陳 夏 彭 丹 陶 懷 沈 奕 周 政

(中南大學湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410011)

骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細胞Fas基因增強子區(qū)甲基化水平與Fas蛋白表達的相關(guān)性

陳 夏 彭 丹 陶 懷1，2沈 奕 周 政

(中南大學湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長沙 410011)

目的 通過觀察骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細胞中Fas基因甲基化水平與Fas蛋白表達的相關(guān)性，探討Fas基因增強子區(qū)異常甲基化在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法 采用亞硫酸氫鈉方法處理基因組DNA，甲基化特異性PCR技術(shù)和免疫組織化學法分別檢測14例健康人和35例OA患者軟骨細胞中Fas基因增強子區(qū)甲基化水平和相關(guān)蛋白表達情況。結(jié)果 OA組Fas基因增強子區(qū)低甲基化率及軟骨細胞Fas蛋白表達陽性率均明顯高于健康對照組(P<0.01)，且Fas基因低甲基化及蛋白表達與性別，年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)。Fas增強子低甲基化與Fas蛋白表達呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 OA患者關(guān)節(jié)軟骨細胞Fas基因增強子區(qū)呈低甲基化狀態(tài)，通過上調(diào)Fas蛋白表達參與OA的發(fā)生發(fā)展。

骨關(guān)節(jié)炎;Fas增強子;甲基化

近年研究證實軟骨細胞過度凋亡與骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。在某些病理條件下，軟骨細胞中一系列表達調(diào)控基因被激活，通過死亡受體途徑介導凋亡的發(fā)生。Fas/FasL信號傳導通路是介導細胞凋亡的重要死亡受體途徑。已有研究表明，F(xiàn)as/FasL通路介導的軟骨細胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨損傷機制中起著重要的作用，而Fas基因表達受甲基化調(diào)控〔2〕。Petak等〔3〕用甲基化特異性PCR檢測了結(jié)腸癌患者癌組織細胞中的Fas基因增強子甲基化情況，發(fā)現(xiàn)Fas基因增強子甲基化降低了Fas蛋白的表達并且抑制了Fas介導的細胞凋亡，表明甲基化在Fas蛋白表達調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。 de Andrés等〔4〕也報道OA的發(fā)生發(fā)展過程與軟骨細胞的DNA甲基化有一定相關(guān)性。 因此，DNA甲基化異常是影響細胞Fas表達及Fas介導OA中軟骨細胞凋亡的一個重要機制。本文采用亞硫酸氫鈉測序法檢測關(guān)節(jié)軟骨細胞中Fas基因增強子區(qū)甲基化情況，采用免疫組化法檢測關(guān)節(jié)軟骨細胞中Fas蛋白的表達情況，以探討Fas基因增強子區(qū)甲基化異常在OA發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 14例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2012年9月至2014年7月因交通事故在中南大學湘雅二醫(yī)院行大腿中下段截肢的患者，男8例，女6例；年齡30～62(平均40)歲。35例OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2013年9月至2014年在中南大學湘雅二醫(yī)院就診，根據(jù)1995年美國風濕協(xié)會骨關(guān)節(jié)炎的診斷標準，診斷為OA且有關(guān)節(jié)置換手術(shù)指征的患者，男16例，女19例；年齡52～79(平均65)歲。術(shù)中無菌采集標本，每組標本分為2份∶1份放液氮內(nèi)保存，進行DNA甲基化檢測；另 1份石蠟包埋，進行免疫組化分析。

1.2 亞硫酸氫鈉測序 軟骨細胞DNA提取參照TIANGEN公司的血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒具體說明進行操作：取軟骨組織50 mg，經(jīng)EDTA脫鈣液脫鈣后，加入組織裂解液進行勻漿，勻漿經(jīng)蛋白酶K消化后，用吸附柱法提取軟骨組織DNA,分光光度計檢測DNA純度和濃度，瓊脂糖凝膠電泳法鑒定DNA完整性，4℃保存?zhèn)溆?。?0 μl DNA 水溶液用EZ DNA甲基化試劑盒(北京天漠公司)進行純化和DNA甲基化修飾,處理后的DNA儲存在-70℃冰箱中保存。根據(jù)文獻〔3〕報道的引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Fas甲基化上游引物序列為5′-AGTTTCGGCGTTTTTCGGAGATTATTGC-3′，下游引物序列為5′-CACCCGCGCCGAAACGAACC-3′；Fas非甲基化上游引物序列為5′-GGTAGTTTTGGTGTTTTTTGGAGATTATTGT-3′,下游引物序列為5′-CACCCACACCAAAACAAACCTTTAAC-3′。PCR總反應體系20 μl,DNA模板2.0 μl，上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，Taq酶10 μl，加ddH2O稀釋至總體積20 μl。取5 μl擴增產(chǎn)物上樣，以2 μl DNA Marker作為標準對照,2%瓊脂糖凝膠電泳，恒電壓(120 V)電泳25 min，溴乙啶染色，紫外燈下檢測擴增產(chǎn)物，拍照保存圖片后，含目的樣品的PCR產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學檢測 石蠟包埋組織標本，5 μm連續(xù)切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶SP法檢測，切片常規(guī)脫蠟處理后，置于抗原修復液中95℃修復10～15 min，其余步驟參照說明書進行。切片經(jīng)梯度乙醇脫水、干燥、二甲苯透明，中性樹膠封固后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗或Fisher確切概率法檢驗和Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 DNA完整性檢測 提取的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，DNA片段大于600 bp。DNA完整，無降解，見圖1。

2.2 OA患者和健康人軟骨細胞中Fas增強子區(qū)甲基化狀態(tài)比較 以DNA Marker作為對照，其中OA組與健康對照組軟骨細胞Fas基因增強子區(qū)低甲基化百分率分別為74.29%(26/35)和28.57%(4/14)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.803，P=0.003)，見圖2。

1：DNA Marker;2～8：DNA樣品1～7圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶

2.3 OA患者和健康人軟骨細胞中Fas蛋白表達情況 Fas 蛋白表達陽性表現(xiàn)為胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色，經(jīng)分析，OA組與健康對照組軟骨細胞Fas蛋白陽性率分別為77.14%(27/35)和14.29%(2/14)，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=16.356，P=0.002)，見圖3。

1：DNA Marker;2:Fas增強子區(qū)甲基化引物擴增后的產(chǎn)物(184 bp)；3：Fas增強子區(qū)非甲基化引物擴增后的產(chǎn)物(187 bp)圖2 兩組Fas基因增強子區(qū)甲基化狀態(tài)

圖3 兩組軟骨細胞中Fas蛋白表達情況(DAB，×200)

2.4 Fas基因甲基化及蛋白表達與性別、年齡之間的關(guān)系 Fas基因低甲基化及Fas蛋白表達與性別、年齡無明顯相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 所有研究對象Fas基因低甲基化及蛋白表達與性別、年齡的關(guān)系(n)

2.5 OA患者軟骨細胞中Fas增強子區(qū)低甲基化狀態(tài)與蛋白表達的關(guān)系 26例Fas增強子低甲基化的OA患者中，有24例蛋白表達陽性；而27例Fas蛋白表達陽性的OA患者中，有24例Fas增強子低甲基化，F(xiàn)as增強子低甲基化與蛋白表達呈顯著正相關(guān)(r=0.614,P<0.01)。

3 討 論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生為病理特征的慢性退行性疾病，其發(fā)病率隨年齡增長逐漸增加。軟骨細胞作為成熟軟骨組織內(nèi)唯一細胞類型，在軟骨損傷及重塑過程中維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，特別是軟骨細胞凋亡對OA 軟骨破壞起著關(guān)鍵性作用。已有研究表明，軟骨細胞凋亡參與了OA 的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。Fas 蛋白是一種含有319個氨基酸的Ⅰ 型跨膜蛋白，可與細胞因子FasL結(jié)合傳導由FasL引起的細胞凋亡程序。Fas蛋白在正常軟骨細胞內(nèi)有一定水平的表達，介導軟骨細胞處于凋亡與增殖的動態(tài)平衡之中。Kim等〔7〕研究報道鳥苷代謝物通過增強Fas-FasL相互作用誘導軟骨細胞凋亡，表明軟骨細胞中Fas/FasL信號傳導通路異?？赡芡ㄟ^介導軟骨細胞凋亡參與OA發(fā)生和發(fā)展過程。Tu 等〔8〕報道也證實OA 軟骨細胞中Fas蛋白較正常軟骨組織細胞高表達。本研究也發(fā)現(xiàn)與正常人相比，OA患者骨關(guān)節(jié)軟骨組織中Fas蛋白明顯高表達。因此，本文推測Fas蛋白表達增加可能是OA的發(fā)病機制之一。

在某些病理情況下，基因增強子區(qū)域CpG島的甲基化干擾一些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達。Petak等〔3〕發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者癌組織細胞中Fas基因增強子區(qū)域DNA甲基化降低了Fas蛋白的表達并且抑制了Fas介導的細胞凋亡。Thaler等〔9〕發(fā)現(xiàn)小鼠原成骨細胞中Fas蛋白的表達下降與Fas基因的異常甲基化有密切關(guān)系。Jones等〔10〕發(fā)現(xiàn)Sezary綜合征中Fas基因的蛋白表達下降與Fas基因的高甲基化有關(guān)。因此，本文推測OA患者骨關(guān)節(jié)組織中Fas蛋白高表達可能與Fas基因增強子區(qū)甲基化異常有關(guān)。

Fas基因低甲基化改變后，轉(zhuǎn)錄因子與低甲基化的增強子區(qū)域的DNA的結(jié)合，促進Fas基因的轉(zhuǎn)錄和表達，導致Fas基因蛋白表達增加，而Fas蛋白的異常高表達，增加了Fas/FasL介導的細胞凋亡，使軟骨細胞凋亡增加，最終參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。

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2 Hoa T,Hasunma T,Aono H,etal.Novel mechanisms of selective apoptosis in synovial T cells of with rheumatoid arthritis〔J〕.J Rheumatol,1996;23(7):1331-6.

3 Petak I,Danam RP,Tillman DM,etal.Hypermethylation of the gene promoter and enhancer region can regulate Fas expression and sensitivity in colon carcinoma〔J〕.Cell Death Differ,2003;10(2):211-7.

4 de Andrés MC,Imagawa K,Hashimoto K,etal.Loss of methylation in CpG sites in the NF-κB enhancer elements of inducible nitric oxide synthase is responsible for gene induction in human articular chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2013;65(3):732-42.

5 Zamli Z,Robson Brown K,Tarlton JF,etal.Subchondral bone plate thickening precedes chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in spontaneous animal models of osteoarthritis〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014：1-10.

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8 Tu Y,Xue H,Francis W,etal.Lactoferrin inhibits dexamethasone-induced chondrocyte impairment from osteoarthritic cartilage through up-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and suppression of FASL,FAS,and Caspase 3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;441(1):249-55.

9 Thaler R,Karlic H,Spitzer S,etal.Extra-cellular matrix suppresses expression of the apoptosis mediator Fas by epigenetic DNA methylation〔J〕.Apoptosis,2010;15(6):728-37.

10 Jones CL,Wain EM,Chu CC,etal.Downregulation of Fas gene expression in Sézary syndrome is associated with promoter hypermethylation〔J〕.Invest Dermatol,2010;130(4):1116-2.

〔2016-01-30修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

彭 丹(1966-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事骨性疾病發(fā)生機制研究。

陳 夏(1984-)，男，博士，主治醫(yī)師，主要從事骨性疾病發(fā)生機制研究。

R684.3

A

1005-9202(2017)13-3188-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.028

1 湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室

2 湖南中醫(yī)藥大學干細胞調(diào)控與應用實驗室