李曉寧單筱淳吳磊劉雙嶺梅繼林李諾

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

·研究報告·

夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍（MP）對ASCI大鼠脊髓組織病理形態(tài)學(xué)影響的時效關(guān)系實驗研究*

李曉寧1單筱淳2吳磊2劉雙嶺1梅繼林2李諾2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱150040）

目的探尋夾脊電針聯(lián)合甲基強的松龍（MP）治療對大鼠急性脊髓損傷（ASCI）后組織的病理學(xué)改變影響的時效關(guān)系。方法將72只大鼠雌性Wistar大鼠按隨機數(shù)字表法平均分為Sham組、ASCI組、EA+MP組，每組又分為1 d、3 d、7 d、14 d 4個亞組。采用BBB評分觀察不同治療方法在不同時間點對ASCI大鼠肢體運動功能的影響；采用HE染色觀察在各個時間點對ASCI大鼠脊髓組織病理學(xué)影響；比較Sham組、ASCI組、EA+MP組在不同的時間點治療效果，篩選最佳治療方案。結(jié)果BBB評分結(jié)果顯示，術(shù)后3 d、7 d、14 d，與ASCI組比較，EA+MP組大鼠肢體運動功能評分升高（P＜0.05），EA+MP組組間比較，14 d組明顯優(yōu)于3 d組；HE染色結(jié)果顯示ASCI組大鼠1 d時出血明顯，可見大量凋亡神經(jīng)細(xì)胞；3 d時細(xì)胞破壞最明顯，7 d時神經(jīng)細(xì)胞凋亡有所減輕，神經(jīng)細(xì)胞壞死，4 d時凋亡已不明顯，可見空泡存在，治療組神經(jīng)細(xì)胞損傷情況較ASCI組明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞保存較完好。結(jié)論夾脊電針聯(lián)合MP能改善ASCI大鼠運動功能評分，同時減少細(xì)胞凋亡，減輕脊髓病理學(xué)形態(tài)改變，并隨著時間延長效果愈加明顯。

急性脊髓損傷大鼠夾脊電針甲基強的松龍時效關(guān)系急癥

脊髓損傷（SCI）致殘率高，給社會和家庭造成沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。目前臨床治療方法［1］主要應(yīng)用藥物治療如糖皮質(zhì)激素治療、Ca2+通道阻滯劑、谷氨酸受體拮抗治療，其中甲基強的松龍（MP）因其可以顯著提高節(jié)段性的脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)，在臨床廣泛應(yīng)用。但有研究報道，MP治療可能導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，比如重癥感染從而加重SCI臥床患者的病情。因此，該藥物治療方案目前臨床仍有待改善。夾脊電針是應(yīng)用針刺夾脊穴并通以脈沖電流以治療SCI患者的一種臨床常用治療方法?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)［2］，夾脊電針可以保護(hù)受損的神經(jīng)組織細(xì)胞，改善細(xì)胞再生的微環(huán)境，但對于該治療方案中夾脊電針治療運用的時間目前仍未統(tǒng)一。因此，本研究通過建立急性脊髓損傷（ASCI）大鼠，觀察夾脊電針聯(lián)合MP不同治療時間對其運動功能和脊髓組織病理形態(tài)學(xué)改變的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試驗動物健康Wistar雌性大鼠（由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供），保持實驗動物水與糧食充足，所有大鼠需要在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)適應(yīng)1周。

1.2 儀器及試劑水平搖床（型號WD-9405B），電泳儀（型號DYY-7C），電泳儀（型號DYY-7C），全蛋白提取試劑盒（生產(chǎn)公司W(wǎng)anleibio，貨號WLA019），BCA蛋白濃度測定試劑盒（生產(chǎn)公司W(wǎng)anleibio，貨號WLA004）。

1.3 分組及造模將72只大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表法分為3組，分別為假手術(shù)組（Sham組，24只）、急性脊髓損傷組（ASCI組，24只）、急性脊髓損傷+電針治療+甲基強的松龍組（EA+MP組，24只）、每組又分別分為1 d、3 d、7 d及14 d 4個亞組，每組6只。采用美國Impactor Model-Ⅲspinal cord contusion system打擊器，制作大鼠ASCI模型（T10，中度損傷）。腹腔麻醉后皮膚常規(guī)消毒，在T10上1.5 cm下1.5 cm切長約3 cm的縱行切口，暴露T9～11棘突，以T10為中心段脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，清創(chuàng)后傷口部位常規(guī)分層縫合。待大鼠清醒后，分別進(jìn)行BBB評分，選擇BBB評分在1～3分入組，造模后大鼠單籠飼養(yǎng)。1分：1或2個關(guān)節(jié)輕微運動，通常為髖和/或膝關(guān)節(jié)。2分：1關(guān)節(jié)廣泛活動或1個關(guān)節(jié)廣泛活動且有另一關(guān)節(jié)輕微活動。3分：2個關(guān)節(jié)廣泛活動。

1.4 實驗干預(yù)方法1）Sham組。手術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處置。2）ASCI組。模型制備成功后單籠飼養(yǎng)，不予任何處置。3）EA+MP組。（1）EA：于模型制備成功后3 h進(jìn)行夾脊電針早期干預(yù)治療，此后每日1次，直至療程結(jié)束。針刺穴位選取T9、T11節(jié)段夾脊穴。將0.35 mm×13 mm毫針直刺入所選穴位下4～5 mm，給予電針儀脈沖連續(xù)波，脈沖寬度：（0.5±0.15）ms，頻率為100 Hz，脈沖峰值為Vp1≥（40±10）V（在500 Ω負(fù)載下），刺激時長為每次30 min。（2）MP：術(shù)后30 min時，給予實驗大鼠一次性注射MP。MP按30 mg/kg，與0.9％氯化鈉注射液配置注射液，給予大鼠腹腔注射0.5 mL；正常捆綁，其余不予任何處置。

1.5 樣本采集大鼠在治療時間點結(jié)束后，依據(jù)相對應(yīng)的打擊損傷時間進(jìn)行麻醉，然后斷頭處死。于冰盒上快速取出損傷處脊髓，長度約4 cm，從損傷中心處迅速切開，依據(jù)實驗檢測需要一部分損傷脊髓組織置入4％多聚甲醛緩沖液中固定后4℃冰箱備用。組織病理學(xué)形態(tài)變化：經(jīng)石蠟切片的制備，切片脫蠟至水、染色、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟進(jìn)行HE染色并鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，先進(jìn)行方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本均數(shù)之間的多重分析行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠BBB運動功能評分比較見表1。BBB評分結(jié)果顯示，Sham組未見運動功能評分降低。術(shù)后各時間點，ASCI組大鼠運動功能評分較其他組降低更明顯，與Sham組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與ASCI組相比，術(shù)后1 d、3 d的EA+MP組大鼠肢體運動功能降低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。術(shù)后7 d、14 d，與ASCI組比較，EA+MP組大鼠肢體運動功能評分升高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，EA+MP組能改善大鼠脊髓損傷后肢體運動功能，且治療時間長者治療優(yōu)勢更加明顯，療效顯著。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能比較（分，±s）

與組內(nèi)各時間點比較，▲P＜0.05；與ASCI組比較，△P＜0.05。

組別n 1 d3 d7 d14 d Sham組24 ASCI組24 21.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00 1.17±0.411.50±0.842.67±1.214.33±1.51 EA+MP組241.50±0.55▲3.67±1.51▲7.17±0.75▲△12.00±1.55▲△

2.2 各組大鼠HE染色觀察脊髓組織病理學(xué)形態(tài)變化比較HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組的4個時間點均可見細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，其中神經(jīng)元形態(tài)較大，軸突明顯。1 d的ASCI組細(xì)胞形態(tài)呈凋亡改變；EA+MP組，治療組細(xì)胞形態(tài)改變類似，總體較ASCI組損傷程度輕，死亡神經(jīng)元少于ASCI組。3 d的ASCI組大量細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，呈凋亡細(xì)胞改變，神經(jīng)元死亡數(shù)量增多；治療組與ASCI組相比，組織病變程度減輕，細(xì)胞損傷有所緩解，神經(jīng)元凋亡減少，可見的神經(jīng)元形態(tài)較好。7 d的ASCI組呈現(xiàn)凋亡形態(tài)改變的細(xì)胞數(shù)量減少，神經(jīng)元死亡數(shù)量下降，膠質(zhì)細(xì)胞增生。14 d的ASCI組可見細(xì)胞壞死和空泡，炎性浸潤，膠質(zhì)細(xì)胞增生；EA+MP組正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，治療效果最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠的HE染色（200倍）

3 討論

據(jù)近年相關(guān)文獻(xiàn)報道［3］，夾脊電針配合MP治療ASCI可有效改善肢體功能。從中醫(yī)學(xué)講，SCI后肢體癱瘓屬“痿證”范疇［4-5］，督脈總督一身之陽氣，膀胱經(jīng)脈為十二經(jīng)脈背俞穴會聚之所，夾脊穴在兩經(jīng)之間，既可通調(diào)督脈與膀胱經(jīng)之氣，又可平衡臟腑氣血，疏通經(jīng)氣運行。在此基礎(chǔ)上增加電針可增強刺激量，由于脊髓受損，氣滯血瘀不能通達(dá)筋脈肌肉，氣血失養(yǎng)而致痿癥。夾脊電針可刺激腧穴，增強氣血運行，以達(dá)到扶正祛邪、平衡陰陽之效。從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度分析，夾脊穴［6-8］位于脊神經(jīng)后支，交感神經(jīng)纖維通過交通支，分布到各個臟腑器官。夾脊電針［9-11］通過調(diào)節(jié)神經(jīng)體液、釋放化學(xué)物質(zhì)、保護(hù)受損的神經(jīng)細(xì)胞并改善細(xì)胞再生的微環(huán)境，從而減少細(xì)胞凋亡形態(tài)，減輕組織病變程度，以達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)、改善肢體運動功能之效。脊髓損傷后局部微循環(huán)中［12-14］，前列腺素等產(chǎn)物釋放造成嚴(yán)重的繼發(fā)反應(yīng)，而MP通過與體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，減少系列產(chǎn)物的釋放，減少細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)合治療可明顯改善大鼠肢體運動功能，并隨著時間的延長，治療效果越顯著。從病理學(xué)形態(tài)角度分析，本研究治療組1 d和3 d組，與ASCI組組間相比，夾脊電針配合甲強龍治療后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變較小，細(xì)胞損傷較低，神經(jīng)元死亡數(shù)量較低；7 d和14 d組中，治療組與對照組比較，正常神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，形態(tài)較好，結(jié)構(gòu)較清晰，炎性細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，治療組中以EA+MP組治療效果最為明顯，細(xì)胞恢復(fù)程度最佳，并隨著時間延長效果愈加明顯。

本研究通過對各組大鼠4個階段的比較發(fā)現(xiàn)，EA+MP組的治療效果最佳，并隨著時間的延長，肢體功能改善愈明顯。彭彬等通過觀察采用夾脊電針治療SCI后大鼠的運動功能評分發(fā)現(xiàn)，治療組中的7 d組與14 d組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明夾脊電針治療效果與時間呈正比關(guān)系［15］，與本研究結(jié)論相同。趙永青等采用MP對急性SCI神經(jīng)元保護(hù)作用的實驗研究中，對3 d、7 d、15 d和30 d 4個時間點進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)MP組隨時間延長，損傷區(qū)內(nèi)正常神經(jīng)元和變化神經(jīng)元的數(shù)量多于模型對照組，說明隨著時間延長，對神經(jīng)損傷的程度越輕［16］，其結(jié)論與本研究一致。

綜上所述，夾脊電針配合MP治療大鼠SCI可以明顯改善大鼠運動功能，同時可有效減少對神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)脊髓神經(jīng)的功能恢復(fù)，并隨著時間的延長，治療效果愈顯著。

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E xperimental Study on Time-effect Relationship of Jiaji Electroacupuncture and MP（Methylprednisolone）on Spinal Cord Tissue Pathomorphology in ASCI Rats

LI Xiaoning，SHAN Xiaochun，WU Lei，etal.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin 150001，China.

Objective：To study time-effect relationship of Jiaji electroacupuncture and MP（Methylprednisolone）on pathomorphology change of spinal cord tissue in ASCI rats.Methods：72 female Wister rats were randomly divided into sham operation group，ASCI group，and EA+MP group，and each group was divided into four subgroups：1 d，3 d，7 d and 14 d.BBB scores were observed to find the effects of different treatments on limb movement function of ASCI rats at different time points；HE staining was used to observe the pathological changes of spinal cord of ASCI rats at different time points；treatment effects at different time points in different groups were compared to select the best treatment plan.Results：BBB scores showed that on 3 d，7 d，14 d after operation，compared with the ASCI groups，limb movement function score increases in EA+MP groups（P＜0.05）.14 d group was better than 3 d group in EA+MP groups.HE staining results showed that on 1st day，ASCI groups had significant bleeding，and a large number of apoptotic neurons appeared；on 3rd day，there was the most obvious cell destruction；on 7th day，the apoptosis of nerve cells was decreased and the nerve cells were necrotic；on 14th day，apoptosis was not obvious，and there physalides existed.The injury of nerve cells in the treatment groups was significantly lower than that in ASCI groups，and the nerve cells were well preserved.Conclusion：Jiaji electroacupuncture and MP can improve the movement function scores of ASCI rats，meanwhile，reduce the apoptosis，and relieve spinal pathology morphological changes，and the effects are more obvious with the extension of time.

Acute spinal cord injury；Rats；Jiaji electroacupuncture；Methylprednisolone；Time-effect relationship；Emergency

R245.9+7

A

1004-745X（2017）06-0941-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.06.001

2017-03-25）

國家自然基金（面上）項目（81373715）；哈爾濱市應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)項目科技創(chuàng)新人才類優(yōu)秀學(xué)科帶頭人B類（2016RAXYJ090）