汪明振，邱成志，余外市，王春曉，郭延塔

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 普外科，福建 泉州 362000）

GPP34激活結腸癌細胞Wnt信號通路促進癌細胞增殖的研究*

汪明振，邱成志，余外市，王春曉，郭延塔

（福建醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 普外科，福建 泉州 362000）

目的 探討人結腸癌細胞中高爾基相關蛋白34（GPP34）基因高表達，激活經(jīng)典Wnt信號通路，促進癌細胞增殖的機制。方法將SW620結腸癌細胞株分為4組：對照組、siRNA轉染組、Tricinbine組及TWS119組，分別培養(yǎng)；逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測結腸癌細胞轉染后的沉默效果；分別用Topflash報告基因活性法、噻唑藍（MTT）、流式細胞技術檢測各組癌細胞Wnt信號通路活性、生長抑制率、細胞凋亡率；Western blot檢測各組結腸癌細胞中GPP34、β-catenin、pS9-糖原合酶激酶-3β（pS9-GSK-3β）蛋白的表達。結果轉染siRNA后，沉默結腸癌細胞GPP34表達效果佳；與對照組比較，各實驗組癌細胞的生長抑制率和凋亡率升高，且Wnt信號通路活性抑制。Western blot檢測結果顯示，siRNA-GPP34組GPP34蛋白表達下降，其余兩組GPP34蛋白表達比較，差異無統(tǒng)計學意義；siRNA轉染組、Tricinbine組和TWS119組的β-catenin和pS9-GSK3β蛋白表達降低。結論SW620結腸癌細胞中GPP34基因的高表達可通過激活經(jīng)典Wnt細胞信號通路，促進癌細胞增殖并抑制其凋亡。

人結腸癌細胞；高爾基相關蛋白34；Wnt信號通路；增殖；糖原合酶激酶-3β；β-catenin

1 材料與方法

1.1 主要試劑

siRNA靶向GPP34（GCUUGCUUAAUCATGGTT AT）由上海吉瑪公司設計合成，逆轉錄酶購于立陶宛Fermentus公司，SYBR Ex Taq試劑盒購于日本TaKaRa公司。噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、Tricinbine購于美國Sigma公司，Annexin-V檢測試劑盒購于美國Becton Dickinson公司，螢火蟲熒光素酶底物及海腎熒光素酶底物購于南京碧云天公司，TWS119購于美國Santa cruz公司，兔抗人GPP34多克隆抗體購于英國Abcam公司，兔抗人pS9-糖原合酶激酶-3β（pS9-glycogen synthasc kinase-3β，pS9-GSK-3β）單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司，β-catenin、β-actin、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購于美國Santa cruz公司。

1.2 細胞系及細胞培養(yǎng)

人結腸癌細胞株SW620購于中科院上海細胞所。將人結腸癌細胞SW620培養(yǎng)在RPMI Medium 1640+10%胎牛血清（fetal calf serum，F(xiàn)BS）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳CO2+95%空氣的飽和濕度環(huán)境的細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組 將結腸癌細胞株SW620進行實驗分組，接種細胞于6孔板，并將其分為4組：對照組 [等量磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）]、siRNA轉染組（轉染組采用脂質(zhì)體法，參照說明書用50 nmol siRNA轉染SW620細胞）、Tricinbine組（加 Akt抑制劑 50 nmol）、TWS119組（加GSK-3β抑制劑50 nmol），繼續(xù)培養(yǎng)各組細胞。

1.3.2 逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測轉染組沉默效果 用Trizol裂解法提取轉染組結腸癌細胞株總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，進行RT-PCR反應。反應條件：95℃預變性 20 s；95℃變性 10 s，60℃退火 20 s，72℃延伸20 s，共循環(huán)45次，在退火階段檢測熒光；熔解曲線條件為50℃預熱15 s，51℃升溫至99℃，每升高1℃停留5 s。GPP34正向引物：5'-AGGGCGA CTCCAAGGAAA-3'；反向引物：5'-TGATGTGTAACC CTCGCG-3'，產(chǎn)物長度83 bp；聚合酶鏈反應引物由上海吉瑪公司所設計，使用GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)分析通過相對定量ΔCt法進行。

當學生面對問題束手無策時，教師要采取有效的方式，激活學生已有的數(shù)學活動經(jīng)驗，使學生的學習基于經(jīng)驗而又超越經(jīng)驗，完善數(shù)學活動經(jīng)驗。

1.3.3 Topflash報告基因活性法檢測Wnt信號通路活性 棄培養(yǎng)液，用PBS緩沖液洗1次，加入100 μl Harvest buffer作用10 min后裂解細胞，輕輕吸取其中40 μl置于離心管中，加入20 μl螢火蟲熒光素酶底物或海腎熒光素酶底物。渦旋混勻后即刻用光度計檢測每孔中螢火蟲熒光值及海腎熒光值，兩者的比值 [相對光單位值（relative luminescence units value，RLU）]即指示細胞內(nèi)Wnt信號通路中核內(nèi)轉錄因子 T 細胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴樣增強因子（lymphoid enhancing factor，LEF）的激活水平。

1.3.4 MTT法檢測各組SW620結腸癌細胞的生長抑制率 各組細胞經(jīng)胰酶消化后，接種于96孔板，加100 μl（1×105個細胞）/孔，貼壁培養(yǎng)24 h后，每組設4個復孔及對照孔，對照孔僅加入細胞不做處理。培養(yǎng) 48 h后，加5 mg/ml MTT 10 μl/孔培養(yǎng) 4 h，棄培養(yǎng)液。每孔加二甲基亞砜（Dimethyl Sulphoxide，DMSO）150 μl，避光振蕩混勻，結晶溶解后用酶標儀檢測波長490 nm吸光度A值。計算公式：癌細胞生長抑制率=（1-處理組平均光密度（optical delnsity，OD）490值/對照組平均OD490值）×100%。

1.3.5 流式細胞技術Annexin V-FITC/PI法檢測各組細胞株的凋亡率 重懸各組細胞后取5～10萬重懸的沉淀細胞，加入200 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入10 μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育10～20 min，置于冰浴中。隨即進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶為紅色熒光。

1.3.6 Western blot檢測各組蛋白表達 收集處于對數(shù)生長期的各組細胞進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，然后濕轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封閉60 min后分別加入一抗GPP34、pS9-GSK-3β、βcatenin、β-actin，4℃孵育過夜；三羥甲基氨基磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline and tween 20，PBST）漂洗20 min/次，共3次；加入相應的辣根過氧化物酶標記的二抗溶液，室溫孵育1h；PBST漂洗10 min/次，共3次；增強化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑檢測。圖像應用Image J軟件進行灰度分析，目的蛋白表達的相對強度=目的條帶的灰度值/β-actin條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，各實驗組與對照組比較用Dunnett-t檢驗，實驗組兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SW620結腸癌細胞siRNA轉染效果

SW620結腸癌細胞培養(yǎng)良好，對照組GPP34 mRNA的相對表達量為（1.000±0.092），siRNA轉染組GPP34 mRNA的相對表達量為（0.236±0.076），經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.57，P=0.005）。轉染組GPP34 mRNA的相對表達量低于對照組，轉染效果佳。見圖1。

圖1 SW620結腸癌細胞 （×100）

2.2 各組癌細胞Wnt信號通路的活性

對照組、siRNA轉染組、Tricinbine組及TWS119組SW620癌細胞的相對熒光素酶活性，即RLU值分別為（1.000±0.164） 與（0.342±0.061）、（0.359±0.125）和（0.365±0.155）。各組 RLU 值比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=17.812，P=0.001）。各實驗組分別與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各實驗組RLU值低于對照組，表明抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可降低SW620結腸癌細胞的Wnt信號通道活性，且各實驗組間RLU值兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 2。

圖2 各組SW620結腸癌細胞的Wnt信號通路活性比較（±s）

2.3 各組SW620結腸癌細胞生長抑制率比較

MTT法檢測顯示，對照組、siRNA轉染組、Tricinbine組及TWS119組的癌細胞相對OD490值分別為 （1.000±0.147）、（0.401±0.010）、（0.434±0.116）和（0.487±0.077），siRNA 轉染組、Tricinbine組及TWS119組生長抑制率分別為59.9%、56.6%和51.3%。各組生長抑制率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=13.101，P=0.002）。各實驗組分別與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各實驗組生長抑制率低于對照組，說明抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可抑制SW620結腸癌細胞增殖。各實驗組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 各組SW620結腸癌細胞相對OD490值比較（±s）

2.4 各組SW620結腸癌細胞凋亡率比較

流式細胞儀Annexin V法檢測各組細胞的凋亡率，對照組、siRNA轉染組、Tricinbine組及TWS119組SW620癌細胞的凋亡率分別為（1.680±0.576）%、（52.467±4.373）%、（46.167±5.293）%和（50.167±6.506）%。各組凋亡率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=77.610，P=0.000）。各實驗組分別與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各實驗組癌細胞的凋亡率較對照組提高，提示抑制GSK-3β、Akt活性及沉默GPP34均可促進癌細胞凋亡。且各實驗組間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖 4、5。

圖4 各組SW620結腸癌細胞的凋亡情況

圖5 各組SW620結腸癌細胞凋亡率比較

2.5 β-catenin、pS9-GSK-3β及 GPP34蛋白的表達

各組的 GPP34、pS9-GSK-3β、β-catenin蛋白相對表達量比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（F=125.479、22.787 和 132.135，均P=0.000）。各實驗組蛋白相對表達量與對照組比較，經(jīng)Dunnett-t檢驗結果：①在GPP34蛋白檢測中，siRNA-GPP34組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），siRNA轉染組的GPP34蛋白相對表達量低于對照組；其余兩組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），沉默效果良好；②3個實驗組中β-catenin和pS9-GSK-3β蛋白相對表達量分別與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。各實驗組間蛋白相對表達量兩兩比較，經(jīng)SNK-q檢驗結果：①GPP34蛋白：Tricinbine組、TWS119組與siRNA-GPP34組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 Tricinbine組與 TWS119組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；②β-catenin蛋白：siRNA-GPP34組、Tricinbine組與TWS119組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 siRNA-GPP34組與Tricinbine組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；③pS9-GSK-3β蛋白表達在各實驗組間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見附表和圖 6、7。

附表 各組蛋白的相對表達量比較 （±s）

附表 各組蛋白的相對表達量比較 （±s）

注：t1、P1：對照組 vs siRNA 轉染組；t2、P2：對照組 vs Tricinbine 組；t3、P3：對照組 vs TWS119 組；q1：Tricinbine組 vs TWS119 組；q2：siRNA轉染組 vs TWS119組；q3：siRNA轉染組 vs Tricinbine組

組別β-catenin對照組 1.000±0.015 1.000±0.194 1.000±0.088 siRNA轉染組 0.260±0.008 0.280±0.043 0.182±0.010 Tricinbine組 0.906±0.006 0.208±0.065 0.192±0.073 TWS119組 0.983±0.078 0.371±0.160 0.362±0.018 t1值 73.138 2.272 0.316P1值 0.000 0.053 0.762 t2值 6.272 6.703 4.324P2值 0.003 0.003 0.012 t3值 16.006 12.210 12.313P3值 0.000 0.000 0.000 q1值 1.491 1.948 32.553 q2值 14.151 1.080 32.842 q3值 12.655 0.872 0.289 GPP34pS9-GSK-3β

圖6 GPP34、pS9-GSK-3β及β-catenin蛋白的表達

圖7 各實驗組GPP34、pS9-GSK-3β及β-catenin蛋白相對表達量比較

3 討論

近來研究表明，GPP34基因可促進癌細胞的生長、增殖并抑制凋亡，是一種新的原癌基因[6-7]。在胃癌[8]、肝癌等[9]多種癌組織中存在GPP34表達明顯上調(diào)，且與細胞分化差、淋巴結轉移、分期晚、惡性程度高呈正相關。目前研究表明，GPP34高表達可通過雷帕霉素靶蛋白的復合體（mammalian target of rapamycin complex，mTORC）1 和 mTORC2底物磷酸化激活mTOR信號通路，加速細胞增殖分裂[7]，但是否存在激活其它細胞內(nèi)信號通路，未見文獻報道。因此，在筆者前期研究基礎上，采用沉默GPP34基因方法進一步探討GPP34高表達激活經(jīng)典Wnt信號通路的機制。

經(jīng)典Wnt信號通路激活后可抑制降解復合體（由GSK-3β、結直腸腺瘤性息肉蛋白、軸蛋白等蛋白組成）中關鍵活性成分GSK-3β的磷酸化，使βcatenin避免被泛素蛋白酶體識別和降解，并與轉錄因子TCF/LEF結合而導致細胞增殖的異常，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。已有研究證實，結腸癌等腫瘤細胞中Wnt信號通路存在過度激活，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切，可能成為結腸癌的防治的新途徑[12-13]。本實驗首次顯示沉默GPP34基因表達可降低經(jīng)典Wnt信號通路活性，提示GPP34的高表達可激活SW620結腸癌細胞經(jīng)典Wnt信號通路，促進細胞增殖并抑制凋亡。

GPP34高表達可增強表皮生長因子引起的核糖體S6激酶表達水平升高，同時可通過Ser473磷酸化激活Akt，Akt激活后的作用底物包括mTOR和GSK-3β等，GSK-3β是經(jīng)典Wnt信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子，其磷酸化后可通過對β-catenin的影響參與細胞增殖、凋亡的調(diào)控[14]。本實驗顯示，沉默GPP34基因表達、阻斷Akt或GSK-3β位點后β-catenin和pS9-GSK-3β蛋白表達均降低，SW620結腸癌細胞增殖和Wnt信號通路活性受到抑制，細胞凋亡增加，提示GPP34的高表達可上調(diào)pS9-GSK-3β和βcatenin蛋白表達，因此筆者推斷GPP34高表達可通過Akt/GSK-3β激活Wnt信號通路，促進結腸癌細胞的增殖。

綜上所述，SW620結腸癌細胞中GPP34基因的高表達可激活經(jīng)典Wnt細胞信號通路促進癌細胞增殖，抑制凋亡，其機制可能是通過激活Akt，進一步通過GSK-3β介導Wnt細胞信號通路的激活。GPP34可作為結腸癌靶向治療的潛在新靶點。

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（童穎丹 編輯）

GPP34 promotes colon cancer cell proliferation through activation of Wnt signaling pathway*

Ming-zhen Wang,Cheng-zhi Qiu,Wai-shi Yu,Chun-xiao Wang,Yan-ta Guo
(Department of General Surgery,the Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Quanzhou,Fujian 362000,China)

ObjectiveTo investigate the mechanism of high-expression of Golgi-associated protein of 34(GPP34)gene in activation of Wnt signaling pathway to promote colon cancer cell proliferation.Methods Colon cancer cell lines were divided into four groups:control group,siRNA transfection group,the group of added inhibitor of Akt/Protein Kinase B (Tricinbine group),and the group of added inhibitor of GSK-3β(TWS119 group).The cells were cultured respectively.The silencing effect ofGPP34gene was detected by RT-PCR.The proliferation and apoptosis of the cancer cells in all groups were detected by MTT and flow cytometry respectively.Topflash reporter gene activity assay was used to detect the activity of Wnt signaling pathway in the cancer cells of each group.The expressions of GPP34,β-catenin and pS9-GSK-3β proteins in the cancer cells of all groups were detected by Western blot.ResultsThe expression level ofGPP34mRNA in the transfection group was significantly lower than that in the control group (P＜0.05).Compared to the control group,the growth inhibition rate and the apoptosis rate were significantly increased(P＜0.05),and the activity of Wnt signaling pathway was significantly inhibited in each experimental group (P＜0.05).However,the growth inhibition rate,the apoptosis rate and the activity of Wnt signaling pathway showed no significant differences among the experimental groups(P＞0.05).Compared to the control group,GPP34 protein expressionsignificantly decreased in the siRNA transfection group (P＜0.05),while that in the other two experimental groups had no significant difference(P＞0.05);β-catenin and pS9-GSK-3β protein expressions were significantly decreased in the three experimental groups(P＜0.05).ConclusionsHigh-expression of GPP34 can activate the classical Wnt signaling pathway to promote proliferation and inhibit apoptosis of SW620 colon cancer cells.

human colorectal cancer cell line;GPP34;Wnt signaling pathway;proliferation;glycogen synthase kinase-3β;β-catenin

R735.35

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.003

1005-8982（2017）12-0015-06

2016-08-18

福建省自然科學基金（No：2015J01438）；福建醫(yī)科大學校教授基金（No：JS14028）

邱成志，E-mail：qchengzhi@sohu.com