曠翎，賈曉敏，馮浩，伍博，徐曉芃

[湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）1.皮膚科，2.病理科，湖南 長沙 410005]

脂肪移植治療DNCB誘導(dǎo)ACD模型小鼠的實驗研究*

曠翎1，賈曉敏2，馮浩1，伍博1，徐曉芃1

[湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院（湖南省人民醫(yī)院）1.皮膚科，2.病理科，湖南 長沙 410005]

目的 探究脂肪移植治療2，4-二硝基氯苯（DNCB）誘導(dǎo)變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）模型小鼠的效果及其可能機制。方法采用DNCB復(fù)制ACD小鼠模型，隨機分成A（脂肪移植治療組）、B（假手術(shù)治療組）、C（藥物治療組）、D組（自然修復(fù)組），觀察脂肪移植對ACD小鼠的治療效果。2周后處死小鼠，取背部皮損處全層皮膚組織，蘇木精-伊紅染色法染色觀察各組小鼠皮膚組織病理改變；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測皮損中白介素 10（IL-10）、白介素 17（IL-17）、干擾素 -γ（IFN-γ）的表達。結(jié)果A、C組可以觀察到表皮厚度恢復(fù)正常，角質(zhì)層變??；B、D組無明顯改變。RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)A、C組皮膚組織中IL-10和IL-17 mRNA水平低于D組，IFN-γ mRNA較D組升高（P＜0.05），而B與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論脂肪移植可降低皮損中IL-10和IL-17的表達，促進IFN-γ產(chǎn)生，減輕皮損炎癥。

脂肪移植；變應(yīng)性接觸性皮炎；輔助性T細胞1/輔助性T細胞2；Treg/Th17

變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是由T細胞介導(dǎo)的遲發(fā)型Ⅳ超敏反應(yīng)[1]，臨床表現(xiàn)以皮膚紅斑、丘疹、鱗屑為主要特征[2-3]。其病因復(fù)雜，日常生活中的接觸物均有可能致敏，目前斑貼試驗是診斷該病的主要手段。而脂肪組織傳統(tǒng)觀念認為其只是一種儲能組織，但目前有研究認為脂肪組織是一種具有分泌功能、可分泌多種細胞因子或其他物質(zhì)的內(nèi)分泌器官[4]。因此，本實驗采用脂肪移植對ACD小鼠進行治療，觀察其治療效果并研究其可能的機制，為進一步臨床應(yīng)用提供更可靠的依據(jù)，尋找一種強有效、安全的治療變應(yīng)性接觸性皮炎的新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及藥品

BALB/c雄性小鼠40只，體重20～25 g，由湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物室提供 [使用許可證號：SYXK（湘）2010-0013]。2，4- 二硝基氯苯（2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB）（長沙市安華化學(xué)試劑公司），丙酮（湖南師大化學(xué)試劑廠），鹵米松乳膏（香港澳美制藥廠有限公司），Trizol RNA分離試劑（上海Life Technologies公司），Power SYBR Green PCR Master Mix（上海，Life Technologies公司），超純RNA提取試劑盒（長沙新世紀生物科技有限公司）。

1.2 方法與分組

1.2.1 復(fù)制動物模型 參照文獻[5]復(fù)制小鼠模型：實驗前1天將小鼠腹部剃毛，選取約2cm×2cm備用。實驗第1天（致敏期）用加樣器量取7%DNCB溶液30 μl涂抹于實驗組小鼠腹部剃毛區(qū)激發(fā)致敏，第2和3天進行強化，第7天小鼠背部選取2 cm×3 cm備用，第8天在小鼠背部剪毛區(qū)涂抹1%DNCB溶液30 μl，1次/3 d，共4次。觀察小鼠背部是否出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹、粗糙、增厚、苔蘚化等變應(yīng)性接觸性皮炎的臨床表現(xiàn)。

1.2.2 分組及處理 將模型復(fù)制成功小鼠隨機分A（脂肪移植治療組）、B（假手術(shù)治療組）、C（藥物治療組）、D組（自然修復(fù)組）。每組10只。脂肪取材步驟：BALB/c小鼠經(jīng)腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉（0.01 ml/g）麻醉小鼠，游離出皮下脂肪，置于超凈臺無菌培養(yǎng)皿中。A組：腹腔麻醉小鼠，于背部近頭側(cè)做約1 cm皮膚切口，迅速將脂肪移植于背部皮下，快速止血及縫合傷口；B組：腹腔麻醉小鼠，于背部近頭側(cè)做皮膚約1 cm皮膚切口，迅速止血及縫合傷口；C組：背部外涂鹵米松乳膏1次/d，共2周；D組：不作處理。

1.3 檢測方法

1.3.1 皮膚病理檢查 環(huán)鉆取各組小鼠皮損部位全層皮膚，取小鼠背部左側(cè)1.0 cm×0.5 cm皮膚。隨即放入10%甲醛進行固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，觀察皮膚的組織病理學(xué)變化。

1.3.2 皮膚組織白介素 10（Interleukin-10，IL-10）、白介素 17（Interleukin-17，IL-17）、干擾素 -γ（Interferon-γ，IFN-γ）mRNA表達的測定 環(huán)鉆取各組小鼠皮損部位全層皮膚，取小鼠背部右側(cè)1.0 cm×0.5 cm皮膚。按試劑盒說明書提取組織總RNA；采用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）合成 cDNA。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）：①qRT-PCR 引物序列由上海生工生物工程股份有限公司提供引物合成，選取超高分子量聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE）純化方法（見附表）；②配制反應(yīng)液，混勻后再分裝到qRT-PCR專用96孔板中，各設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)孔；③輕柔混勻，1 000 r/min離心3 min。將96孔板置于Eppendorf qRT-PCR儀上，設(shè)置好程序后開始反應(yīng)。反應(yīng)完成后檢查熔解曲線是否為單一峰，將得到的Ct值按 2-ΔΔCt法進行分析處理，比較 IL-10、IL-17 及IFN-γ轉(zhuǎn)錄水平的變化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

附表 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察皮膚形態(tài)學(xué)

各組第4次激發(fā)24 h后，模型小鼠背部皮損出現(xiàn)發(fā)紅、少許粗糙、增厚、苔蘚化。經(jīng)2周干預(yù)后，A、C組小鼠背部皮膚紅斑、滲出均明顯好轉(zhuǎn)，痂皮脫落，局部可見毛發(fā)生。B、D組無明顯好轉(zhuǎn)。見圖1。

2.2 組織病理改變

組織HE染色后鏡下顯示，A、C組表皮增生及真皮炎癥細胞浸潤較B、D組減輕，表皮細胞內(nèi)及細胞間水腫基本消退，部分小鼠仍可見輕度角化過度；B、D組表皮棘層增生伴細胞內(nèi)水腫及細胞間水腫，真皮內(nèi)較多炎癥細胞浸潤，部分小鼠仍可見表皮糜爛及真皮明顯血管擴張充血。見圖2、3。

2.3 各組IL-10、IL-17、IFN-γ mRNA水平比較

為表達各組mRNA水平差異，將D組IL-10、IL-17、IFN-γ mRNA表達水平標準化為1[6-7]。各組小鼠皮膚組織的IL-10 mRNA表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=98.380，P=0.000），各組兩兩比較，經(jīng)SNK-q檢驗，結(jié)果表明，A組IL-10 mRNA表達水平較D組降低（P＜0.05）；C組IL-10 mRNA表達水平較D組降低（P＜0.05）。見圖4。

各組小鼠皮膚組織IL-17 mRNA表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=407.604，P=0.000），各組兩兩比較，經(jīng)SNK-q檢驗，結(jié)果表明：A組IL-17 mRNA表達水平較D組降低（P＜0.05）；C組IL-17 mRNA表達水平較D組降低（P＜0.05）。見圖5。

各組小鼠皮膚組織的IFN-γ mRNA表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1073.221，P=0.000），各組兩兩比較，經(jīng)SNK-q檢驗，結(jié)果表明，A組IFN-γ mRNA表達水平較D組升高（P＜0.05）；C組IFN-γ mRNA表達水平較D組升高（P＜0.05）。見圖6。

圖1 實驗小鼠皮膚形態(tài)

圖2 小鼠皮膚組織病理改變 （HE染色×100）

圖3 小鼠皮膚組織病理改變 （HE染色×400）

圖4 各組皮膚組織IL-10 mRNA表達水平比較 （±s）

圖5 各組皮膚組織IL-17 mRNA表達水平比較 （±s）

圖6 各組皮膚組織IFN-γ mRNA表達水平比較 （±s）

3 討論

變應(yīng)性接觸性皮炎是一種細胞介導(dǎo)的超敏反應(yīng)，其免疫學(xué)發(fā)病機制中輔助性T細胞1（helper T cells 1，Th1）和輔助性T細胞2（helper T cells 2，Th2）亞群及其相互間的作用失衡是最為關(guān)鍵的。Thl細胞通常分泌白介素2（Interleukin-2，IL-2）和IFN-γ，而不產(chǎn)生白介素 4（Interleukin-4，IL-4）、白介素 5（Interleukin-5，IL-5）、白介素 6（Interleukin-6，IL-6）及 IL-10；Th2 細胞則主要分泌 IL-4、IL-5、IL-6 及IL-10，而不分泌IL-2和IFN-γ。IFN-γ可以活化巨噬細胞，繼而分泌多種炎癥介質(zhì)[8-9]。國內(nèi)外研究認為，ACD的發(fā)病機制并不局限在Thl/Th2分化失衡理論，研究提示機體還存在新的T細胞亞型——Th17和Treg細胞。Treg細胞是近年發(fā)現(xiàn)的新CD4+T淋巴細胞亞群，具有免疫抑制性，并且抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在機體免疫耐受中發(fā)揮重要作用[10]。Th17細胞主要分泌IL-17等細胞因子，引發(fā)局部或全身的炎癥反應(yīng)[11]。最新研究表明，IL-17可促進ACD病情的發(fā)展[12-13]。此外，Th17在分化和功能上能夠與Treg相互轉(zhuǎn)化，F(xiàn)oxp3+Treg細胞通過直接或者間接的方式對Th17細胞進行拮抗，發(fā)揮抗炎和抑制免疫反應(yīng)的作用。所以在ACD發(fā)病機制中Th17扮演著重要角色。自然調(diào)節(jié)性T細胞主要為CD4+CD25+Treg，F(xiàn)oxp3稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子，其特異性表達于CD4+CD25+T淋巴細胞上，是Treg細胞發(fā)生、發(fā)育，以及發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素；同時CD4+ICOS+Foxp3+T細胞也是所有CD4+T細胞中分泌IL-10最多的細胞亞群，IL-10屬于細胞因子中的干擾素家族，普遍認為是一種抗炎癥因子[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，ACD皮損中IL-10表達增高，推測IL-10可能是ACD發(fā)病的一個重要因素。

最新觀點認為，脂肪組織不僅是一種儲能組織，同時也是一種具有分泌功能、可分泌多種細胞因子或激素的內(nèi)分泌器官，脂肪組織可參與人體的各種反應(yīng)活動[15]。研究表明，脂肪組織具有的分泌和調(diào)節(jié)免疫功能源于其含有的脂肪干細胞[脂肪組織中有約100 000個脂肪源性干細胞（adipose derived stromal cells，ADSCs）/g]，ADSCs有免疫調(diào)節(jié)作用[16]。許多研究表明，ADSCs能改善多發(fā)性肌病、紅斑狼瘡等自身免疫性疾病的病情[17]。最新研究表明，通過自體脂肪移植形成ADSCs的免疫調(diào)節(jié)作用，能使Th2細胞向Th1細胞分化，改善Thl/Th2分化失衡[18-19]，并通過促進Foxp3+Treg的生成，從而進一步調(diào)控Treg/Th17細胞的平衡，來控制免疫反應(yīng)[20]。

本實驗結(jié)果顯示，A、C組比D組角質(zhì)層變薄，表皮厚度恢復(fù)正常，B、D組則無明顯改變。在脂肪移植治療ACD樣小鼠模型中，A組小鼠皮膚中Treg細胞因子IL-10 mRNA和Th17細胞因子IL-17 mRNA表達減少，而Th1細胞因子IFN-γ mRNA表達增多，提示脂肪移植對 Th1、Th2、Th17、Treg可能具有多重調(diào)節(jié)作用。實驗結(jié)果表明，脂肪移植可通過調(diào)控Th1/Th2，Treg/Th17的平衡來控制ACD病情。但本實驗仍存在不足，其具體調(diào)控機制等問題還需進一步研究。

參 考 文 獻：

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（童穎丹 編輯）

Research on fat transplantation treatment for DNCB-sensitized allergic contact dermatitis of mouse model*

Ling Kuang1,Xiao-min Jia2,Hao Feng1,Bo Wu1,Xiao-peng Xu1
[1.Department of Dermatology,2.Department of Pathology,the First Affiliated Hospital of Hunan Normal University(Hunan Provincial People's Hospital),Changsha,Hunan 410005,China]

ObjectiveTo explore whether fat transplantation can improve the symptoms of the mouse model of allergic contact dermatitis (ACD)induced by dinitrochlorobenzene (DNCB)as well as its possible mechanism.MethodsACD mouse models were randomly divided into group A (fat transplantation group),group B(pseudo surgery group),group C(medication group)and group D(spontaneously-recovered model group).The HE-stained skin tissues of each group were observed under light microscope.The expression levels of IL-10,IL-17 and IFN-γ mRNAs in the skin lesions were detected by qRT-PCR.ResultsIn the groups A and C,the horny layers became thinner,and the thickness of epidermis recovered to normal while there were no overt changes in the groups B and D.The expression levels of IL-10 and IL-17 mRNAs in the skin tissues of the groups A and C were clearly lower than those of the group D,the level of IFN-γ mRNA was higher than that of the group D(P＜0.05);however,there was no significant changes in the IL-10,IL-17 or IFN-γ mRNA level between the groups B and D.ConclusionsFat transplantation can decrease the expression levels of IL-10 and IL-17 in skin lesions,promote the production of IFN-γ,reduce the symptoms of skin lesions and promote the recovery of skin lesions in the mouse model.

fat transplantation;allergic contact dermatitis;Th1/Th2;Treg/Th17

R758.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.005

1005-8982（2017）12-0025-05

2016-07-15

湖南省教育廳優(yōu)秀青年項目（No：15B139）；湖南省衛(wèi)生計生委項目（No：C2017035）

馮浩，E-mail：doctorfenghao@126.com