周耕民， 刁勇， 李三暑

(華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021)

核酶的發(fā)現(xiàn)及其在基因治療中的應(yīng)用

周耕民， 刁勇， 李三暑

(華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院， 福建 泉州 362021)

核酶是具有催化功能的結(jié)構(gòu)性RNA分子，且大多數(shù)核酶具有剪切RNAs的功能，可以利用它們剪切信使RNA(mRNAs)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而作為基因治療的新手段.闡述核酶的發(fā)現(xiàn)歷程，以及其在艾滋病、肝炎、腫瘤和生殖道系統(tǒng)感染等基因治療的研究進(jìn)展.最后，分析核酶在基因治療中的技術(shù)優(yōu)勢(shì)及存在問(wèn)題，并對(duì)核酶領(lǐng)域包括更多核酶晶體結(jié)構(gòu)的確立、酶切機(jī)理的理解、核酶新的生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)等研究進(jìn)行展望. 關(guān)鍵詞： 核酶； 非編碼RNA； 基因治療； 基因表達(dá)； 剪切RNA

1 核酶的發(fā)現(xiàn)

核酶是具有催化功能的RNA分子[1]，在生物界中執(zhí)行著非常重要的生物功能，如核糖體RNA(rRNA)和RNase P分別可以合成氨基酸和加工tRNA的前體[2-3].迄今為止，已證實(shí)自然發(fā)生的核酶種類有14 類.由于大多核酶具有剪切RNA的功能，可利用其對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行切割，從而控制基因的表達(dá).核酶的研究已有30多年的歷史.在1980-1990年的10 a間共發(fā)現(xiàn)了7類，分別是Group Ⅰ[4]，Group Ⅱ[5]，Rnase P[3]，Hammerhead[6]，Hairpin[7-8]，HDV[9]，Neurospora VS[10]；在1991-2013年的近25 a間僅發(fā)現(xiàn)了3 類，分別是GIRI[11]，ribosomal RNA[12]，glmS[13].在2014-2015年的兩年間，Breaker實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)了4 類自我剪切的核酶，分別是Twister[14]，Twister Sister[15]，Hatchet[15-16]，Pistol[15，17]，并且Steitz實(shí)驗(yàn)室和另外幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，確立其中兩類核酶的晶體結(jié)構(gòu)[18-19].

大多數(shù)核酶具有自我剪切的功能，因此，大多數(shù)核酶是通過(guò)它們的剪切產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)的.如Group Ⅰ內(nèi)含子就是從26S rRNA前體的“隱藏的剪切”產(chǎn)物中被發(fā)現(xiàn)的[4]；Neurospora VS核酶是在線粒體RNA的剪切條帶中被發(fā)現(xiàn)的[10]；當(dāng)病毒采用滾環(huán)復(fù)制策略進(jìn)行復(fù)制時(shí)，有的核酶作為病毒RNA的一部分發(fā)生剪切，把多聚的病毒RNA剪切成單位長(zhǎng)度的病毒個(gè)體，因而被觀察到[20]，如Hammerhead和Hairpin核酶就是在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA(satellite RNA of tobacco ringspot virus)的復(fù)制中被觀察到的[6-8]；HDV核酶也是在肝病病毒的復(fù)制中被發(fā)現(xiàn)的[9].另外，glmS核酶是在發(fā)現(xiàn)核糖開關(guān)的過(guò)程中被意外發(fā)現(xiàn)的，它既是一個(gè)核酶，也是一個(gè)核糖開關(guān)[13].由此可見，這些發(fā)現(xiàn)帶有比較大的偶然性，經(jīng)常是在RNA放射性標(biāo)記、PAGE膠分離和純化的過(guò)程中通過(guò)剪切產(chǎn)物被偶然發(fā)現(xiàn)的.

最近，Breaker實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)4類自我剪切的核酶[14-17].先是通過(guò)生物信息學(xué)發(fā)現(xiàn)許多結(jié)構(gòu)性的RNA，但由于單從RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)上很難判斷它們是否具有核酶的功能，因此，又結(jié)合包括合成、放射性標(biāo)記、膠分離等生物化學(xué)方法檢測(cè)到核酶.這種方法雖然費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但發(fā)現(xiàn)方法顯然有很大提高.

2 核酶在基因治療中的應(yīng)用

由于核酶具有切割RNA的功能，可以利用它們來(lái)切割目標(biāo)RNA，降低基因的表達(dá).Sarver等[21]把加工過(guò)的錘頭狀核酶的催化鏈部分與底物部分的HIV-1 GAG RNA相混合，發(fā)現(xiàn)這個(gè)核酶能切割目標(biāo)GAG RNA，且在細(xì)胞內(nèi)也能切割.這一實(shí)驗(yàn)證明利用核酶來(lái)開發(fā)抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的基因治療是可行的.此后，核酶已經(jīng)應(yīng)用于許多疾病包括艾滋病、肝炎、腫瘤和生殖道系統(tǒng)感染等的基因治療研究中[21-31].

2.1 核酶在抗艾滋病中的應(yīng)用

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征，是由于HIV(human immunodeficiency virus)病毒侵入人體并強(qiáng)烈破壞體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，引發(fā)各種嚴(yán)重的并發(fā)癥.在艾滋病的基因治療研究方面，有針對(duì)艾滋病HIV基因的RNA靶標(biāo)，如Gag[21]，LTR[22]，Pol[23]，Tat[24，32]，Tar[25]，Nef[26]，Env[27，33]；HIV 受體的RNA靶標(biāo)，如CD4和共受體CCR5[34].雖然靶標(biāo)不同，但效果都很好，比如靶標(biāo)Gag mRNA的錘頭狀核酶不僅可以顯著降低Gag mRNA和它編碼的p24抗原，還降低了HIV-1 前病毒DNA 100 倍以上[21].

另外，為了提高酶切的效率，有的科學(xué)家還構(gòu)建了靶標(biāo)同一基因的不同位點(diǎn)的核酶.Bai等[34]構(gòu)建能夠在3個(gè)位點(diǎn)切割CCR5 mRNA的三聯(lián)體核酶，并將它轉(zhuǎn)導(dǎo)至CD34+造血祖細(xì)胞中，與未經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組感染HIV的比率下降70%.在靶標(biāo)HIV不同基因的核酶中，靶標(biāo)Tat的錘頭狀核酶已用于治療艾滋病的臨床一期(10個(gè)HIV病人)和二期(74個(gè)HIV病人)的實(shí)驗(yàn)[35].試驗(yàn)結(jié)果表明，核酶在艾滋病的基因治療方面有良好的應(yīng)用前景.

2.2 核酶在抗肝炎中的應(yīng)用

在乙肝(HBV)、丙肝(HCV)的基因治療研究方面，Welch等[36]用發(fā)夾狀核酶靶向切割pgRNA(pregenomic RNA)和乙肝表面抗原(HBsAg)RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒導(dǎo)入Hub7細(xì)胞與HBV共表達(dá)后，病毒顆粒減少66%～83%；Tan等[37]將加工過(guò)的錘頭狀核酶轉(zhuǎn)導(dǎo)至PLC/PRF5細(xì)胞，特異性地抑制了80%的HBsAg的表達(dá).Dai等[38]用錘頭狀核酶靶標(biāo)HBV的3個(gè)不同靶點(diǎn)，大大降低HBsAg RNA的表達(dá).這3個(gè)實(shí)驗(yàn)靶標(biāo)HBsAg RNA，效果都很好，表明用核酶進(jìn)行乙肝基因治療是可行的.

賈戰(zhàn)生等[39]用錘頭狀核酶靶向切割丙肝病毒的兩個(gè)非編碼區(qū)，發(fā)現(xiàn)核酶能抑制報(bào)告基因的表達(dá).Ryu等[40]利用group Ⅰ內(nèi)含子靶向切割HCV的IRES(核糖體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn))RNA，并導(dǎo)入白喉毒素A基因(diphtheria toxin A)，從而使被HCV病毒感染的細(xì)胞發(fā)生凋亡.張文軍等[41-42]、李小英等[43]利用核糖核酸酶P(RNase P)靶標(biāo)HCV的5′UTR (untranslated region)，可減少HCV RNA約1 000倍.由此說(shuō)明，用核酶靶標(biāo)非編碼RNA進(jìn)行丙肝的基因治療是可行的.

2.3 核酶在抗生殖道系統(tǒng)感染中的應(yīng)用

據(jù)報(bào)道，高危人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染與子宮頸癌有密切的聯(lián)系，超過(guò)90%的宮頸癌患者被感染了HPV.因此，防治HPV很可能有助于預(yù)防宮頸癌，但到目前為止仍沒(méi)有治療HPV的有效方法.利用核酶和寡核苷酸來(lái)抑制HPV基因的表達(dá)成為治療HPV的新方法[44]，主要靶標(biāo)為E6 mRNA和E7 mRNA.Lu等[45]設(shè)計(jì)針對(duì)編碼HPV-16 E6與E7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物開放閱讀框(ORF)的特異性核酶，即Rz110與Rz558，并利用腺相關(guān)病毒(AAV)作載體轉(zhuǎn)導(dǎo)至受體細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)RNA水平明顯降低.Liu等[46]通過(guò)分析HPV-6b和11E1 mRNA的同源序列，設(shè)計(jì)可同時(shí)剪切HPV-6b與11E1 mRNA的通用核酶Rz1198；然后，由體外實(shí)驗(yàn)證明Rz1198能夠特異性切割靶標(biāo)mRNA，降低HPV DNA復(fù)制所必須的E1蛋白質(zhì)的表達(dá).

Zheng等[47]、饒智國(guó)等[48-49]構(gòu)建具有特異性靶向HPV-16 E6和E7轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的錘頭狀核酶——Rz170，并將其轉(zhuǎn)染至HPV-16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞CaSKi.結(jié)果表明，E6 mRNA，E7 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)顯著降低，c-myc和BCL-2蛋白質(zhì)也表達(dá)下調(diào)，而p53和Rb蛋白質(zhì)的表達(dá)上調(diào)；受體細(xì)胞在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的生長(zhǎng)均受抑制，凋亡的比率上升，并增強(qiáng)了對(duì)化療和放療的敏感度.因此，核酶具有治療宮頸癌的潛力并可與化療或放療進(jìn)行聯(lián)合治療.

2.4 核酶在抗白血病中的應(yīng)用

慢性骨髓性白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一種干細(xì)胞來(lái)源的白血病，其腫瘤細(xì)胞含有費(fèi)城(Philadelphia)染色體和相關(guān)的癌蛋白BCR-ABL1[50].P210蛋白是由BCR-ABL融合基因編碼的，具有異常蛋白酪氨酸激酶活性，是造成 CML的重要因素.為了提高酶切效率,Leopold等[51]合成針對(duì)BCR-ABL mRNA的多元核酶(multi-unit ribozyme)，并用脂質(zhì)體或葉酸-聚賴氨酸(folic acid-polylysine)作載體將核酶轉(zhuǎn)染至用BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)化的鼠成髓細(xì)胞(32D 細(xì)胞).結(jié)果表明，該核酶可降低BCR-ABL mRNA達(dá)1 000倍.另外，通過(guò)優(yōu)化靶標(biāo)的結(jié)合位點(diǎn)也能提高酶切效率.付輝等[52]用構(gòu)建靶標(biāo)文庫(kù)和逆轉(zhuǎn)錄相結(jié)合的方法篩選靶標(biāo)跨膜糖蛋白(glycophorin A，GPA)的最佳mRNA結(jié)合位點(diǎn)，并用白血病細(xì)胞株K562細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)最好的結(jié)合位點(diǎn)可下調(diào)GPA的基因表達(dá)90%.

為了提高酶切的特異性，Kuwabara等[53]構(gòu)建帶有能識(shí)別目標(biāo)序列(BCR-ABL mRNA)的感應(yīng)臂(sensor arms)的新核酶.只有在目標(biāo)序列存在的情況下，它才能與Mg2+結(jié)合形成正確的三維空間結(jié)構(gòu)并具活力.該新核酶Maxizyme不但在體外(invitro)，而且在培養(yǎng)的細(xì)胞包括源于病人的帶費(fèi)城染色體的BV173細(xì)胞中具有高特異性和酶切活力.Tanabe等[54]進(jìn)一步將轉(zhuǎn)導(dǎo)了抗BCR-ABL 核酶后的CML細(xì)胞接種到NOD/SCID (非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷)小鼠體內(nèi)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的小鼠在14周后仍然健康存活.由此可見，Maxizyme可完全抑制CML細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的浸潤(rùn)(infiltration).

為了提高轉(zhuǎn)染效率，Soda等[55]利用VSV-假型慢病毒載體(lentiviral vectors)構(gòu)建針對(duì)ELA2型BCR-ABL mRNA的特異性核酶并轉(zhuǎn)染至CML細(xì)胞.結(jié)果顯示，CML細(xì)胞中的BCR-ABL mRNA的水平明顯降低，細(xì)胞凋亡率升高.為了研究核酶在體外凈化骨髓的作用，吳勇等[56]設(shè)計(jì)了抗BCR-ABL基因的核酶，轉(zhuǎn)導(dǎo)至CML和正常骨髓細(xì)胞，并檢測(cè)核酶對(duì)原代CML細(xì)胞的影響.結(jié)果表明，核酶能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)和原代CML細(xì)胞中P210融合蛋白的表達(dá)，但不影響正常造血祖細(xì)胞的生長(zhǎng).在緩解模型中，核酶抑制了K562細(xì)胞的增殖和BCR-ABL mRNA的表達(dá)，但不影響ABL mRNA的表達(dá).因此，抗BCR-ABL核酶可用于凈化骨髓白血病細(xì)胞.

3 核酶在基因治療中的技術(shù)優(yōu)勢(shì)及面臨的問(wèn)題

核酶是具有催化功能的RNA分子，大多數(shù)具有剪切RNA的功能，在腫瘤和病毒性疾病的基因治療方面極具應(yīng)用潛力.它的技術(shù)優(yōu)勢(shì)有如下4點(diǎn):1) 核酶能夠促使靶基因失活且讓其無(wú)法恢復(fù)，因?yàn)閙RNA被剪切之后就無(wú)法翻譯出全長(zhǎng)的肽鏈，而且它的穩(wěn)定性可能也會(huì)降低；2) 核酶能夠在體外進(jìn)行循環(huán)使用[57]，核酶剪切mRNA后，可以脫離mRNA并找到下一個(gè)目標(biāo)mRNA；3) 核酶直接剪切目標(biāo)RNA，而不需要像CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，siRNA(small interfering RNA)或microRNA (miRNA)那樣需要由蛋白酶來(lái)剪切目標(biāo)RNA；4) 常用于基因治療的核酶如錘頭狀和發(fā)夾狀核酶分子量比較小，免疫原性弱[57].

核酶的基因治療面臨的問(wèn)題主要有如下5點(diǎn)：1) 特異性，核酶的酶鏈部分即使與靶標(biāo)沒(méi)有完全配對(duì)也可能發(fā)生微弱的非特異性剪切[16]；2) RNA分子在人體內(nèi)常常不穩(wěn)定，在受體細(xì)胞里容易降解；3) 酶切效率，特別是細(xì)胞體內(nèi)的酶切效率.高水平的酶切效率是降低靶標(biāo)RNA的關(guān)鍵；4) 可塑性，每一種核酶都有保守的核苷酸，如果保守的核苷酸越多，與之相匹配的靶標(biāo)序列的可選度就越少，即可塑性小.如錘頭狀核酶只要靶標(biāo)的序列含有GUC即可，因此，它的可塑性比較強(qiáng)；5) 載體類型和導(dǎo)入技術(shù)[58].

容易構(gòu)建的、高表達(dá)的、穩(wěn)定性好的、轉(zhuǎn)染效率高的載體，以及高效、安全的細(xì)胞導(dǎo)入技術(shù)也是核酶基因治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié).現(xiàn)在常用的載體有慢病毒載體、腺病毒載體、重組腺病毒載體、腺病毒相關(guān)載體(AAV)，而常用的導(dǎo)入技術(shù)有脂質(zhì)體導(dǎo)入技術(shù)、電穿孔法、顯微注射等.這些方法在核酶基因治療的應(yīng)用有待進(jìn)一步探索和完善.

4 研究展望

核酶作為一類非常獨(dú)特的RNA分子，在生物界占有重要的生物學(xué)地位，如蛋白質(zhì)的合成是由核酶執(zhí)行的.然而，核酶發(fā)現(xiàn)的步伐比較艱難，在剛開始的10 a里發(fā)現(xiàn)了7類，之后的近25 a里僅發(fā)現(xiàn)了3 類，而且大多是在偶然的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的.隨著生物科技的發(fā)展，Breaker實(shí)驗(yàn)室于2014-2015年共發(fā)現(xiàn)4 類自我剪切的核酶，大大加快了核酶發(fā)現(xiàn)的步伐.這些發(fā)現(xiàn)將推進(jìn)核酶領(lǐng)域的研究進(jìn)一步深入，包括更多核酶晶體結(jié)構(gòu)的確立、酶切機(jī)理的理解和核酶新的生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)等.

發(fā)現(xiàn)核酶不久，錘頭狀核酶就被應(yīng)用于HIV基因治療的研究.核酶能夠促使靶基因失活且讓其無(wú)法恢復(fù)，并能夠在體外進(jìn)行循環(huán)使用，這些優(yōu)勢(shì)的存在都使核酶被廣泛關(guān)注.但是核酶的應(yīng)用技術(shù)還沒(méi)有完全成熟，受到諸多因素的影響，如核酶的可塑性、最佳靶位點(diǎn)的選擇、核酶的剪切效率、轉(zhuǎn)染的效率、在受體細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性等.隨著更多新核酶的發(fā)現(xiàn)、核酶晶體結(jié)構(gòu)的確立、剪切機(jī)理的深入了解、轉(zhuǎn)染載體技術(shù)的進(jìn)步、不斷發(fā)展的陽(yáng)離子脂質(zhì)體導(dǎo)入技術(shù)和核酶化學(xué)修飾技術(shù)[59]的提高，核酶的基因治療研究將不斷深入，最終會(huì)成為疾病治療的一個(gè)重要手段.

[1] CECH T R.Evolution of biological catalysis: Ribozyme to RNP enzyme[J].Cold Spring HarbSymp Quant Biol，2009，74:11-16.DOI:10.1101/sqb.2009.74.024.

[2] MOORE P B，STEITZ T A.The roles of RNA in the synthesis of protein[J].Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2011，3(11):a003780.DOI:10.1101/cshperspect.a003780.

[3] ALTMAN S.Ribonuclease P: An enzyme with a catalytic RNA subunit[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol，1989，62:1-36.

[4] KRUGER K，GRABOWSKI P J，ZAUG A J，etal.Self-splicing RNA: Autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of tetrahymena[J].Cell，1982，31(1):147-157.

[5] PEEBLES C L，PERLMAN P S，MECKLENBURG K L，etal.A self-splicing RNA excises an intron lariat[J].Cell,1986，44(2):213-223.

[6] PRODY G A，BAKOS J T，BUZAYAN J M，etal.Autolytic processing of dimeric plant virus satellite RNA[J].Science,1986，231(4745):1577-1580.

[7] HAMPEL A，TRITZ R.RNA catalytic properties of the minimum (-) sTRSV sequence[J].Biochemistry,1989，28(12):4929-4933.

[8] FELDSTEIN P A，BUZAYAN J M，BRUENING G.Two sequences participating in the autolytic processing of satellite tobacco ringspot virus complementary RNA[J].Gene,1989，82(1):53-61.

[9] SHARMEEN L，KUO M Y，DINTER-GOTTLIED G，etal.Antigenomic RNA of human hepatitis delta virus can undergo self-cleavage[J].J Virol,1988，62(8):2674-2679.

[10] SAVILLE B J，COLLINS R A.A site-specific self-cleavage reaction performed by a novel RNA in neurospora mitochondria[J].Cell,1990，61(4):685-696.

[11] NIELSEN H，WESTHOF E，JOHANSEN S.An mRNA is capped by a 2′， 5′ lariat catalyzed by a group I-like ribozyme[J].Science,2005，309(5740):1584-1587.

[12] BAN N，NISSEN P，HANSEN J，etal.The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution[J].Science，2000，289(5481):905-920.

[13] WINKLER W C，NAHVI A，ROTH A，etal.Control of gene expression by a natural metabolite-responsive ribozyme[J].Nature，2004，428(6980):281-286.

[14] ROTH A，WEINBERG Z，CHEN A G Y，etal.A widespread self-cleaving ribozyme class is revealed by bioinformatics[J].Nature Chemical Biology，2014，10(1):56-60.

[15] WEINBERG Z，KIM P B，CHEN T H，etal.New classes of self-cleaving ribozymes revealed by comparative genomics analysis[J].Nature Chemical Biology，2015，11(8):606-610.

[16] LI S，LüNSE C E，HARRIS K A，etal.Biochemical analysis of hatchet self-cleaving ribozymes[J].RNA，2015，21(11):1845-1851.DOI:10.1261/rna.052522.115.

[17] HARRIS K A，LüNSE C E，LI S，etal.Biochemical analysis of pistol self-cleaving ribozymes[J].RNA，2015，21(11):1852-1858.DOI:10.1261/rna.052514.115.

[18] NGUYEN L A，WANG J，STEITZ T A.Crystal structure of Pistol， a class of self-cleaving ribozyme[J].Proceedings of the National Academy of Sciences，2017,114(5):1021-1026.DOI:10.1073/pnas.1611191114.

[21] SARVER N，CANTIN E M，CHANG P S，etal.Ribozymes as potential anti-HIV-1 therapeutic agents[J].Science，1990，247(4947):1222-1226.

[22] HABU Y，MIYANO-KUROSAKI N，TAKEUCHI H，etal.Inhibition of HIV-1 replication by the Cre-loxP hammerhead ribozyme[J].Nucleosides， Nucleotides and Nucleic Acids，2001，20(4/5/6/7):723-726.

[23] GIORDANO V，JIN D Y，REKOSH D，etal.Intravirion targeting of a functional anti-human immunodeficiency virus ribozyme directed to pol[J].Virology，2000，267(2):174-184.

[24] WANG L I，WITHERINGTON C，KING A，etal.Preclinical characterization of an anti-tat ribozyme for therapeutic application[J].Human Gene Therapy，1998，9(9):1283-1291.DOI:10.1089/hum.1998.9.9-1283.

[25] WYSZKO E，BARCISZEWSKA M Z，BALD R，etal.The specific hydrolysis of HIV-1 TAR RNA element with the anti-TAR hammerhead ribozyme: Structural and functional implications[J].International Journal of Biological Macromolecules，2001，28(5):373-380.

[26] LARSSON S，HOTCHKISS G，SU Jin，etal.A novel ribozyme target site located in the HIV-1 nef open reading frame[J].Virology，1996，219(1):161-169.

[27] RAMEZANI A，DING S F，JOSHI S.Inhibition of HIV-1 replication by retroviral vectors expressing monomeric and multimeric hammerhead ribozymes[J].Gene Therapy，1997，4(8):861-867.

[28] SCARBOROUGH RJ，GATIGNOL A.HIV and ribozymes[J].Adv Exp Med Biol,2015，848:97-116.

[29] OPALINSKA J B，GEWIRTZ A M.Nucleic-acid therapeutics: Basic principles and recent applications[J].Nature Reviews Drug Discovery，2002，1(7):503-514.DOI:10.1038/nrd837.

[30] FEDORUK-WYSZOMIRSKA A，SZYMASKI M，GODOWICZ P，etal.Inhibition of HIV-1 gp41 expression with hammerhead ribozymes[J].Biochemical Journal，2015，471(1):53-66.DOI:10.1042/BJ20150398.

[31] PELLETIER R，CARON S O P，PUYMIRAT J.RNA based gene therapy for dominantly inherited diseases[J].Current Gene Therapy，2006，6(1):131-146.

[32] ZENG W，CHEN Y C，BAI Y，etal.Effective inhibition of human immunodeficiency virus 1 replication by engineered RNase P ribozyme[J].PLoS One，2012，7(12):e51855.

[34] BAI J，ROSSI J，AKKINA R.Multivalent anti-CCR5 ribozymes for stem cell-based HIV type 1 gene therapy[J].AIDS Research and Human Retroviruses，2001，17(5):385-399.

[35] MITSUYASU R T，MERIGAN T C，CARR A，etal.Phase 2 gene therapy trial of an anti-HIV ribozyme in autologous CD34+ cells[J].Nature Medicine，2009，15(3):285-292.

[36] WELCH P J，TRITZ R，YEI S，etal.Intracellular application of hairpin ribozyme genes against hepatitis B virus[J].Gene Ther,1997，4(7):736-743.

[37] TAN T M C，ZHOU L，HOUSSAIS S，etal.Intracellular inhibition of hepatitis B virus S gene expression by chimeric DNA-RNA phosphorothioate minimized ribozyme[J].Antisense and Nucleic Acid Drug Development，2002，12(4):257-264.

[38] DAI Wei,ZHOU Rong,YU Hong，etal.Inhibition of hepatitis B virus replication and expressioninvitroandinvivoby the hammerhead ribozymes targeted different sites[J].Infection International，2012(4):206-210.

[39] 賈戰(zhàn)生，周永興.錘頭結(jié)構(gòu)核酶在人肝癌細(xì)胞內(nèi)對(duì)丙型肝炎病毒基因表達(dá)的抑制作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，1999，79(8):631-632.

[40] RYU K J，KIM J H，LEE S W.Ribozyme-mediated selective induction of new gene activity in hepatitis C virus internal ribosome entry site-expressing cells by targeted trans-splicing[J].Molecular Therapy，2003，7(3):386-395.

[41] 張文軍，劉碧瑜，周玉珍，等.一種 HCV 靶向性 M1GS 核酶的構(gòu)建及其體外活性[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2011，31(1):84-88.

[42] 張文軍，李喜芳，羅桂飛，等.丙肝病毒核心基因靶向性 M1GS 核酶的體外抗病毒活性[J].微生物學(xué)報(bào)，2013，53(8):875-881.

[43] 李小英，伍婧茹，劉琳，等.AIVPB2基因靶向性M1GS核酶的構(gòu)建及其體外切割活性測(cè)定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2017，33(1):1-5.

[44] ALVAREZ-SALAS L M，BENTEZ-HESS M L，DIPAOLO J A.Advances in the development of ribozymes and antisense oligodeoxynucleotides as antiviral agents for human papillomaviruses[J].Antiviral Therapy，2003，8(4):265-278.

[45] LU D，CHATTERJEE S，BRAR D，etal.Ribozyme-mediatedinvitrocleavage of transcripts arising from the major transforming genes of human papillomavirus type 16[J].Cancer Gene Therapy，1994，1(4):267-277.

[46] LIU D Z，JIN Y X，HOU H，etal.Preparation and identification of activity of anti-HPV-6b/11E1 universal ribozyme: Rz1198invitro[J].Asian Journal of Andrology，1999，1(4):195-201.

[47] ZHENG Y，ZHANG J，RAO Z.Ribozyme targeting HPV16 E6E7 transcripts in cervical cancer cells suppresses cell growth and sensitizes cells to chemotherapy and radiotherapy[J].Cancer Biology and Therapy，2004，3(11):1129-1134.

[48] 饒智國(guó)，高建飛，章必成，等.特異性核酶增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感度研究[J].腫瘤防治研究，2011，38(5):512-514.

[49] 饒智國(guó)，高建飛，章必成，等.抗HPV16E6核酶對(duì)宮頸癌CaSki細(xì)胞順鉑敏感性影響和機(jī)制的探討[J].中華腫瘤防治雜志，2011，18(11):851-855.

[50] SADPVMOL I， HERRMANN H， EISENWORT G，etal. Expression of CD25 on leukemic stem cells in BCR-ABL1(+) CML: Potential diagnostic value and functional implications[J].Exp Hematol,2017，51:17-24.

[51] LEOPOLD L H，SHORE S K，NEWKIRK T A，etal.Multi-unit ribozyme-mediated cleavage of BCR-ABL mRNA in myeloid leukemias[J].Blood，1995，85(8):2162-2170.

[52] 付輝，李菲菲，馬瓊，等.逆轉(zhuǎn)錄法篩選 mRNA 靶點(diǎn)設(shè)計(jì)核酶對(duì) GPA 的表達(dá)干預(yù)實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)生物工程雜志，2014，34(3):84-90.

[53] KUWABARA T，WARASHINA M，TANABE T，etal.A novel allosterically trans-activated ribozyme， the maxizyme， with exceptional specificityinvitroandinvivo[J].Mol Cell，1998，2(5):617-627.

[54] TANABE T，KUWABARA T，WARASHINA M，etal.Oncogene inactivation in a mouse model[J].Nature，2000，406(6795):473-474.

[55] SODA Y，TANI K，BAI Y，etal.A novel maxizyme vector targeting a BCR-ABL fusion gene induced specific cell death in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia[J].Blood，2004，104(2):356-363.

[56] 吳勇，陳元仲，黃慧芳，等.針對(duì)BCR/ABL的錘頭狀核酶的骨髓凈化作用[J].生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)(英文版)，2003，35(9):859-863.

[57] 周穎，毛建平.Ribozyme和DNAzyme的基因治療實(shí)驗(yàn)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)生物工程雜志，2010，30(6):122-129.

[58] 王巍杰，楊永強(qiáng)，徐長(zhǎng)波.基因治療導(dǎo)入載體的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010(2):38-41.

[59] ROUGE J L，SITA T L，HAO L，etal.Ribozyme-spherical nucleic acids[J].Journal of the American Chemical Society，2015，137(33):10528-10531.DOI:10.1021/jacs.5b07104.

(責(zé)任編輯： 黃仲一 英文審校： 劉源崗)

Discovery of Ribozymes and Their Application in Gene Therapy

ZHOU Gengmin， DIAO Yong， LI Sanshu

(School of Biomedical Sciences， Huaqiao University， Quanzhou 362021， China)

Ribozymes are structured RNA molecules with catalytic activities. Since most ribozymes have the ability to cleave RNAs， they could be used to cleave mRNAs and regulate gene expression， and therefore becoming new tools for gene therapy. This paper describes the discovery history of ribozymes and their applications in the therapy researches of acquired immune deficiency syndrome， hepatitis， tumor， reproductive tract infection and other diseases. Lastly， the paper analyzes the technological advantages and the existing problems of the ribozyme′s application in gene therapy, and looks into the future of researches on the establishment of more crystal structures of new ribozymes， understanding of ribozyme cleavage mechanisms, and the discovery of new biological functions of ribozymes.

ribozyme； non-coding RNA； gene therapy； gene expression； cut RNA

10.11830/ISSN.1000-5013.201704012

2017-03-30

李三暑(1972-)，男，教授，博士，主要從事核酶和核糖開關(guān)的研究.E-mail:sanshuli@126.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81271691， 81371669)； 華僑大學(xué)高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(Z16Y0015)； 華僑大學(xué)研究生科研創(chuàng)新能力培育計(jì)劃資助項(xiàng)目(1511316013)

Q 7

A

1000-5013(2017)04-0509-06