吳喜鏈 董忠 吳錦標(biāo) 謝騏同 甘妙平

·實驗研究·

雙孔鉀離子通道TRAAK在膀胱炎大鼠脊髓中的表達變化

吳喜鏈 董忠 吳錦標(biāo) 謝騏同 甘妙平

目的 觀察大鼠膀胱炎癥模型L6～S1脊髓節(jié)段中TRAAK 鉀離子通道的表達變化情況, 并探討其與膀胱功能障礙的關(guān)系。方法 16只SD大鼠, 隨機分為實驗組及對照組, 每組8只。實驗組給予環(huán)磷酰胺300 mg/kg一次性腹腔注射給藥, 對照組則腹腔注射等量生理鹽水。采集L6～S1脊髓節(jié)段組織, 利用免疫組織化學(xué)及western blot方法檢測L6～S1脊髓節(jié)段TRAAK的表達。結(jié)果 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示, 實驗組大鼠L6～S1脊髓節(jié)段的前角及后角神經(jīng)元染色均低于對照組, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。western blot結(jié)果提示, TRAAK鉀離子通道在實驗組大鼠L6～S1脊髓節(jié)段的蛋白表達量明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論 TRAAK鉀離子通道在大鼠膀胱炎癥模型的L6～S1脊髓節(jié)段中表達下調(diào), 這可能使脊髓神經(jīng)中樞神經(jīng)元的興奮性升高, 進而參與膀胱炎癥時膀胱功能障礙的發(fā)生。

膀胱炎；脊髓；TRAAK；大鼠

以尿頻、尿急、尿痛為主要臨床癥狀的膀胱炎癥性疾病在臨床上極為常見, 包括細菌性及非細菌性炎癥, 而非細菌性膀胱炎的發(fā)病機制未明, 其治療仍困擾著臨床醫(yī)生。膀胱的主要功能是儲存尿液, 受脊髓排尿中樞的調(diào)控, 當(dāng)膀胱出現(xiàn)炎癥時, 膀胱的敏感性升高, 支配膀胱的脊髓排尿中樞的神經(jīng)元興奮性可能發(fā)生改變。雙孔鉀離子通道TRAAK (TWIK-related arachidonic acid-activated K channel, KCNK4)在生理條件下可以降低細胞興奮性［1］, 可能是神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)器［2］。本文通過膀胱炎癥大鼠, 采用免疫組織化學(xué)及蛋白質(zhì)印跡的方法, 檢測排尿中樞L6～S1脊髓節(jié)段的TRAAK表達變化情況, 從而探討雙孔鉀離子通道與膀胱炎癥之間的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1. 1 材料來源 健康成年雌性Sprague Dawley 大鼠16 只,體重240～300 g, 購自中山大學(xué)實驗動物中心。將SD大鼠隨機分為實驗組及對照組, 每組8只。

1. 2 方法 建模方法參照都書琪等［3］報道, 實驗組每只均予環(huán)磷酰胺300 mg/kg一次性腹腔注射給藥, 而對照組則腹腔注射等量生理鹽水。注射48 h后烏拉坦腹腔內(nèi)注射麻醉大鼠, 摘除膀胱備HE染色用, 同時切取T12椎體以下脊柱,由L6～S1脊神經(jīng)根往上追溯確定L6～S1脊髓節(jié)段的位置。

1. 3 免疫組織化學(xué)及western blot檢測L6～S1脊髓節(jié)段TRAAK的表達 免疫組織化學(xué)過程：將切取的脊髓節(jié)段經(jīng)4%多聚甲醛溶液中固定24 h后進行梯度脫水、石蠟包埋、切片。病理切片常規(guī)脫蠟入水, 0.3% H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶, 山羊血清封閉切片, 滴加一抗, 4℃過夜；PBS 水洗后滴加二抗, DAB 顯色, 蘇木精復(fù)染胞核, 脫水, 透明, 封片,顯微鏡觀察。western blot過程：將切取的脊髓節(jié)段稱重, 組織勻漿, 提取蛋白, BCA法蛋白定量。進行SDS-PAGE凝膠電泳, 配制5%的濃縮膠及12%的分離膠, 分別用80 V及120 V進行電泳, 蛋白上樣量100 μg, 轉(zhuǎn)膜(200 A, 50 min), 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h, 加入1∶2000 稀釋的一抗4 ℃孵育過夜, 加入1∶5000 稀釋的HRP 標(biāo)記的二抗搖床上室溫孵育1 h, 用化學(xué)發(fā)光法經(jīng)X光底片成像顯影。采用Gel-Pro analyzer 4軟件對顯影條帶進行分析, 用目的條帶和β-actin條帶的IOD比值作為目的蛋白的相對表達水平。β-actin及TRAAK抗體均購自以色列Alomone公司。

1. 4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準差(±s)表示, 采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

經(jīng)腹腔內(nèi)注射環(huán)磷酰胺48 h后, 大鼠膀胱可見充血、水腫, HE染色證實膀胱炎性改變。免疫組織化學(xué)顯示TRAAK鉀離子通道蛋白染色后呈褐色, 在L6～S1脊髓節(jié)段中, 兩組大鼠的神經(jīng)元均有TRAAK 鉀離子通道蛋白表達, 細胞膜及細胞質(zhì)中均被染成褐色。與對照組相比, 實驗組大鼠的脊髓后角及前角神經(jīng)元染色較淺, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1 A, B。在TRAAK 鉀離子通道蛋白起作用的細胞膜處, 對照組大鼠的神經(jīng)元的染色較實驗組更深。見圖1 C, D。這些提示炎癥發(fā)生后TRAAK 鉀離子通道表達下調(diào)。同時western blot 結(jié)果也提示了TRAAK 鉀離子通道在實驗組大鼠L6～S1脊髓節(jié)段中的蛋白表達下降。兩組大鼠均有47 kD 的TRAAK鉀離子通道蛋白表達, 但與對照組相比, 實驗組的條帶密度相對較低, 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

圖1 TRAAK鉀離子通道在兩組L6~S1脊髓節(jié)段中表達情況的免疫組織化學(xué)結(jié)果

圖2 TRAAK 鉀離子通道蛋白在兩組大鼠L6~S1脊髓節(jié)段中表達情況的western blot結(jié)果

3 討論

膀胱炎在臨床上表現(xiàn)為尿頻、尿急等癥狀, 其產(chǎn)生的機制尚未明確。膀胱炎癥狀態(tài)下膀胱壁出現(xiàn)上皮損傷、黏膜水腫、肌層和黏膜層炎癥細胞浸潤等改變, 有研究發(fā)現(xiàn)大鼠膀胱炎模型的脊髓后根神經(jīng)節(jié)中受體電位蛋白通道A1表達上調(diào), 可能與膀胱炎時的病理性排尿有關(guān)［3］。可見, 膀胱炎癥狀產(chǎn)生的機制可能同時存在于膀胱壁、支配膀胱的神經(jīng)纖維甚至神經(jīng)中樞等。

膀胱的生理功能主要是在神經(jīng)系統(tǒng)的支配下完成的, 包括膀胱充盈時的感知和排尿時逼尿肌的收縮等。當(dāng)支配膀胱的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)病變, 比如神經(jīng)元興奮性改變, 均可能會引起膀胱功能障礙。另外, 人體中存在中樞致敏現(xiàn)象, 在外周傷害性刺激的重復(fù)或持續(xù)作用下, 神經(jīng)突觸興奮性的功能依賴性變化可使傷害感受性系統(tǒng)發(fā)生敏感化［4,5］。膀胱炎性病變可產(chǎn)生強烈而持續(xù)的傷害性刺激, 也可能會使中樞神經(jīng)產(chǎn)生病理生理改變。因此, 在膀胱炎癥狀態(tài)下對支配膀胱的脊髓排尿中樞中TRAAK 鉀離子通道的表達情況進行研究。

大鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后, 在體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物經(jīng)由腎臟排泄, 進入膀胱后產(chǎn)生刺激作用, 使膀胱出現(xiàn)炎性反應(yīng),這是一個常用的炎性模型［3］。大鼠膀胱的中樞神經(jīng)系統(tǒng)位于L6～S1脊髓節(jié)段, 本研究發(fā)現(xiàn)膀胱炎大鼠的L6～S1脊髓節(jié)段中的TRAAK 鉀離子通道表達下降。

TRAAK 鉀離子通道是屬于TREK 類花生四烯酸敏感和機械牽張門控的雙孔鉀離子通道, 可產(chǎn)生自發(fā)的細胞背景電流, 維持一定的細胞膜靜息電位, 其開放可引起細胞超極化、降低膜電位、減少鈣離子內(nèi)流、降低細胞興奮性［1］, 可能是神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)器［2］?；ㄉ南┧?、亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸對其有強烈地可逆性激活作用［6,7］, 而L-甲硫氨酸則可使花生四烯酸激活下的TREK 類鉀離子通道開放幾率下降。本研究中TRAAK 鉀離子通道在膀胱炎癥大鼠的L6～S1脊髓節(jié)段中表達下調(diào), 推測可能存在以下原因：由炎癥作用于膀胱壁的傷害感受器, 在尿液充盈膀胱時更為明顯,產(chǎn)生的傷害性刺激信號傳入脊髓神經(jīng)中樞, 為了對抗膀胱的充盈狀態(tài), 減少傷害性刺激, 出現(xiàn)了TRAAK 鉀離子通道的表達下降, 細胞膜靜息電位上升, 神經(jīng)元的興奮性增高, 進而加強逼尿肌的收縮活動, 排空膀胱, 減少傷害性刺激, 這或許是神經(jīng)系統(tǒng)的代償反應(yīng)之一［8-10］。

臨床上膀胱炎包括細菌性和非細菌性炎癥, 細菌性膀胱炎以抗感染對因治療為主, 而非細菌性膀胱炎的治療往往病因復(fù)雜而難以準確的進行對因治療, 此時對癥治療就顯得極為重要。本研究發(fā)現(xiàn)膀胱炎癥大鼠脊髓排尿中樞的TRAAK表達下降, 可能引起脊髓后角的感覺神經(jīng)元興奮性升高, 可表現(xiàn)為尿急；而脊髓前角的運動神經(jīng)元興奮性升高則可表現(xiàn)為尿頻。這符合膀胱炎的臨床癥狀, 可為研究膀胱炎癥所致膀胱功能障礙提供新的研究思路。

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［10］ 孫麗娜. TREK-1雙孔鉀通道的藥理學(xué)研究及其抗氧化損傷機制的探討. 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué), 2006.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.12.111

2017-04-11］

516000 惠州市中心人民醫(yī)院泌尿外科