林小娟，許楊彪，劉向紅，張科明*

（廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧530021）

桑椹酒中氨基酸含量分析

林小娟，許楊彪，劉向紅，張科明*

（廣西食品藥品檢驗(yàn)所，廣西南寧530021）

建立采用氨基酸分析儀測(cè)定桑葚酒中18種氨基酸含量的分析方法。樣品經(jīng)氮吹去除乙醇處理后，采用酸/堿水解將其中的蛋白質(zhì)和肽類化合物轉(zhuǎn)化成游離氨基酸，采用氨基酸分析儀測(cè)定其含量。18種氨基酸在2.5～250.0 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.998 8～0.999 9，檢出限均＜0.50 mg/L，各化合物的加標(biāo)回收率為72.8%～104.0%，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜5.0%。該方法可靠、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，為桑椹酒的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供參考資料。

桑椹酒；氨基酸；酸/堿水解；氨基酸分析儀

桑椹酒是以新鮮桑椹或桑椹果汁為原料，利用酵母經(jīng)酒精發(fā)酵、陳釀等工藝釀制而成的一種新興果酒[1]。其不僅富含大量人體必需的氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，而且具有增強(qiáng)免疫、改善生理機(jī)能、促進(jìn)造血細(xì)胞生長、延緩衰老、抗腫瘤等多種保健功能[2]。氨基酸作為桑椹酒的重要營養(yǎng)指標(biāo)之一，其組成和含量能夠在一定程度上反映桑椹酒的原材料來源，而且會(huì)影響酒的口感和人們接受的程度，因此氨基酸的檢測(cè)對(duì)桑椹酒營養(yǎng)價(jià)值的研究和質(zhì)量控制具有十分重要意義。

目前，應(yīng)用于氨基酸分析的方法很多，包括柱前衍生-高效液相色譜法[3-8]、柱后衍生-陽離子交換色譜法[9-10]、毛細(xì)管電泳法[11]、離子交換色譜法[12]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[13]等。其中，柱后衍生-陽離子交換色譜法被認(rèn)為是氨基酸分析的經(jīng)典方法，運(yùn)用該技術(shù)研制的氨基酸分析儀也于20世紀(jì)60年代初面世，由于其具有穩(wěn)定性高、重現(xiàn)性好、柱子壽命長、分析種類多等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于日常檢測(cè)工作中。

以往的報(bào)道一般測(cè)定酒中的游離氨基酸[14-18]，由于桑椹酒一般采用全發(fā)酵或半發(fā)酵方式釀制而成，故常含有蛋白結(jié)合態(tài)氨基酸或肽類物質(zhì)。本研究將桑椹酒進(jìn)行酸/堿水解，采用氨基酸分析儀測(cè)定其中的總氨基酸，以期為桑椹酒的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（包括天門冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絡(luò)氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸共17種，除胱氨酸含量為1.25 μmol/mL外，其余16種氨基酸含量均為2.50 μmol/mL）：德國Sigma-Aldrich公司；色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：中國生物制品檢定研究院。

0.04 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 3.45）、0.07 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 10.85）、0.50 mol/L氫氧化鈉再生液、樣品稀釋液、茚三酮（均為色譜純）：德國Sykam公司；鹽酸、氫氧化鈉（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

桑椹酒樣品：購于6個(gè)不同生產(chǎn)廠家，分別記作1#、2#、3#、4#、5#、6#。

1.2 儀器與設(shè)備

S433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀：德國Sykam公司；XS205DU電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；N-EVAP 112型氮吹儀：美國Organomation Associates公司；UN260干燥箱：德國Memmert公司；Milli-Q超純水儀：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用水定容于25 mL容量瓶中，配制成濃度為2.0 μmol/mL的儲(chǔ)備溶液，備用。

分別精密量取不同體積的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用樣品稀釋液稀釋成不同濃度的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后進(jìn)氨基酸分析儀分析測(cè)定，繪制峰面積與標(biāo)準(zhǔn)品濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 氨基酸分析儀檢測(cè)條件

色譜柱：LCA K06/Na（150 mm×4.6 mm，7 μm）；升溫程序：0～21min，58℃；21～26 min，58～74℃；26～46 min，74℃；46～50 min，74～58℃；50～57 min，58℃；進(jìn)樣量：50 μL；檢測(cè)波長：570 nm（除脯氨酸外其余17種氨基酸）、440 nm（脯氨酸）；流動(dòng)相流速：0.45mL/min；茚三酮流速：0.25mL/min；反應(yīng)器溫度：130℃；流動(dòng)相梯度程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度程序Table 1 Elution gradient program of mobile phase

1.3.3 前處理方法

酸水解：精密移取樣品2.00 mL置于水解管中，80℃條件下氮吹至近干，殘留物用2.0 mL水溶解，加入6 mol/L鹽酸溶液2.0mL以及新蒸餾的苯酚4滴，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。將已封口的水解管置于110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22h后，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中，用水定容至刻度。精密移取濾液5.00mL置10mL容量瓶中，用樣品稀釋液定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液上機(jī)分析（除色氨酸外）。

堿水解：精密移取樣品2.00 mL置于水解管中，80℃條件下氮吹至近干，殘留物用2.0 mL水溶解，加入4 mol/L氫氧化鈉溶液2.0mL，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口。將已封口的水解管置于110℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解22 h后，取出冷卻。打開水解管，用6 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)水解液至中性，然后將水解液全部轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，用水定容至刻度。精密移取濾液5.00 mL置10 mL容量瓶中，用樣品稀釋液定容至刻度，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液用于色氨酸的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸色譜分離情況

不同波長條件下的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。酸水解/堿水解處理后桑椹酒樣品中分離出的各種氨基酸的色譜圖見圖2。

圖1 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of amino acids

圖2 桑椹酒樣品氨基酸色譜圖Fig.2 Chromatogram of amino acids in mulberry wine sample

由圖1、圖2可知，在1.3.2檢測(cè)條件下，18種氨基酸均能達(dá)到很好的分離效果，且峰型較好。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

分別測(cè)定了某一桑椹酒中游離態(tài)、蛋白結(jié)合態(tài)以及肽類氨基酸含量。結(jié)果表明，桑椹酒雖然含有少量游離氨基酸，但是主要以蛋白結(jié)合態(tài)或肽類形式存在。同時(shí)由于桑椹酒生產(chǎn)工藝復(fù)雜，生產(chǎn)周期長，儲(chǔ)藏時(shí)間不定，酸度較高，其中蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)會(huì)逐漸轉(zhuǎn)化為氨基酸，因此，以氨基酸總量作為桑椹酒中氨基酸考察指標(biāo)更有意義。

桑椹酒酒精度一般高于7%vol，乙醇含量較高，不進(jìn)行去乙醇處理而直接進(jìn)行酸/堿水解，易產(chǎn)生不溶于水的氣體，在高溫密閉條件下，易導(dǎo)致水解管爆裂[19]，因此本實(shí)驗(yàn)先對(duì)酒樣進(jìn)行80℃條件下氮吹至近干操作，除去乙醇，再進(jìn)行酸/堿水解，保證水解反應(yīng)的順利進(jìn)行。

2.3 線性方程與檢出限考察

將濃度為2.5～250.0 μmol/L的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果18種氨基酸的峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.998 8～0.999 9。檢出限采用某一已知含量的樣品溶液來計(jì)算。當(dāng)信噪比（signal-noise ratio，RSN）為3時(shí)，測(cè)定各氨基酸的檢出限，結(jié)果見表2。

表2 氨基酸分析的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Regression equations,linear ranges,correlation coefficients and detection limits of amino acids analysis

2.4 重復(fù)性與回收率考察

取某一桑椹酒樣品搖勻后均勻取樣6份，每份2.00 mL，按1.3部分的方法處理樣品，分別進(jìn)行氨基酸含量測(cè)定，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），以考察方法的重復(fù)性。結(jié)果顯示，RSD為1.11%～3.85%，表明該方法的重復(fù)性良好。

取某一桑椹酒，用本研究方法測(cè)定其氨基酸含量，并將其作為空白基質(zhì)，添加氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 氨基酸回收率的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of amino acids recoveries

由表3可知，各化合物的加標(biāo)回收率為72.8%～104.0%，RSD為0.56%～4.72%。

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

對(duì)6個(gè)不同廠家的桑椹酒進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果見表4。

表4 不同廠家的桑椹酒中氨基酸的含量Table 4 Amino acids contents of mulberry wine by different manufactures

由表4可知，不同廠家桑椹酒中氨基酸總量、必需氨基酸（蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸）和非必需氨基酸的含量均存在顯著性差異?？偘被岷孔罡叩氖?#廠家，含量為2 484 mg/L，含量最低的是5號(hào)廠家，含量為317 mg/L。在檢測(cè)的18種氨基酸中，天門冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸含量均相對(duì)較高。

3 結(jié)論

本研究將桑椹酒氮吹去除乙醇處理后采用酸/堿水解，以避免實(shí)驗(yàn)過程因?yàn)楫a(chǎn)生氣體而使水解管爆裂的可能，同時(shí)方法操作簡(jiǎn)單、周期短，可實(shí)現(xiàn)較小的最終定容體積，提高了對(duì)桑椹酒這類低氨基酸含量的氨基酸檢出能力，準(zhǔn)確性也相應(yīng)得到提升。水解后的游離氨基酸采用氨基酸分析儀測(cè)定，18種氨基酸在45min內(nèi)得到良好分離，在2.5～250.0 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R為0.9988～0.9999，檢出限均＜0.50mg/L，各化合物的加標(biāo)回收率為72.8%～104.0%，重復(fù)性相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜5.0%。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、重復(fù)性好、回收率高，可為桑椹酒的營養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)提供參考資料。

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Detection of amino acids contents in mulberry wine

LIN Xiaojuan,XU Yangbiao,LIU Xianghong,ZHANG Keming*
(Guangxi Institute for Food and Drug Control,Nanning 530021,China)

The determination method for 18 kinds of amino acids in mulberry wine was established by amino acid analyzer.After nitrogen-blow to remove ethanol,the protein and peptide in mulberry wine were decomposed into free amino acids by hydrolysis with acid or alkali,and then the contents were determined by amino acid analyzer.The calibration curves of the 18 amino acids were linear in the range of 2.5-250.0 μmol/L with correlation coefficients of 0.998 8-0.999 9,limit of detection(LOD)for the compounds were all less than 0.50 mg/L.The adding standard recovery rate was 72.8%-104.0%,and relative standard deviation(RSD)of the repeatability tests results for the compounds were less than 5.0%.The method was accurate,reliable and with good repetition,and it provided reference for the evaluation of the nutritional value of mulberry wine.

mulberry wine;amino acids;acid/alkali hydrolysis;amino acid analyzer

O657.7

0254-5071（2017）06-0158-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.032

2017-02-15

廣西食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目（桂地標(biāo)食2016004號(hào)）

林小娟（1988-），女，助理工程師，本科，研究方向?yàn)槭称?、化妝品質(zhì)量安全檢測(cè)。

*通訊作者：張科明（1982-），男，主管藥師，碩士，研究方向?yàn)槭称?、化妝品質(zhì)量安全檢測(cè)。