張蕊，袁發(fā)璐，李婷，彭芳

（大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000）

基礎(chǔ)研究·論著

美洲大蠊提取物對人肝癌HepG2細胞的作用機制研究*

張蕊，袁發(fā)璐，李婷，彭芳

（大理大學(xué) 藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南 大理 671000）

目的 探討美洲大蠊提取物體外對肝癌（HCC）HepG2細胞增殖、遷移能力，以及細胞中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白表達的影響。方法噻唑藍（MTT）法檢測細胞增殖；劃痕實驗檢測美洲大蠊提取物對HCC細胞遷移能力的影響；免疫細胞染色法、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測美洲大蠊提取物對細胞中VEGF蛋白表達的影響。結(jié)果MTT和劃痕實驗結(jié)果表明，美洲大蠊多肽、CⅡ-3和脫脂膏能抑制人HCC HepG2細胞的增殖和遷移，且呈時間、劑量依賴關(guān)系；免疫細胞化學(xué)染色法和ELISA法結(jié)果顯示，美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脫脂膏能下調(diào)人HCC HepG2細胞中VEGF蛋白的表達。結(jié)論美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脫脂膏能抑制人HCC HepG2細胞增殖和遷移，同時能降低HepG2細胞中VEGF蛋白的表達，且美洲大蠊多肽的作用優(yōu)于CⅡ-3和脫脂膏。

美洲大蠊多肽；HepG2細胞；增殖和遷移；VEGF表達

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上 第7種常見的惡性腫瘤，居全球癌癥病死率的第3位，惡性程度高，復(fù)發(fā)率高，易轉(zhuǎn)移[1-2]。目前，越來越多的研究集中探討HCC微環(huán)境的組成，以及對HCC發(fā)生、發(fā)展的作用[3]。

美洲大蠊為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱蟑螂[4]。本研究用美洲大蠊多肽（periplaneta americana polypeptide，PAP）PAP-1、PAP-2、PAP-3，以及抗腫瘤活性物質(zhì)CⅡ-3和脫脂膏為實驗用藥，觀察并比較美洲大蠊3個多肽和2個活性物質(zhì)對人肝癌HepG2細胞的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

美洲大蠊多肽1、2和3（大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院），美洲大蠊CⅡ-3（黃褐色凍干粉末）和美洲大蠊脫脂膏（褐色黏稠膏狀）（大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院張成桂博士提供），人肝癌HepG2細胞株（上海海博全爾生物科技有限公司），改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胎牛血清、胰蛋白酶購自澳大利亞Gibco公司，青霉素鏈霉素混合液（美國Millipore公司），二甲亞砜、噻唑藍[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]、沙利度胺購自美國Sigma公司，一抗血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和兔IgG免疫組織化學(xué)法試劑盒（武漢博士德生物有限公司），人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗 （enzymelinked immunosorbentassay，ELISA）試劑盒（深圳欣博盛生物科技有限公司），醫(yī)用潔凈工作臺和二級生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），二氧化碳CO2培養(yǎng)箱（美國Nuaire公司），倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3母液的配制 美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3均用注射用水配置成濃度為1 mg/ml的母液，4℃保存。實驗時用培養(yǎng)基將藥物母液稀釋至所需濃度即可。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細胞株采用含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗[5-6]。

1.2.3 MTT法檢測用藥后人肝癌細胞HepG2存活率 HepG2細胞（1×105個 /ml，100μl）接種于 96孔板，培養(yǎng)24 h。用濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00和 100.00 μg/ml的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏進行干預(yù)，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，200μl/孔，同時設(shè)置200 μg/ml沙利度胺組和對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm處檢測各孔吸光度值（Absozbance，A）。按以下公式計算細胞抑制率：細胞抑制率（inhibition rate，IR）（%）=[1-A加藥組/A對照組]×100%[7-8]。

1.2.4 細胞劃痕實驗 分為對照組，沙利度胺組，美洲大蠊PAP-1、PAP-2、PAP-3組，CⅡ-3組，以及脫脂膏低、中、高劑量組（分別為 25、50 和 100μg/ml）[9-10]。HepG2細胞常規(guī)消化，按2×105個/ml的密度接種于6孔板，2 ml/孔。培養(yǎng)24 h后，用200μl槍頭在6孔板底部劃一條直線，磷酸鹽緩沖溶液洗滌2、3次，按實驗分組加入藥物。分別對0和24 h的劃痕進行拍照，并測量劃痕寬度。以上實驗重復(fù)3次，取平均值計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.5 免疫細胞染色法 實驗分組同1.2.4。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，常規(guī)消化制備單細胞懸液，按2×105個/孔的密度接種于放有細胞爬片的6孔板中，2 ml/孔。培養(yǎng)24 h后，根據(jù)實驗分組分別加入不同劑量的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。按照免疫組織化學(xué)法步驟和試劑盒說明書進行實驗，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6 ELISA實驗 HepG2細胞常規(guī)消化，以1×105個/ml的密度接種于96孔板，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，按1.2.4中實驗分組加入不同濃度的藥物，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，200μl/孔。同時設(shè)置空白對照組和陽性對照組。分別培養(yǎng)24和48 h后收集細胞上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清，置于-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。按照ELISA試劑盒說明書進行實驗，酶標儀檢測450 nm處各孔光密度（optical delnsity，OD）值。以標準品的濃度為縱坐標，OD值為橫坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線對應(yīng)的OD值，即可算出樣品VEGF的濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件和Origin Pro 8.6作圖軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 美洲大蠊多肽提取物對人肝癌HepG2細胞增殖的影響

各組培養(yǎng)24、48和72 h的細胞抑制率比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點測量的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4247.101，P=0.000）；②不同藥物處理后的抑制率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2460.773，P=0.000）；③各組的細胞抑制率變化趨勢有差異（F=85.030，P=0.000）。從用藥濃度看，同一時間的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏對HepG2細胞增殖的抑制率呈濃度依賴性。200μg/ml沙利度胺對HepG2細胞的增殖抑制率亦呈時間依賴關(guān)系，其中以72 h抑制率為最高。各藥物間作用比較，美洲大蠊3個多肽抑制HepG2細胞增殖的作用優(yōu)于脫脂膏和CⅡ-3，其中多肽PAP-2抑制效果最好，而脫脂膏的作用又優(yōu)于CⅡ-3。見表1和圖1～3。

表1 美洲大蠊提取物對HepG2細胞增殖的影響 （n=3）

續(xù)表1

圖1 美洲大蠊提取物干預(yù)24 h對HepG2細胞增殖的抑制作用

圖2 美洲大蠊提取物干預(yù)48 h對HepG2細胞增殖的抑制作用

圖3 美洲大蠊提取物干預(yù)72 h對HepG2細胞增殖的抑制作用

2.2 美洲大蠊提取物對HepG2細胞的遷移抑制作用

各組劃痕愈合率比較，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=433.771，P=0.000）。與對照組、沙利度胺組比較，經(jīng)過 PAP-1、PAP-2、PAP-3、CⅡ-3及脫脂膏處理后，HepG2細胞的劃痕愈合率降低，并且隨著濃度增加，劃痕愈合率逐漸降低，抑制細胞遷移具有濃度依賴性。見表2。

另外各藥物對HepG2細胞遷移抑制作用比較，美洲大蠊多肽PAP-3的作用優(yōu)于PAP-1、PAP-2、CⅡ-3及脫脂膏，而脫脂膏的作用好于PAP-1、PAP-2及CⅡ-3。見圖4。

劃痕24 h后，各組HepG2細胞發(fā)生明顯遷移，劃痕區(qū)域與0 h相比變窄，說明細胞HepG2細胞在劃痕后能自動愈合。然而，在經(jīng)過不同劑量的美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏及200μg/ml沙利度胺干預(yù)24 h后，HepG2細胞的遷移距離均縮小，劃痕愈合率逐漸降低。見圖5。

2.3 美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏對VEGF蛋白表達的影響

免疫細胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，VEGF的表達存在于HepG2細胞質(zhì)中，棕色為VEGF蛋白表達，顏色深淺代表蛋白表達量的多少。未加藥的對照組染色較深，呈現(xiàn)深棕色顆粒，表明VEGF蛋白表達高。美洲大蠊多肽、CⅡ-3、脫脂膏作用后，VEGF的表達出現(xiàn)下調(diào)。且美洲大蠊多肽濃度越高，VEGF蛋白表達越少。而隨著CⅡ-3和脫脂膏濃度的升高，VEGF表達增多。見圖6。

2.4 美洲大蠊提取物干預(yù)后HepG2細胞上清液中VEGF含量比較

各組培養(yǎng)24和48 h后VEGF含量比較，采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，結(jié)果：①不同時間點VEGF含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4773.712，P=0.000）；②不同藥物處理后的VEGF含量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.148，P=0.000）；③各組的細胞抑制率變化趨勢有差異（F=4.917，P=0.001）。與對照組比較，美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及PAP-3作用24 h后，HepG2細胞上清液中VEGF含量降低，且呈濃度依賴性。低劑量和中劑量美洲大蠊CⅡ-3對HepG2細胞上清液中VEGF的表達無明顯作用，而高劑量CⅡ-3促進VEGF的表達。低劑量和中劑量脫脂膏對VEGF的表達有下調(diào)作用，但隨著濃度升高，VEGF的表達反而增多。各藥物作用比較，美洲大蠊3個多肽下調(diào)VEGF含量的作用優(yōu)于脫脂膏和CⅡ-3，其中多

表2 美洲大蠊多肽提取物對HepG2細胞遷移的影響（n=3）

圖4 美洲大蠊提取物對HepG2細胞劃痕愈合率的作用比較

圖5 美洲大蠊提取物干預(yù)后HepG2細胞劃痕愈合情況 （×40）

圖6 美洲大蠊多肽提取物對HepG2細胞中VEGF蛋白表達的影響 （×200）

表3 美洲大蠊提取物干預(yù)后HepG2細胞中VEGF的含量比較 （n=3）

3 討論

VEGF是一種特異性血管生長因子。有研究顯示，其與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)[11]。HCC屬于典型的多血管實體瘤，其發(fā)生、發(fā)展過程與腫瘤血管生成密切相關(guān)。實體腫瘤長至直徑2 mm后，后續(xù)的生長、轉(zhuǎn)移及侵襲都需要新生血管生長提供營養(yǎng)[12]。有研究顯示，美洲大蠊脫脂膏和CⅡ-3對多種人腫瘤細胞都有較好的抑制作用[13-19]。此外，CⅡ-3體內(nèi)用藥也有抑制多種腫瘤的作用[20-22]。美洲大蠊多肽為美洲大蠊抗腫瘤部位CⅡ-3的基本組分。

具有Arg-Gly-Asp肽特征的PAP-1和PAP-2呈現(xiàn)出抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）中 MMP-2 活性，以及明顯抑制內(nèi)皮肽PAP-3效果最好，而脫脂膏的作用又優(yōu)于CⅡ-3。見表3和圖7。

圖7 美洲大蠊提取物干預(yù)24和48 h后HepG2細胞上清液中VEGF含量的變化

隨著時間延長，作用48 h后，各組HepG2細胞上清液中VEGF含量增多，但是經(jīng)過美洲大蠊多肽PAP-1、PAP-2及 PAP-3作用后，VEGF的含量下降。而CⅡ-3和脫脂膏作用后，VEGF的含量在一定程度上增加。細胞VEGF表達量的活性。大量研究表明，Arg-Gly-Asp肽具有抑制細胞黏附與遷移、誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤血管生成的能力[23-26]。多肽分子PAP-3具有N-糖基化的特征，能提高荷瘤小鼠淋巴細胞增殖和增強IL-2分泌量。因此本實驗選多肽PAP-1、PAP-2和PAP-3為主要實驗用藥。

本實驗從細胞增殖開始，觀察美洲大蠊多肽、CⅡ-3及脫脂膏對肝癌HepG2細胞的作用。結(jié)果表明，美洲大蠊多肽 PAP-1、PAP-2、PAP-3，CⅡ-3 及脫脂膏均能抑制HepG2細胞的增殖和遷移，且呈劑量、時間依賴關(guān)系，其中PAP-2增殖作用較優(yōu)，PAP-3遷移效果較優(yōu)；此外還能下調(diào)HepG2細胞中VEGF的表達，呈劑量依賴性，但隨著時間延長，細胞數(shù)目增多，VEGF表達也增多，其中PAP-3效果較優(yōu)。各部分實驗結(jié)果綜合表明，美洲大蠊多肽對HepG2細胞作用效果好于CⅡ-3和脫脂膏，3個多肽中PAP-3效果較好。該結(jié)果與實驗預(yù)期相符，脫脂膏和CⅡ-3為美洲大蠊粗提物，成分與結(jié)構(gòu)不明確，對肝癌細胞的作用是多種成分共同作用，而多肽是從CⅡ-3中提取得到的一系列明確的肽類分子，成分相對單一，其對肝癌細胞的作用可聯(lián)系其系列分析。該結(jié)論為本課題組后續(xù)將多肽應(yīng)用于動物體內(nèi)實驗或其他腫瘤細胞實驗的相關(guān)研究提供有力的支持，也為作用機制的研究提供新的思路，同時為多肽類藥物應(yīng)用于腫瘤治療提供新的可能性。

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（童穎丹 編輯）

Effect ofPeriplaneta Aamericanaextracts on HepG2 cells*

Rui Zhang,Fa-lu Yuan,Ting Li,Fang Peng
(College of Pharmacy and Chemistry,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China)

ObjectiveTo investigate the effect of extracts fromPeriplaneta Aamericanaonin vitroproliferation,migration and VEGF protein expression of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells.MethodsScratch assay was applied to measure the effect of extracts fromPeriplaneta americanaon migration of HepG2 cells.Immunohistochemical staining and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)were used to detect the effect of extracts fromPeriplaneta americaon the expression of VEGF protein in the cells.ResultsMTT assay and Scratch assay showed thatPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream could inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells in a time-and dose-dependent manner.Immunohistochemical staining and ELISA indicated thatPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream could down regulate the expression of VEGF protein in the cells.ConclusionsPeriplaneta americanapolypeptides,CⅡ-3 and skimmed cream can inhibit thein vitroproliferation and migration of HepG2 cellsin vitroin a timeand dose-dependent way,and reduce the expression of VEGF protein in the cells;and the effect ofPeriplaneta americanaextracts is better than that of CⅡ-3 and skimmed cream.

Periplaneta americanapolypeptide;HepG2 cells;proliferation and migration;VEGF

R735.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.001

1005-8982（2017）12-0001-08

2017-01-03

國家自然科學(xué)基金（No：81560600）

彭芳，E-mail：pengfang101@sohu.com