姚曉瑞寧，高飛飛，王斌，肖婧，賈晨坤，史學偉*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.石河子大學信息科學與技術(shù)學院，新疆石河子832000）

庫爾勒香梨表皮酵母菌的篩選及耐受性的分析

姚曉瑞寧1，高飛飛1，王斌1，肖婧2，賈晨坤1，史學偉1*

（1.石河子大學食品學院，新疆石河子832000；2.石河子大學信息科學與技術(shù)學院，新疆石河子832000）

以優(yōu)良的庫爾勒香梨為原料，使用YEPD培養(yǎng)基，從中分離獲得100株酵母菌，按照菌落特征，形態(tài)學分析并結(jié)合ITS區(qū)基因序列同源性分析確定其種屬，確定其為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和奧默畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），并對其進行耐酸、耐糖、耐乙醇和耐二氧化硫的分析。結(jié)果表明，菌株D4的最高耐糖含量為18%、菌株13為14%，菌株D4耐受pH值為3.0、菌株13耐受pH值為3.5，菌株D4、13最高耐乙醇體積分數(shù)均為9%，菌株D4的最高耐二氧化硫含量為0.20%、菌株13為0.15%。

庫爾勒香梨；酵母菌；耐受性分析

新疆維吾爾自治區(qū)巴音郭楞蒙古自治州阿克蘇地區(qū)是最早生產(chǎn)庫爾勒香梨的地方，1 400年的栽培歷史使得庫爾勒香梨成為新疆獨特的優(yōu)良特產(chǎn)，巴音郭楞蒙古自治州地區(qū)是庫爾勒香梨最主要的種植基地，種植面積達109.49萬畝，年產(chǎn)量在104.6萬t以上[1]。該產(chǎn)品遠銷港澳地區(qū)、美國、加拿大、歐盟國家以及日本、新西蘭等20多個國家，年均創(chuàng)匯3 000萬美元。庫爾勒香梨在香梨品種中是一個遠近聞名的“名、優(yōu)、特”優(yōu)良品種，也是該地區(qū)甚至全國最優(yōu)異的地方梨品種之一。庫爾勒香梨被譽為“西域圣果”，其外觀誘人、皮薄、果肉白色微綠、汁多味甜、肉質(zhì)細膩酥脆、清脆爽口、其特點享譽國內(nèi)外，并且富含多種營養(yǎng)成分，因而受到國內(nèi)外廣大消費者的青睞[2]。

現(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)離不開微生物發(fā)酵劑[3]，目前德、法、荷蘭、美國、加拿大均已有優(yōu)良的活性干酵母商品生產(chǎn)。中國的酵母工業(yè)形成了安琪、丹寶利、梅山等14家酵母企業(yè)。有關(guān)微生物選育的研究也成為熱點，近年來國外相關(guān)學者在酵母菌對發(fā)酵制品風味品質(zhì)影響方面做了大量的研究工作，相關(guān)研究成果充分表征了酵母菌在發(fā)酵過程中所起到的關(guān)鍵作用及對香氣物質(zhì)富集與產(chǎn)品整體風味呈現(xiàn)的影響力。庫爾勒香梨經(jīng)加工可制成香梨果酒、香梨白蘭地、香梨精汁、香梨濁汁以及香梨發(fā)酵飲料等。

人類對于酵母菌的深入研究使得人們的生活水平有了極大的提高[4]。近年來，隨著食品技術(shù)的發(fā)展，果酒果醋的種類越來越多，新疆有著“瓜果之鄉(xiāng)”的美譽，但是在果酒方面的發(fā)展比較欠缺，其中發(fā)酵菌種單一也是制約其發(fā)展的主要原因，因此，本試驗對于發(fā)酵菌種的選育的意義深遠，為今后果酒果醋的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

庫爾勒香梨：購自新疆庫爾勒市及石河子市大型超市。

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母浸粉、瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司；氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、檸檬酸鈉：天津市致遠化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀：天津永晟精細化工廠有限公司；丙三醇：天津市福晨化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：天津市富宇精細化工有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基[5]：葡萄糖2%、酵母浸粉1%、蛋白胨2%。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（YPD）培養(yǎng)基[5]：葡萄糖2%、酵母浸粉1%、蛋白胨2%、瓊脂2%。

耐糖培養(yǎng)基[6]、耐酸培養(yǎng)基[7]、耐酒精培養(yǎng)基[8]、耐NaHSO3培養(yǎng)基[9]均是在YEPD培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加被測物質(zhì)并調(diào)整各項比例。

1.1.4 溶液配制

Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.0～8.0）：某一特定pH值的0.05 mol/L Tris緩沖液的配制：將50 mL 0.1 mol/L Tris堿溶液與配方表中所示相應體積（單位mL）的0.1 mol/L HCl混合，加水將體積調(diào)至100 mL即可（配制0.1 mol/L HCl即為8.58 mL濃鹽酸用蒸餾水定容到1 000 mL）。

表1 Tris-HCl緩沖溶液配制方法Table 1 Preparation method of Tris-HCl buffered solution

另配制10%的SDS溶液、1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）、1×TE（10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；1 mmol/L EDTA，pH 8.0）。

1.2 儀器與設(shè)備

5810R高速冷凍離心機：德國Eppendorf儀器公司；BCD-265F冷藏冷凍箱：榮事達集團；LAC-5040S全自動高壓滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；pHS-3C標準型pH計：上海精密科學儀器有限公司；CX21FS1光學顯微鏡：Olympus公司；722光柵紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；Bnp-9272智能生化培養(yǎng)箱：上海精宏試驗設(shè)備有限公司；SHZ-B水浴恒溫振蕩器：上海博訊實業(yè)有限公司；TC-512PCR擴增儀：英國Techne公司；Power Pac Universal水平電泳儀、GelDOCXR凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集

（1）2015年10月于庫爾勒農(nóng)八師梨園采集的香梨。

（2）2016年3月于石河子好家鄉(xiāng)超市購買的香梨。

1.3.2 樣品預處理

取適量香梨皮于2%的無菌葡萄糖水溶液中浸泡，置于酵母培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)24～48 h。

1.3.3 菌株的分離純化

將1.3.2中的菌液梯度稀釋，用涂布法每一梯度接種三個平面，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h；將不同形態(tài)大小的酵母菌接種在YEPD培養(yǎng)基中，獲得單菌落后接入液體培養(yǎng)基活化24 h，置于甘油和水的混合物中保藏備用。

1.3.4 酵母菌的形態(tài)特征分類

常規(guī)鑒定方法主要依據(jù)《酵母的特征及鑒定手冊》[10]以及張紀忠[11]的《微生物分類學》。

1.3.5 ITS區(qū)基因PCR擴增

根據(jù)形態(tài)學特征選取生長力較好且具有代表性的菌株按以下方法進行DNA提取及PCR擴增產(chǎn)物測序。

（1）DNA的提取

取1mL菌懸液，5000r/min離心3min；離心后的菌體用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液洗脫三次，再用0.5 mL無菌水洗脫三次，5 000×g離心3 min；細胞懸液用0.5 mL 6 mol/L的尿素和0.1 mL 10%SDS于37℃培養(yǎng)20 min；沸水煮沸后加熱5 min；加熱后25℃、8 000×g離心10 min；棄上清液，向離心管中加入0.2 mol/L NaOH 0.1 mL，37℃，10 min；25℃、3000×g離心3min，取上清液；用2.5倍體積的無水乙醇加入上清液，-20℃，放置2 h；取出后12 000×g、4℃離心20 min，再用體積分數(shù)70%的乙醇洗脫；12 000×g離心5 min；洗脫后烘干，加100 μL 1×TE-20℃保存[12]。

（2）PCR擴增

PCR擴增使用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCT GCGG-3′和引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，PCR反應體系總體積為25 μL，每管中加入2×EcoTaqSuper Mix（+dye）14 μL；引物各1.25 μL；模板DNA 2 μL；加雙蒸水至6.5μL。PCR循環(huán)為95℃預變性5min，95℃變性1min，52℃退火2 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，72 μ延伸10 min[13]。取4μLPCR產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL GoldView）電泳后在GelDOCXR凝膠成像儀中觀察結(jié)果。

（3）基于ITS區(qū)序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

PCR產(chǎn)物交至華大基因有限公司測序，依據(jù)測序結(jié)果，用Blast搜索程序從GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中調(diào)出相似性較高的相關(guān)菌株的ITS區(qū)序列進行同源性比較，用Clustal X進行多序列比對，系統(tǒng)進化矩陣根據(jù)Kimura模型估算，用MEGA（molecular evolutionary genetics analysis）5.0軟件采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）聚類分析，并構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹[14]。同時，重復取樣1 000次進行自展值（bootstrap value）分析來評估系統(tǒng)進化樹的拓撲結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

1.3.6 酵母菌耐受性的分析

（1）菌株的活化

將4℃保藏的已鑒定的菌株，接種于YEPD液體培養(yǎng)基，在28℃條件下活化培養(yǎng)48 h。

（2）菌株的擴大培養(yǎng)

將活化的菌株按10%的接種量再次接于YEPD液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，保證菌體進入穩(wěn)定的對數(shù)期，以便后續(xù)試驗中保持菌株穩(wěn)定的活性。

（3）酵母菌的耐糖試驗

取活化好的菌液按4%接種量接種于葡萄糖含量分別為2%、5%、10%、14%、18%、22%的YPD培養(yǎng)基中，每組2個平行，恒溫水浴振蕩箱28℃、180 r/min培養(yǎng)，由于菌懸液濃度與OD600nm值成正比，所以利用比濁法，每隔6 h測定一次樣品的OD600nm值[15]，獲得試驗酵母菌的生長曲線。

（4）酵母菌的耐酸試驗

將培養(yǎng)好的菌液（OD600nm值約為1.0）按4%接種量接種于pH為5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.5的YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件及計數(shù)方法同耐糖試驗[16]。

（5）酵母菌的耐酒精試驗

將培養(yǎng)好的菌液（OD600nm值約為1.0）按4%接種量接種于無水乙醇體積分數(shù)分別為0、3%、6%、9%、12%、15%的YPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件及計數(shù)方法同耐糖試驗[17]。

（6）酵母菌的耐NaHSO3試驗

按4%的接種量將擴增培養(yǎng)好的菌液接種到含NaHSO3液體培養(yǎng)基（SO2含量分別為0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）中，培養(yǎng)和觀察方法同耐糖菌株的篩選[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的分類

2.1.1 形態(tài)學鑒定

本試驗共分離篩選得到100株酵母菌（根據(jù)觀察順序編號），根據(jù)菌落的顏色和顯微形態(tài)將其聚類，共分為5種形態(tài)類型，結(jié)果見表2。

表2 培養(yǎng)基上酵母的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of yeast culture

2.1.2 分子生物學鑒定

根據(jù)分類結(jié)果，選34株菌提取DNA，進行PCR擴增，結(jié)果見圖1。

圖1 菌株P(guān)CR擴增凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis of PCR amplification results of strains

由圖1可知，條帶清晰的有菌株D4（Ⅱ類）、D7（Ⅲ類）、E11（Ⅱ類）、13（Ⅲ類），對這4株菌基因組進行測序。

2.1.3 基于ITS區(qū)序列的酵母菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

參考電泳圖選取4株菌的PCR產(chǎn)物交至華大基因有限公司測序，根據(jù)測序結(jié)果，構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖2。

圖2 基于ITS區(qū)序列分析的酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of yeast strains based on ITS sequence analysis

由圖2可知，菌株13、D7、D4、E11均為酵母菌，菌株13與葡萄汁有孢漢遜酵母的標準菌種相比較置信度為99%，菌株D4與奧默畢赤酵母的標準菌株相比的置信度為98%，D7和E11也分別屬于漢遜酵母屬和畢赤酵母屬，但與標準菌株相比進化距離比較長，所以本實驗選用能基本確定種屬關(guān)系的菌株13和D4兩株酵母菌進行后續(xù)實驗。

2.2 D4、13兩株菌的耐受性分析

（1）耐糖生長曲線及耐受性分析

菌株D4和13在不同葡萄糖含量條件下的生長曲線見圖3。由圖3A可知，隨著糖含量增加，菌株D4生長受到不同程度抑制。在糖含量18%條件下，生長量明顯下降，延滯期為12 h；在糖含量22%條件下，延滯期為48 h，且未出現(xiàn)明顯增長。可得菌株D4的最高耐糖濃度為18%。

由圖3B可知，隨著糖含量增加，菌株13生長受到不同程度抑制。延滯期為6 h時，生長量明顯下降；當糖含量為18%和22%時，菌株13的延滯期延長至48 h未出現(xiàn)明顯增長?？傻镁?3的最高耐糖濃度為14%。

圖3 菌株D4（A）和菌株13（B）在不同葡萄糖含量下的生長曲線Fig.3 Growth curves of strain D4(A)and strain 13(B)in different glucose concentration

（2）耐酸生長曲線及耐受性分析

圖4 菌株D4（A）和菌株13（B）在不同pH條件下的生長曲線Fig.4 Growth curves of strain D4(A)and strain 13(B)in different pH

菌株D4和13在不同pH條件下的生長曲線見圖4。由圖4A可知，菌株D4在pH為3.0時，延滯期為6 h，其生長受到明顯抑制；在pH為2.5和3.0時，未出現(xiàn)明顯增長；由此得出D4的最高耐酸pH為3.0。

由圖4B可知，菌株13在pH為5.6、4.5時其生長未受到抑制；菌株13在pH為3.5時，生長受到抑制，生長量有所下降；在pH為3.0、2.5、2.0時其生長受到明顯抑制，延滯期延長至48h后未出現(xiàn)明顯增長；得到菌株13的最高耐酸pH為3.5。

（3）耐乙醇生長曲線及耐受性分析

菌株D4和13在不同乙醇體積分數(shù)條件下的生長曲線見圖5。由圖5A可知，在乙醇體積分數(shù)為3%、6%時，菌株D4受到抑制不強烈，延滯期稍有延長；乙醇體積分數(shù)9%時，延滯期延長18 h，抑制明顯；乙醇體積分數(shù)12%和15%時，未出現(xiàn)明顯增長，所以菌株D4的乙醇最高耐受性體積分數(shù)為9%。

由圖5B可知，菌株13在乙醇體積分數(shù)為3%時未受到明顯抑制；乙醇體積分數(shù)6%、9%時，延滯期延長至12 h，抑制明顯，增長緩慢；乙醇體積分數(shù)12%、15%時，菌株13的延滯期延長至48 h未出現(xiàn)明顯增長，所以菌株13的乙醇最高耐受性體積分數(shù)為9%。

圖5 菌株D4（A）和菌株13（B）在不同乙醇體積分數(shù)下的生長曲線Fig.5 Growth curves of strain D4(A)and strain 13(B)in different ethanol concentration

（4）耐二氧化硫生長曲線及耐受性分析

菌株D4和13在不同NaHSO3含量下的生長曲線見圖6。由圖6A可知，NaHSO3含量0.20%條件下，延滯期逐漸延長，生長量明顯降低；NaHSO3含量0.25%條件下，延滯期延長至48 h且未有明顯增長，所以菌株D4的最高耐二氧化硫含量為0.20%。

由圖6B可知，在NaHSO3含量0.15%條件下，延滯期逐漸延長至18 h，生長速率明顯降低；在NaHSO3含量0.20%、0.25%條件下，延滯期逐漸延長至48 h未出現(xiàn)明顯增長；所以菌株13的最高耐二氧化硫含量為0.15%。

圖6 菌株D4（A）和菌株13（B）在不同NaHSO3含量下的生長曲線Fig.6 Growth curves of strain D4(A)and strain 13(B)in different NaHSO3concentration

3 結(jié)論

通過對庫爾勒香梨表皮酵母菌的篩選、純化，對其DNA進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物送檢測序后得到2種不同的酵母菌，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。依據(jù)繪制的發(fā)育樹中菌株13和葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）相似性的置信度為99%；菌株D4與奧默畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）相似性的置信度為98%。

根據(jù)菌株篩選結(jié)果，對其進行耐受性分析，并繪制酵母菌的生長曲線；分析曲線得到菌株D4的最高耐糖濃度為18%、菌株13為14%，菌株D4最耐酸pH為3.0、菌株13為3.5，菌株D4、13最高耐酒精體積分數(shù)均為9%，菌株D4的最高耐二氧化硫含量為0.20%、菌株13為0.15%。根據(jù)以上特點可以提高發(fā)酵質(zhì)量并且對新風味的研究提供理論依據(jù)，所以對香梨表面酵母菌的研究是十分有必要的。

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Screening and tolerance analysis of yeast on Kurla pear peel

YAO Xiaoruining1,GAO Feifei1,WANG Bin1,XIAO Jing2,JIA Chenkun1,SHI Xuewei1*
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832000,China; 2.College of Information Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832000,China)

Using excellent Korla pears as raw material,100 strains of yeasts were isolated from Korla pears by YEPD medium.The strains were identified according to the characteristics of colony and morphological analysis and the homology analysis of ITS gene sequence.Results showed that Hanseniaspora uvarumandPichia kudriavzeviiwere confirmed and then their acid,sugar,ethanol and sulfur dioxide tolerance were tested.The results showed that for strain D4,the highest sugar,pH,ethanol concentration and sulfur dioxide tolerances were 18%,3.0,9%and 0.20%,respectively. For strain 13,the tolerances mentioned above were 14%,3.5,9%and 0.15%,respectively.

Korla pear;yeast;tolerance analysis

Q935

0254-5071（2017）06-0067-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.014

2016-12-20

兵團科技攻關(guān)計劃（2016AB009）；青年科學基金項目（31500092）；兵團科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計劃項目（2016AD024）；高層次人才科研啟動資金專項（RCZX201526）

姚曉瑞寧（1994-），女，碩士研究生，研究方向為食品安全生物技術(shù)。

*通訊作者：史學偉（1980-），男，副教授，博士，研究方向為食品科學生物技術(shù)。