尹永華，程文杰，延敏博

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院 泌尿外科，廣東 深圳 518104；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 泌尿外科，廣東 珠海 519000）

臨床研究·論著

膀胱尿路上皮癌中PTEN表達(dá)與其基因甲基化的關(guān)系*

尹永華1，程文杰2，延敏博2

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬深圳沙井醫(yī)院 泌尿外科，廣東 深圳 518104；2.中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院 泌尿外科，廣東 珠海 519000）

目的 探討膀胱尿路上皮癌（BUCC）中第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（PTEN）表達(dá)與其基因啟動(dòng)子甲基化的關(guān)系。方法應(yīng)用Western blot、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（MSP），檢測(cè)41例BUCC和18例正常膀胱組織中PTEN蛋白的表達(dá)水平及其基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并分析兩者的相關(guān)性。結(jié)果

BUCC中PTEN蛋白表達(dá)低于正常膀胱組織（P＜0.05），而BUCC中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率為53.66%（22/41），高于正常膀胱組織的0.00%（0/18）（P＜0.05）；與甲基化陰性組的BUCC組織相比，22例甲基化陽(yáng)性組的PTEN表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論BUCC中PTEN蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，這與其基因啟動(dòng)子高甲基化密切相關(guān)。

膀胱尿路上皮癌；磷酸酶-張力蛋白基因；DNA甲基化

膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial cell carcinoma，BUCC）是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。近期研究發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化導(dǎo)致的基因沉默或者低表達(dá)可能與其發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1]。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因（phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）是第1個(gè)最早發(fā)現(xiàn)的具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物可以使PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的阻滯，防止腫瘤的發(fā)生[2]。PTEN基因在多種惡性腫瘤中存在表達(dá)缺失或低表達(dá)，其中大部分與該基因啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[3]，而在膀胱尿路上皮癌中相關(guān)的研究較少。本文應(yīng)用Western blot、甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（methylation specific polymerase chain reaction，MSP）檢測(cè)膀胱尿路上皮癌中PTEN基因的表達(dá)水平及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，并分析兩者的關(guān)系，為揭示膀胱癌發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年3月-2015年11月在中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院就診的膀胱尿路上皮癌患者手術(shù)標(biāo)本41例。其中，男性29例，女性12例；平均年齡59.5（35～81）歲；臨床分期：非肌層浸潤(rùn)性（Tis Ta、T1）26例，肌層浸潤(rùn)性（T2～T4）15例；病理分級(jí)：Ⅰ級(jí) 14例，Ⅱ級(jí)16例，Ⅲ級(jí)11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例；另取同期正常膀胱組織標(biāo)本18例作為對(duì)照組，兩組性別和年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以上標(biāo)本均經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)，標(biāo)本離體后立即置液氮冷凍，而后置入-80℃冰箱中冷凍保存。在與患者溝通并征得其同意的情況下收集所有標(biāo)本，符合本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的要求。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

兔抗人PTEN單克隆抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購(gòu)自廣州齊云生物有限公司，動(dòng)物組織DNA試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程有限公司，EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒購(gòu)自美國(guó)Zymo Research公司，引物合成由上海生工生物工程有限公司提供，紫外分光光度儀計(jì)購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司（型號(hào)：DU800），酶標(biāo)儀MK3購(gòu)自芬蘭Thermo labsystems公司，PTC-220-聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó) Zymo Research公司，2020D紫外熒光數(shù)字成像儀（日本島津公司）。

1.3 Western blot檢測(cè)

取-80℃保存的新鮮膀胱尿路上皮癌組織及正常膀胱組織，提取總蛋白并檢測(cè)其濃度。每孔上樣量為30μg，電泳、轉(zhuǎn)膜，含10%脫脂奶粉封閉液中封閉2 h；在裝有稀釋好的一抗工作液的雜交袋中過夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗膜5次，15 min/次；加二抗于室溫孵育2 h，將其置于暗室，取醫(yī)用X線底片覆蓋，曝光1 min后，依次顯影、定影；并予Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 MSP法

使用動(dòng)物組織DNA試劑盒從膀胱尿路上皮癌和正常組織中提取基因組DNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA含量和純度，予EZ DNA Methylation-GoldTMKit試劑盒進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾并純化，置于-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Methprimer軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，并由上海生工生物工程有限公司合成。甲基化正向引物：5'-GTAT TTCGAGTAAAGGAAGAAGACG-3'，反向引物：5'-G ATAAAAAACTACAACCCAACGAA-3'；非甲基化正向引物：5'-TATTTTGAGTAAAGGAAGAAGATGA-3'，反向引物：5'-CAATAAAAAACTACAACCCAACAAA-3'；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度均為200 bp；PCR反應(yīng)體系為50μl，含 500 ng/μl模板 DNA 1 μl，10×LA PCRTMBuffer（Mg2+plus）5μl，dNTP Mixture 8μl，20μmol/L正反向特異性引物各 0.5 μl，ddH2O 34.5 μl，日本TaKaRa LA TaqTM0.5 μl。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性 45 s，55℃退火 30 s，74℃延伸 30 s，共循環(huán)30次，74℃繼續(xù)延伸10 min。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，以ddH2O作空白對(duì)照，電壓100V，30 min后在紫外燈下觀察結(jié)果并照相。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率或百分比表示，用χ2檢驗(yàn)，兩變量非配對(duì)比較用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN蛋白的表達(dá)

用Western blot定量檢測(cè)膀胱尿路上皮癌組織和正常膀胱組織中PTEN的表達(dá)，并以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）表達(dá)為內(nèi)參蛋白。兩組PTEN蛋白表達(dá)比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=5.350，P=0.000），PTEN表達(dá)水平在膀胱尿路上皮癌組織中低于正常膀胱組織。見圖1。

圖1 膀胱尿路上皮癌和正常膀胱組織中PTEN蛋白的表達(dá)

2.2 PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

41例膀胱尿路上皮癌標(biāo)本中，22例標(biāo)本中的PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化（出現(xiàn)甲基化條帶），其PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化陽(yáng)性率為53.66%（22/41），而18例正常膀胱組織標(biāo)本均未發(fā)生甲基化（只有非甲基化條帶），其PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化陽(yáng)性率為0%（0/18），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=15.401，P=0.000），PTEN 基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生甲基化率在膀胱尿路上皮癌組織中高于正常膀胱組織。見圖2。

2.3 PTEN表達(dá)與其基因甲基化的關(guān)系

按照PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，將41例膀胱尿路上皮細(xì)胞癌組織分為甲基化陽(yáng)性組（22例）及陰性組（19例），兩組PTEN表達(dá)水平比較，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=16.751，P=0.000），啟動(dòng)子甲基化陽(yáng)性組PTEN表達(dá)水平低于甲基化陰性組。

圖2 膀胱尿路上皮癌和正常膀胱組織中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)

3 討論

膀胱癌是我國(guó)發(fā)病率最高的泌尿系惡性腫瘤，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率也高居泌尿生殖系腫瘤的第2位，僅次于前列腺癌[4]，60歲以后，男性膀胱癌死亡率即超過腎腫瘤，居男性泌尿系惡性腫瘤第1位[5]。膀胱尿路上皮癌是膀胱癌中最常見的病理類型，近年來不但發(fā)病率持續(xù)上升，而且膀胱尿路上皮癌的復(fù)發(fā)率也逐漸增高[6]。

PTEN是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，其編碼產(chǎn)物是一種PIP3磷酸酶，通過減少PIP3生成，抑制細(xì)胞遷移，抑制血管生成等起到抗腫瘤的作用。目前發(fā)現(xiàn)，PTEN蛋白在多種惡性腫瘤組織中均存在表達(dá)下降，并認(rèn)為PTEN基因低表達(dá)可能與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)[7]。

DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)的一種類型，其可直接干擾特異轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子上識(shí)別位點(diǎn)的結(jié)合從而阻止轉(zhuǎn)錄因子與基因形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)而影響基因表達(dá)，因此，DNA甲基化與癌癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究者已從膀胱癌患者的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因與修復(fù)基因的甲基化改變，如p14、p15、Rb、RASSFlA 等，而關(guān)于膀胱尿路上皮癌中PTEN的甲基化研究較少[8-11]。

筆者運(yùn)用Western blot檢測(cè)及MSP技術(shù)進(jìn)行研究，對(duì)比PTEN基因表達(dá)水平及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在膀胱尿路上皮癌和正常膀胱組織中的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膀胱尿路上皮癌中PTEN蛋白表達(dá)低于正常膀胱組織。這與一些學(xué)者的研究結(jié)果基本相符[12-15]。41例膀胱尿路上皮癌組織中有53.66%（22/41）發(fā)生PTEN基因啟動(dòng)子甲基化改變，而在正常膀胱組織均未發(fā)生甲基化，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這證實(shí)膀胱尿路上皮癌中的確存在PTEN基因啟動(dòng)子的高甲基化改變。

而膀胱癌中PETN基因高甲基化原因是什么呢？目前相關(guān)研究較少，但有學(xué)者對(duì)人直腸癌細(xì)胞系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)阻斷DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNMT1和DNMT3b）會(huì)使整個(gè)基因組甲基化水平下降＞95%，說明DNMT1和DNMT3b共同維持DNA甲基化和基因沉默[16]。該機(jī)制在PTEN基因中是否存在，有待今后進(jìn)一步研究；另外，PTEN高甲基化可能還與飲食、環(huán)境及病毒感染等因素相關(guān)。

KANG[17]和HINO等[18]檢測(cè)66例胃癌組織，發(fā)現(xiàn)其中26例啟動(dòng)子甲基化組織中又有73%（19/26）存在PTEN表達(dá)缺失，認(rèn)為在胃癌中PTEN失活與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者檢測(cè)83例手術(shù)切除的肺癌標(biāo)本組織，發(fā)現(xiàn)肺癌組織中PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率為57.8%（48/83），明顯高于癌旁組織的30.1%（25/83）；肺癌組織中的PTEN mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率為32.5%（27/83），明顯低于癌旁組織的 55.4%（46/83），認(rèn)為肺癌組織中PTEN基因失表達(dá)與其啟動(dòng)子甲基化有關(guān)，可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一[19]。膀胱尿路上皮癌中是否存在類似情況呢？通過分析筆者發(fā)現(xiàn)，與甲基化陰性組的膀胱尿路上皮癌組織相比，22例甲基化陽(yáng)性組的PTEN表達(dá)水平降低。這與KANG等[17]結(jié)果相符，證實(shí)膀胱尿路上皮癌中PTEN表達(dá)降低與其啟動(dòng)子甲基化密切相關(guān)。

在本研究中，膀胱尿路上皮癌中PTEN基因啟動(dòng)子存在高甲基化改變，而且該區(qū)域高甲基化可能會(huì)下調(diào)PTEN蛋白表達(dá)水平，這可能與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這是基因甲基化與腫瘤發(fā)病相關(guān)的又一佐證，也為探討膀胱尿路上皮癌發(fā)生機(jī)制提供新的研究方向，并為今后腫瘤基因靶向治療提供新的靶點(diǎn)，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1]EGGER G S,LIANG G,APARICIO A,et al.Epigenetics in human diseases and prospects for epigenetic therapy[J].Nature,2004,429(6990):457-463.

[2]GOAL A,ARNOLD C N,NIEDZWIECKI D,et al.Frequent inactivation of PTEN by promoter hypermethylation in microsatellite instability-high sporadic colorectal cancers[J].Cancer Res,2004,64(9):3014-3021.

[3]LIU L H,LOU L G.Recent advance in the regulation of PTEN's function[J].Chin Pharmacol Bull,2005,21(7):778-781.

[4]葉章群,曾曉勇.當(dāng)前膀胱癌研究熱點(diǎn)與爭(zhēng)論[J].臨床外科雜志,2009,17(11):723-724.

[5]韓蘇軍.中國(guó)膀胱癌死亡現(xiàn)狀及流行趨勢(shì)分析[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2013(3):228-232.

[6]PECTASIDES D,PECTASIDES M,ECONOMOPOULOS T.Systemic chemotherapy in locally advanced and ormetastatic bladder cancer[J].Cancer Treat Rev,2006,32(6):456-470.

[7]LI J,YEN C,LIAW D,et al.PTEN,a putative protein tyrosine phosphatase genemutated in human brain,breast,and prostate cancer[J].Science,1997,275(5308):1943-1947.

[8]WILHELM C,SKELSEY K,TBUTLER R,et al.Implications of LINE1 methylation for bladder cancer risk in women[J].Clin Cancer Res,2010,16(5):1682-1689.

[9]孫靜哲,楊學(xué)習(xí).抑癌基因甲基化異常在肝癌中的研究進(jìn)展及臨床應(yīng)用[J].廣東醫(yī)學(xué),2011,32(4):519-521.

[10]TAN J,GU Y,ZHANG X,et al.Hypermethylation of CpGislands is more prevalent than hypomethylation across theentire genome in breast carcinogenesis[J].Clin Exp Med,2012,102(38):1-9.

[11]GUO W,DONG Z,CHEN Z,et al.Aberrant CpG island hypermethylation of RASSF1A in gastric cardioadeno carinoma[J].Cancer Invest,2009,27(4):459-465.

[12]畢玉東,王寶森.PTEN和Survivin在膀胱癌中的表達(dá)及臨床意義[J].國(guó)際泌尿系統(tǒng)雜志,2011,32(4):452-455.

[13]AHMAD I,MORTON J P,SINGH L B,et al.Beta-catenin activation synergizes with PTEN loss to cause bladder cancer formation[J].Oncogene,2011,30(2):178-189.

[14]余惠.P16和PTEN在人膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程,2013,21(11):82-83.

[15]金鵬飛,譚操,毛平花,等.PTEN蛋白在膀胱移行細(xì)胞腫瘤中的表達(dá)及臨床意義[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2015,17(1):12-13.

[16]RHEE I,BCAHMAN K E,PARK B,et al.DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J].Nature,2002,416(6880):552-556.

[17]KANG Y H,LEE H S,KIM W H.Promoter methylation and silencing of PTEN in gastric carcinoma[J].Lab Invest,2002,82(3):285-291.

[18]HINO R,UOZAKI H,MURAKAMI N,et al.Activation of DNA methyltransferase 1 by EBV latent membrane protein 2A leads to promoter hypermethylation of PTEN gene in gastric carcinoma[J].Cancer Res,2009,69(7):2766-2774.

[19]鮑振學(xué),劉云云,毛桂玲.PTEN基因甲基化及其表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系[J].河北醫(yī)藥,2013,35(10):1452-1454.

（童穎丹 編輯）

Correlation between expression ofPTENand its promoter methylation in bladder urothelial cell carcinoma*

Yong-hua Yin1,Wen-jie Cheng2,Min-bo Yan2
(1.Department of Urology,Shenzhen Shajing People's Hospital,Guangzhou Medical University,Shenzhen,Guangdong 518104,China;2.Department of Urology,the Fifth Affiliated Hospital,Sun Yat-sen University,Zhuhai,Guangdong 519000,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between expression of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten (PTEN)gene and its promoter methylation in bladder urothelial cell carcinoma(BUCC).MethodsThe protein expression and promoter methylation ofPTENgene were detected in 41 cases of BUCC and 18 normal bladder tissues using Western blot and Methylation Specific PCR (MSP)method respectively,and their correlation was analyzed.ResultsPTEN protein expression in the BUCC was lower than that in the normal bladder tissues (P＜0.05).And the promoter methylation rate ofPTENgene in the BUCC (53.66%,22/41)was significantly higher than that (0.00%,0/18)in the normal bladder tissues (P＜0.05).The expression level of PTEN protein in the BUCC of the methylation negative group was obviously lower than that of the methylation positive group(P＜0.05).ConclusionsThe low expression of PTEN protein in BUCC is closely related with the high methylation ofPTENgene promoter.

bladder urothelial cell carcinoma;phosphate and tension homology deleted on chromsome ten;DNA methylation

R737.14

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.009

1005-8982（2017）12-0046-04

2016-07-15

廣東省深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：JCYJ20140414160300578）

程文杰，E-mail：602676045@qq.com；Tel：18613150560