鄭志遠

超敏和普敏兩種方法在血清HBV-DNA定量檢測中的比較研究

鄭志遠

目的 對比分析超敏和普敏兩種方法在血清乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(HBV-DNA)定量檢測中的應(yīng)用價值。方法 85例血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性患者, 分別采用超敏、普敏進行血清HBV-DNA定量、定性分析, 并對HBV-DNA水平和HBV感染相關(guān)性進行分析。結(jié)果 定性分析結(jié)果顯示, 85例血清HBsAg陽性患者超敏法檢出80例陽性, 陰性5例, 陽性檢出率94.12%；普敏法檢出56例陽性, 29例陰性, 陽性檢出率65.88%。超敏法陽性檢出率高于普敏法, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低載量組中, 超敏定量分析法和普敏定量分析法定量分析結(jié)果具有相關(guān)性(P＜0.01)。臨床診斷慢性乙型肝炎患者HBV-DNA水平顯著高于臨床診斷非活動性HBsAg攜帶者, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論 較普敏法而言, 超敏法用于HBV-DNA定量檢測的靈敏度更高, 對于臨床中出現(xiàn)的＜104IU/ml的低載量病毒血清標本檢測, 超敏血清HBV-DNA定量檢測應(yīng)用價值更高, 值得臨床實踐應(yīng)用。

乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸；超敏法；普敏法；定量

慢性乙型肝炎是HBV感染所致的一種對人類生命構(gòu)成嚴重威脅的傳染性疾病。翻閱相關(guān)文獻, 相關(guān)數(shù)據(jù)顯示, 全世界慢性乙型肝炎病例達2.4億, 其中中國是慢性乙型肝炎的高發(fā)地區(qū)［1,2］。目前對于慢性乙型肝炎病毒感染的患者診療有賴于HBV免疫血清標志物, 在乙型肝炎病毒感染的過程中, HBV病毒的裝配及復制的活性對于整個傳染過程信息的傳遞起著十分重要的作用, 而HBV-DNA的檢測可反映乙型肝炎病毒的復制活性, 同時還可明確有無突變菌株, 此外,其在慢性乙型肝炎患者臨床治療中, 抗病毒藥物的治療效果評價也具有較高的價值。既往臨床使用的傳統(tǒng)熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)外標法對于HBV-DNA定量分析的靈敏度、特異度較低, 且重復性較差, 尤其是對于低載量標本而言,更是無法精確定量分析［3-5］。隨著人們對慢性乙型肝炎重視度提高, 超敏HBV-DNA定量分析法已經(jīng)逐漸應(yīng)用于臨床中,本研究特對比分析了超敏和普敏兩種方法在血清HBV-DNA定量檢測中的應(yīng)用價值, 詳細報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇2014年10月～2016年10月于本院就診的85例血清HBsAg陽性患者作為研究對象, 均通過2010年推出的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準確診, 排除血液標本出現(xiàn)溶血、脂血者；抗-甲型肝炎病毒(抗-HAV)、抗-人類免疫缺陷病毒(抗-HIV)、抗-丙型肝炎病毒(抗-HCV)檢測結(jié)果均(-)。其中男49例, 女36例,年齡18～75歲, 平均年齡(52.36±11.46)歲。

1. 2 方法 用無抗凝劑的干燥管采集靜脈血4 ml, 靜置30 min后離心(3000 r/min)10 min, 然后分離血清至1.5 ml離心管中, 在-20℃環(huán)境中保存, 待檢。核酸提取方法：嚴格按照操作規(guī)程, 向含有100 μl核酸吸附劑的0.5 ml的離心管中加入50 μl血清, 充分混勻后置于室溫中20 min, 并在該段時間內(nèi)旋渦混勻1～2次。然后以10000 r/min速度離心20 s后棄去上層清液, 向沉淀中添加150 μl洗滌液, 充分混勻后將沉淀制成混懸狀, 然后將沉淀離心, 并棄去上層清液后重復洗滌, 留存沉淀, 向內(nèi)加入30 μl核酸洗滌液, 充分混勻, 放置在96℃患者中5 min后10000 r/min離心20 s, 獲取上層清液。分別采用超敏、普敏進行血清HBV-DNA定量、定性分析。超敏法：儀器和試劑采用PerkinElmer全自動核酸提取加樣儀和羅氏LightCycler480Ⅱ熒光PCR儀器進行擴增分析。普敏法：采用傳統(tǒng)外標法, 試劑采用達安基因公司的乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒(PCR-熒光探針法), 檢測儀器為羅氏LightCycler480Ⅱ熒光PCR儀。

1. 3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件對研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布計量資料以均數(shù) ± 標準差(±s)表示, 采用t檢驗；非正態(tài)計量資料比較, 采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗；采用Spearman相關(guān)分析兩種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2. 1 兩種方法對HBV-DNA定性分析結(jié)果比較 定性分析結(jié)果顯示, 85例血清HBsAg陽性患者超敏法檢出80例陽性,陰性5例, 陽性檢出率94.12%；普敏法檢出56例陽性, 29例陰性, 陽性檢出率65.88%。超敏法陽性檢出率高于普敏法,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩種方法對85例血清HBsAg陽性患者HBV-DNA定性分析結(jié)果比較(n, %)

2. 2 兩種方法對HBV-DNA定量分析結(jié)果比較 普敏定量檢測系統(tǒng)的檢出限為500 IU/ml, 超敏定量檢測系統(tǒng)的檢出限為20 IU/ml。兩種方法均高于檢出限的共有55例, 該55例受檢者經(jīng)過超敏定量檢測法檢測結(jié)果中位值為2.96×105IU/ml, 明顯高于普敏定量檢測的5.64×104IU/ml, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。根據(jù)HBV-DNA載量(分界線：低載量＜104IU/ml,高載量≥104IU/ml)將該55份標本分成低載量和高載量兩組,低載量組中, 超敏定量分析法和普敏定量分析法定量分析結(jié)果具有相關(guān)性(P＜0.01)；高載量組中, 超敏定量分析法和普敏定量分析法定量分析結(jié)果無相關(guān)性(P＞0.05)。

2. 3 85例HBsAg陽性患者超敏和普敏法檢測血清HBV-DNA水平比較 85例HBsAg陽性患者中, 超敏法和普敏法不同年齡、性別患者HBV-DNA水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；臨床診斷慢性乙型肝炎患者HBV-DNA水平顯著高于臨床診斷非活動性HBsAg攜帶者, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表2。

表2 85例HBsAg陽性患者超敏和普敏法檢測血清HBV-DNA水平比較(M, 對數(shù)值, IU/ml)

3 討論

熒光定量PCR分析是基因擴增實驗用于病毒檢測的一種傳統(tǒng)技術(shù), 該技術(shù)檢測前對樣本的處理主要使用煮沸法進行血清核酸提取純化。雖然其臨床應(yīng)用較廣, 但回收率較低、重復性也較差, 并且耗時間和精力, 最終造成的人為誤差也較大, 定量的方法主要是采用外部的標準品, 所以無法滿足在核酸提取及純化過程中實時控制, 先行測定范圍也受外部標準品的影響, 上述原因最終造成普敏法對于載量病毒定量檢測準確性較低, 尤其是對于低載量病毒核酸分析時定量分析效果更差［6-9］。超敏定量分析采用PerkinElmer全自動核酸提取加樣儀對血液標本實施核酸提取、純化, 其回收率較高, 且重復性也較好, 最重要的是檢測結(jié)果更加準確, 并且超敏法是采用內(nèi)部標準品, 所以在進行核酸提取純化時與標本同時提取、擴增［10-12］。

本研究顯示, 定性分析結(jié)果顯示, 85例血清HBsAg陽性患者超敏法檢出80例陽性, 陰性5例, 陽性檢出率94.12%；普敏法檢出56例陽性, 29例陰性, 陽性檢出率65.88%。超敏法陽性檢出率高于普敏法, 差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且低載量組中, 超敏定量分析法和普敏定量分析法定量分析結(jié)果具有相關(guān)性(P＜0.01)。此外, 臨床診斷慢性乙型肝炎患者HBV-DNA水平顯著高于臨床診斷非活動性HBsAg攜帶者,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。本次研究結(jié)果和既往絕大多數(shù)相關(guān)研究［4,5］結(jié)論一致, 由此可見其具有一定科學依據(jù)。

綜上所述, 超敏法用于血清HBV-DNA定量檢測準確性更高, 較普敏法而言, 超敏定量分析法對低載量病毒檢測精確度更佳, 由此可見其臨床應(yīng)用價值較高。

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Comparative research of high sensitivity and ordinary sensitivity in serum HBV-DNA quantitative determination

ZHENG Zhi-yuan. Guangdong Meizhou City People’s Hospital, Meizhou 514031, China

Hepatitis B virus desoxyribonucleic acid; High sensitivity method; Ordinary sensitivity method; Quantitation

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.12.005

2017-03-31］

514031 廣東省梅州市人民醫(yī)院

【Abstract】 Objective To compare and analyze application value by high sensitivity and ordinary sensitivity in serum hepatitis B virus desoxyribonucleic acid (HBV-DNA) quantitative determination. Methods A total of 85 patients with positive serum hepatitis B surface antigen (HBsAg) received high sensitivity and ordinary sensitivity in serum HBV-DNA quantitative and qualitative analysis, along with analysis of correlation between HBV-DNA level and HBV infection. Results Qualitative analysis outcome showed 80 positive cases and 5 negative cases among 85 patients with positive serum HBsAg by high sensitivity method, along with positive detection rate as 94.12%; 56 positive cases and 29 negative cases by ordinary sensitivity method, along with positive detection rate as 65.88%. High sensitivity method had higher positive detection rate than ordinary sensitivity method, and the difference had statistical significance (P＜0.05). In low capacity group, quantitative analysis outcomes were correlated between high sensitivity quantitative analysis method and ordinary sensitivity quantitative analysis method (P＜0.01). Clinical diagnosis in chronic hepatitis B patients showed obviously higher HBV-DNA level than that in non-active HBsAg carrier, and the difference had statistical significance (P＜0.05). Conclusion Comparing with ordinary sensitivity method, implement of high sensitivity HBV-DNA quantitative determination shows higher sensitivity. High sensitivity serum HBV-DNA quantitative determination contains higher application value in detecting serum samples with low capacity ＜104IU/ml. This method is worth clinical practice and application.