路 劉一川

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天芪益智顆粒對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠炎性反應(yīng)的保護(hù)作用

張佳佳 孟繁興 馬濤 王樂(lè) 陳志剛 陳路 劉一川

目的 研究中藥治療AD相關(guān)機(jī)制，探究以益氣活血法為組方原則的天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦組織炎性反應(yīng)的保護(hù)作用。方法 90只雄性SD大鼠隨機(jī)分成6組，每組15只，模型組和治療組予Aβ1-42在大鼠側(cè)腦室注射建立AD動(dòng)物模型，造模成功后，治療組分別灌服濃度為高、中、低劑量的天芪益智顆粒每天一次，對(duì)照組灌服石杉?jí)A甲每天一次，空白組和模型組予等量生理鹽水每天一次，給藥體積均為20 mL/kg體重，分別連續(xù)給藥30天。喂養(yǎng)30天以后取大鼠腦組織進(jìn)行蛋白提取，用western blot方法觀察各組大鼠腦組織相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果 (1)模型組較空白組GFAP和Iba-1的表達(dá)顯著增高(P<0.05); (2)天芪益智顆粒和石杉?jí)A甲可使大鼠腦組織GFAP和Iba-1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05);(3)天芪益智顆粒和石杉?jí)A甲使phospho-p38/t-p38的表達(dá)量明顯降低(P<0.05);(4)天芪益智顆粒使AD大鼠腦iNOS、COX-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 (1)Aβ1-42側(cè)腦室注射可以模擬AD炎性反應(yīng)機(jī)制；(2)天芪益智顆粒通過(guò)抑制腦組織膠質(zhì)細(xì)胞的激活、降低phospho-p38/t-p38表達(dá)及p38-NF-κB信號(hào)通路激活、抑制促炎因子COX-2、iNOS的表達(dá)對(duì)AD大鼠炎性反應(yīng)具有保護(hù)作用。

阿爾茨海默??； 天芪益智顆粒； 實(shí)驗(yàn)研究； 炎性反應(yīng)

阿爾茨海默病是老年人中常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，全世界大約有3600萬(wàn)人患有AD，中國(guó)60歲以上人群中阿爾茨海默病的患病率為3%～5%，并且逐年上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織推算，到21世紀(jì)中葉AD將成為中國(guó)疾病負(fù)擔(dān)排名第四位的疾病[1]，對(duì)AD的預(yù)防及治療是一項(xiàng)重大的課題。

中醫(yī)藥對(duì)阿爾茲海默病的預(yù)防及治療有一定的意義。已知AD發(fā)病是與年齡密切相關(guān)的，有流行病學(xué)調(diào)查顯示年齡每增加5歲，癡呆的發(fā)病率會(huì)增加一倍，在中國(guó)80歲以上的老年人的發(fā)病率高達(dá)20%,中醫(yī)素有“久病必瘀”“老人多瘀”“虛久致瘀”的說(shuō)法。五臟虛衰與瘀血的產(chǎn)生有相互作用關(guān)系，因虛可以致瘀，而瘀久則使虛更甚?，F(xiàn)研究者多將AD的治療窗前移，1999年國(guó)外學(xué)者首次提出輕度認(rèn)知功能障礙(mild cognitive impairment，MCI)診斷標(biāo)準(zhǔn)，MCI的發(fā)病與AD的關(guān)系受到重視，在國(guó)外的研究中指出MCI患者發(fā)展為AD的概率比正常人高10倍，平均每年有12%的MCI患者發(fā)展為AD[2]。國(guó)內(nèi)臨床研究提示氣虛血瘀是MCI的主要病機(jī)[3-4]。

天芪益智顆粒是王永炎教授從癡呆病機(jī)出發(fā)創(chuàng)制的，由君藥紅芪18 g、臣藥紅景天6 g配伍組成，具有益氣活血通絡(luò)的作用，治療癡呆屬氣虛血瘀、腦脈痹阻型。藥理研究表明紅芪具有抗衰老、調(diào)節(jié)免疫、抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)等作用；紅景天可增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞功能、提高記憶力、改善認(rèn)知行為等。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)雄性4月齡SD大鼠90只，購(gòu)自中國(guó)食品藥品監(jiān)定研究院(許可證號(hào):SCXK(京)2014-0013)，體重190～220 g。SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，溫度(24±2)℃，相對(duì)濕度(50±10)%，大鼠自由飲食，明暗交替12小時(shí)。大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分治療組、陽(yáng)性對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組，其中治療組分天芪益智顆粒藥液高、中、低劑量3組，每組15只。

1.2 動(dòng)物造模

將1 mg Aβ1-42溶于無(wú)菌0.9%生理鹽水至濃度為10 μg/mL，4℃孵育24小時(shí)，用10%水合氯醛0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，手術(shù)區(qū)消毒，在顱頂中間部作一縱切口，暴露顱骨，在前鹵向右旁開(kāi)1.4 mm、向后1.4 mm處用顱骨鉆鉆開(kāi)顱骨，垂直插入微量進(jìn)樣器進(jìn)針4 mm，將1 μL Aβ1-42以1 μL/min的速度緩慢地注入大鼠側(cè)腦室，留針3分鐘以保證溶液充分彌散，隨后緩慢撤針。皮膚切開(kāi)處用慶大霉素點(diǎn)滴，縫合切口。假手術(shù)組注入等體積生理鹽水，其他操作同上。

1.3 實(shí)驗(yàn)用藥

天芪益智顆粒的組成包括君藥紅芪和臣藥紅景天，由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供，批號(hào)：20140913。將天芪益智顆粒藥液稀釋成214 g/mL、107 g/mL、53.4 g/mL三個(gè)濃度。陽(yáng)性對(duì)照藥為石杉?jí)A甲片(哈伯因)，河南太龍藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)140910A，采用無(wú)菌生理鹽水配制成0.004 mg/mL溶液。

1.4 主要試劑及儀器

Aβ1-42(杭州中肽生化有限公司)、BCA試劑盒、RIPA蛋白裂解液(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)、多克隆抗體β-actin(美國(guó)Santa Cruz公司)。低溫高速離心機(jī)(Eppendorf公司)、電泳儀(Bio-rad公司)、電熱恒溫水箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠)、凝膠成像儀(Gene公司)。

1.5 Western blot

取適量大鼠腦組織，加預(yù)冷的RIPA裂解液(100 mg加1 mL RIPA裂解液)，在冰上于勻漿器中充分研磨，放置5分鐘，4℃、12000 r/min離心15分鐘，取上清液，測(cè)定蛋白含量，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗、二抗孵育后，用ECL發(fā)光法采集圖像，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦組織膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響

腦組織中炎性反應(yīng)主要由激活的膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)，GFAP和Iba-1分別是星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)示蛋白。如圖1、表1所示，與假手術(shù)組相比，AD模型大鼠腦組織GFAP和Iba-1表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組大鼠相比，天芪益智顆粒高、中、低劑量組和石杉?jí)A甲組大鼠腦組織GFAP和Iba-1的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。其中高、中、低劑量的天芪益智顆粒和石杉?jí)A甲可分別使GFAP表達(dá)量降低65.12%、58.39%3、5.15%和62.18%，使Iba-1表達(dá)量降低71.63%、54.44%、50.58%和13.02%。該結(jié)果表明天芪益智顆?？擅黠@抑制AD模型大鼠腦組織膠質(zhì)細(xì)胞的激活。

注： A.假手術(shù)組; B.模型組;C.陽(yáng)性藥組;D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖1 膠質(zhì)細(xì)胞GFAB、Iba-1的激活

表1 天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦組織膠質(zhì)細(xì)胞GFAB、Iba-1激活的影響(與假手術(shù)組百分比值，n=5)

注： 與模型組相比，藥物組Iba-1和GFAP的表達(dá)量均降低(P<0.05)。

2.2 天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦p38-NF-κB信號(hào)通路激活的影響

如圖2、3和表2所示，與假手術(shù)組相比，模型組AD大鼠腦組織p38蛋白磷酸化占總蛋白的比值p-p38/t-p38和p65堿性磷酸化占總蛋白的比值NF-κB phospho-p65/NF-κB p65顯著升高(P<0.05)，表明p38-NF-κB信號(hào)通路被激活。與模型組相比，天芪益智顆粒和石杉?jí)A甲可明顯降低phospho-p38/t-p38的表達(dá)量(P<0.05)，與模型組相比，高、中、低劑量天芪益智顆粒及石杉?jí)A甲可分別使phospho-p38/t-p38降低56.17%、38.83%、30.51%和59.66%。天芪益智顆粒高、中、低劑量分別使NF-κB phospho-p65/NF-κB p65降低58.88%、41.29%和17.13%，而石杉?jí)A甲則對(duì)NF-κB激活沒(méi)有顯著影響，結(jié)果顯示天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦內(nèi)p38-NF-κB信號(hào)通路激活具有顯著的抑制作用。

注： A.假手術(shù)組; B.模型組;C.陽(yáng)性藥組;D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖2 p38堿性磷酸化程度

注： A.假手術(shù)組; B.模型組;C.陽(yáng)性藥組; D.天芪益智顆粒高劑量組; E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖3 NF-κB亞基p65磷酸化的程度

表2 天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠p-38磷酸化、NF-κB亞基p65磷酸化的影響(與假手術(shù)組百分比值)

注： 藥物組與模型組對(duì)比，p38堿性磷酸化、NF-κB亞基p65磷酸化的程度減低(P<0.05)。

2.3 天芪益智顆粒對(duì)促炎性因子iNOS、COX-2表達(dá)的影響

如圖4、表3所示，與假手術(shù)組相比，模型大鼠腦組織內(nèi)iNOS、COX-2表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，與模型組大鼠相比，天芪益智顆?？墒笰D大鼠腦iNOS、COX-2表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。高、中、低劑量天芪益智顆粒和石杉?jí)A甲可分別使iNOS表達(dá)量降低92.30%、72.85%、40.95%和21.32%，使COX-2表達(dá)量降低84.19%，75.30%和48.64%和51.64%。結(jié)果提示天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠腦內(nèi)促炎性因子iNOS、COX-2的表達(dá)具有顯著的抑制作用。

注： A.假手術(shù)組; B.模型組;C.陽(yáng)性藥組; D.天芪益智顆粒高劑量組;E.天芪益智顆粒中劑量組; F.天芪益智顆粒低劑量組

圖4 炎性因子iNOS、COX-2的表達(dá)

表3 天芪益智顆粒對(duì)AD大鼠iNOS、COX-2表達(dá)的影響(與假手術(shù)組百分比值,n=15)

3 討論

McGeer PL等[5]根據(jù)其研究結(jié)果提出抗炎治療或許可以治療AD，他在1996年發(fā)表文章稱(chēng)其根據(jù)對(duì)不同地區(qū)不同國(guó)家進(jìn)行流行病學(xué)研究得出風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者經(jīng)長(zhǎng)期抗炎治療后，AD的患病率較未經(jīng)抗炎治療顯著降低，因此他認(rèn)為抗炎治療或許可以治療AD。此后，多項(xiàng)研究認(rèn)為炎癥反應(yīng)是AD發(fā)病的重要因素，證據(jù)提示，神經(jīng)炎性反應(yīng)是AD發(fā)病的驅(qū)動(dòng)因素[6-7]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)益氣活血方天芪益智顆粒及石杉?jí)A甲對(duì)AD模型大鼠炎癥反應(yīng)具有保護(hù)作用。益氣活血方天芪益智顆粒可以通過(guò)抑制腦組織膠質(zhì)細(xì)胞的激活、抑制p38-NF-κB信號(hào)通路激活、抑制促炎因子COX-2、iNOS的表達(dá)對(duì)AD大鼠炎性反應(yīng)起到保護(hù)作用，其保護(hù)作用與藥物劑量呈正相關(guān)，提示采用益氣活血治法在AD早期干預(yù)對(duì)于AD防治的重要臨床意義。

實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)當(dāng)為臨床應(yīng)用服務(wù)，目前臨床常用于治療AD的藥物長(zhǎng)期療效不確切，不良反應(yīng)較多，且藥價(jià)昂貴，患者依從性較差，中藥具有價(jià)格便宜、不良反應(yīng)較小等優(yōu)點(diǎn)，因此研究中藥對(duì)AD對(duì)的治療有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)臨床研究用益氣活血法治療AD提供了理論基礎(chǔ)，其保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究，臨床上可進(jìn)行多中心隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步評(píng)價(jià)益氣活血法治療AD的臨床有效性及安全性。

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(本文編輯： 董歷華)

Protective effect ofTianqiYizhigranule on inflammatory reaction in rats with Alzheimer’s disease

ZHANGJiajia，MENGFanxing，MATao，etal.

Departmentofencephalopathy，BeijingPingguHospitalofTraditionalChineseMedicine，Beijing101200,China

MengFanxing，E-mail：mengfx1971@126.com

Objective To reveal the related mechanism of Chinese traditional medicine in treatment on AD, and to explore theYiqihuoxueprescription principle forTianqiYizhigranules on the protective effect of inflammatory reaction in brain tissue of AD rats. Methods 90 rats were randomly divided into six groups(15 in each group). Five of them were injected with Aβ1-42in lateral ventricle to establish AD model rats. Treatment groups were received different doses ofTianqiYizhigranules, and control group was given huperzine. 30 days later the rats were sacrificed and the proteins in brain tissue were extracted, the western blot was applied for determination of protein expression in brain tissue, and the possible mechanism of tradition Chinese medicine in treatment of AD rats was discussed. Results (1) Compared with blank group, the expression levels of GFAP and Iba-1 in model group had significantly increased (P<0.05). (2) The expression of GFAP and Iba-1 had respectively decreased (P<0.05). (3)TianqiYizhigranules and huperzine could significantly decreased the expression of phospho-p38/t-p38 (P<0.05). (4)TianqiYizhigranules could significantly decreased the expression of iNOS and COX-2 in brain tissue (P<0.05). Conclusion (1)Aβ1-42lateral ventricle injection could imitate the AD inflammatory reaction mechanism; (2)TianqiYizhiGranules play a protective role on the inflammatory reaction in the brain of AD rats by suppressing the activation of glial cells in brain tissues, decreased the expression of phospho-p38/t-p38 and inhibited p38-NF-kappa B signaling pathway activation. Moreover, it can inhibit the expression of COX-2 and iNOS.

Alzheimer’s disease;TianqiYizhigranules; Experimental study; Inflammatory reaction

國(guó)家重大科技專(zhuān)項(xiàng)重大新藥創(chuàng)制專(zhuān)項(xiàng)(2013X09103002-002)

101200 北京市平谷區(qū)中醫(yī)醫(yī)院腦病科(張佳佳)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院腦一科(孟繁興、陳路、陳志剛)，科研處(王樂(lè))；北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院科研中心、北京師范大學(xué)老年腦健康研究中心(馬濤)；中航工業(yè)北京航空制造工程研究所(劉一川)

張佳佳(1989- )，女，碩士，住院醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腦病系統(tǒng)疾病。E-mail：18511780920@163.com

孟繁興(1971- )，女，本科，副主任醫(yī)師。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療腦病系統(tǒng)疾病。E-mail：mengfx1971@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2017.07.003

2016-11-02)