劉亞娟何俊瑛○☆卜暉賀丹鄒月麗

·論著·

改良抗酸染色陽性的170例結(jié)核性腦膜炎腦脊液分析☆

劉亞娟*何俊瑛*○☆卜暉*賀丹*鄒月麗*

目的探討改良抗酸染色陽性結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液特點。方法納入170例臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎且改良抗酸染色呈陽性患者，收集其一般臨床資料，并對抗酸染色陽性出現(xiàn)時間、腦脊液細胞學(xué)分型及抗結(jié)核藥物對抗酸染色的影響進行統(tǒng)計分析。結(jié)果128例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液首次抗酸染色陽性出現(xiàn)在發(fā)病1個月內(nèi)（75.3％），其細胞學(xué)分型包括混雜細胞反應(yīng)、淋巴細胞反應(yīng)、嗜中性粒細胞反應(yīng)、正常細胞學(xué)，分別占15.5％、58.5％、19.5％、6.5％；24例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液首次抗酸染色陽性出現(xiàn)在發(fā)病1～2個月的病例，以上細胞學(xué)類型分別占13.1％、56.5％、21.7％及8.7％；18例結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液首次抗酸染色陽性出現(xiàn)在發(fā)病2個月以上的病例，四種細胞學(xué)分別占26.7％、46.7％、20.0％、6.6％。各種細胞學(xué)類型出現(xiàn)時間中位數(shù)，四組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.812）。應(yīng)用抗結(jié)核藥物的患者其抗酸染色陽性中位時間（據(jù)發(fā)病時間）21.5（12.3，37.8）d；未應(yīng)用抗結(jié)核藥物者抗酸染色陽性中位時間8.5（6.0，16.3）d，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.001）。應(yīng)用抗結(jié)核藥物的患者抗酸染色轉(zhuǎn)陰中位數(shù)時間11（5.75，19.25）d；未應(yīng)用抗結(jié)核藥物者抗酸染色轉(zhuǎn)陰中位數(shù)時間6（4.25，10.75）d，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.230）。結(jié)論結(jié)核性腦膜炎腦脊液改良抗酸染色首次陽性多發(fā)生于發(fā)病1個月內(nèi)，其陽性時的細胞學(xué)類型與抗酸陽性時間無關(guān)，應(yīng)用抗結(jié)核藥物可能會推遲抗酸桿菌檢出時間。

結(jié)核性腦膜炎腦脊液改良抗酸染色法

結(jié)核性腦膜炎發(fā)病隱匿，缺乏快速、靈敏的診斷實驗，導(dǎo)致診斷治療不及時,因而具有高死亡率及致殘率。檢測到結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核性腦膜炎診斷的金標準，改良抗酸染色（modified ZeiMNeelsen,MZN)是在傳統(tǒng)抗酸染色的基礎(chǔ)上做了玻片離心替代試管離心，破膜處理等改進。其陽性率及特異性均可達80％以上且可觀察到胞內(nèi)桿菌，給結(jié)核性腦膜炎的診斷帶來新的希望[1]。我實驗室自2012年10月至2015年7月做改良抗酸共計1314例（2262份），其中抗酸陽性330例，現(xiàn)將對我院170例抗酸陽性的結(jié)核性腦膜炎患者的臨床資料進行回顧性分析，旨在探討抗酸染色陽性結(jié)核性腦膜炎的臨床特點，特別是抗酸染色及細胞學(xué)特點。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2012年10月至2015年7月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院治療、符合入組條件的成年（＞14歲）結(jié)核性腦膜炎患者。診斷標準[2]（參考2010年柳葉刀雜志發(fā)表的最新臨床診斷標準）:①臨床入選標準：腦膜炎的癥狀和體征包含下列一個或多個：頭痛，易激惹，嘔吐，發(fā)熱，頸強直，抽搐，局部神經(jīng)功能缺損，意識狀態(tài)改變或嗜睡；②腦脊液改良抗酸染色陽性；③排除診斷：根據(jù)年齡、免疫狀況、地理區(qū)域、需排除以下診斷——化腦，隱腦，病腦，梅毒性腦炎等，排除這些診斷需要確鑿的微生物學(xué)診斷證據(jù)（染色、培養(yǎng)、PCR），血清學(xué)檢查（梅毒），組織病理學(xué)檢查（淋巴瘤）。同時滿足以上三條。本研究納入標準：①滿足臨床入選標準；②腦脊液MZN陽性；③患者年齡＞14歲；④排除其他疾病；⑤資料齊全者。最終納入170例患者，男109例，女61例，男女比例1.8：1；年齡14～81歲，平均年齡（38.6±15.7）歲。自出現(xiàn)臨床癥狀至我院就診時間（19.1±28.0）d。選擇2012年10月至2015年7月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院治療、符合入組條件的成年（＞14歲）結(jié)核性腦膜炎患者。診斷標準[2]（參考2010年柳葉刀雜志發(fā)表的最新臨床診斷標準）:①臨床入選標準：腦膜炎的癥狀和體征包含下列一個或多個：頭痛，易激惹，嘔吐，發(fā)熱，頸強直，抽搐，局部神經(jīng)功能缺損，意識狀態(tài)改變或嗜睡；②腦脊液改良抗酸染色陽性；③排除診斷：根據(jù)年齡、免疫狀況、地理區(qū)域、需排除以下診斷——化腦，隱腦，病腦，梅毒性腦炎等，排除這些診斷需要確鑿的微生物學(xué)診斷證據(jù)（染色、培養(yǎng)、PCR），血清學(xué)檢查（梅毒），組織病理學(xué)檢查（淋巴瘤）。同時滿足以上3條。本研究納入標準：①滿足臨床入選標準；②腦脊液MZN陽性；③患者年齡＞14歲；④排除其他疾??；⑤資料齊全者。最終納入170例患者，男109例，女61例，男女比例1.8：1；年齡14～81歲，平均年齡（38.6±15.7）歲。自出現(xiàn)臨床癥狀至我院就診時間（19.1±28.0）d。

1.2 資料收集查閱病歷并收集包括性別、年齡、臨床表現(xiàn)、既往史、實驗室檢查及影像學(xué)表現(xiàn)，腰椎穿刺結(jié)果等資料。

1.3 腦脊液抗酸染色①腰椎穿刺取2mL新鮮腦脊液，離心涂片4張玻片，其中兩張分別行MGG、阿例新蘭染色，鏡下細胞分類計數(shù)；其余兩張甲醛固定，triton破膜等后行ZeiM-Neelsen染色。②抗酸染色陽性：1000倍鏡下觀察，100個視野內(nèi)抗酸桿菌＞2條。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)分析，正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩獨立樣本比較采用Mann Whitney檢驗，多個獨立樣本比較采用Kruskal-Wallis檢驗。計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05，雙側(cè)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點本組患者多呈急性或亞急性起病，臨床特點見表1。

表1 結(jié)核性腦膜炎患者臨床特點

2.2 實驗室及影像學(xué)TB-IGRA陽性3例，血結(jié)核抗體陽性1例，其中1例腦脊液NMDAR+，1例合并HIV陽性。116例行頭顱MRI檢查，87例可見異常，其中大腦半球腦實質(zhì)病變5例(5.7％)，腦膜異常強化10例(11.5％)，腦積水3例(3.4％)，腦梗塞23例(26.4％)、腦出血3例(3.4％)、腦基底池改變1例(1.1％)、基底節(jié)異常信號9例(10.3％)，結(jié)核瘤1例(1.1％)。

55.9 ％腦脊液氯化物降低，83.6％腦脊液蛋白升高，中位數(shù)（M）1.09 g／L，四分位數(shù)間距（QR）1.06 g／L，63.2％的CSF糖＜2.5mmol／L。75.3％抗酸桿菌首次陽性出現(xiàn)在病程1個月，14.1％首次出現(xiàn)在病程1～2個月，10.6％首次出現(xiàn)在病程2個月以上?？顾彡栃阅X脊液白細胞計數(shù)：220份腦脊液白細胞計數(shù)，M 63×106/L，QR 140×106/L，95％CI為（77.5～ 190.6）×106/L，細胞數(shù)波動于0～5230×106/L，24.5％白細胞計數(shù)小于10×106/L，2.1％白細胞計數(shù)100大于500×106/L?？顾彡栃詴r的腦脊液細胞學(xué)分型：62.7％（138/220）呈淋巴反應(yīng)為主，15.0％（33/220）呈混雜細胞學(xué)反應(yīng)，15.9％（35/220）呈嗜中性粒細胞反應(yīng)為主，6.4％（14/220）呈正常腦脊液細胞學(xué)。64.1％（141/220）腦脊液中出現(xiàn)嗜中性粒細胞,嗜中性粒細胞比例中位數(shù)22％（1％～95％）。170例觀察對象，首次抗酸陽性出現(xiàn)時間，最早2 d，最晚184 d，M 16 d，QR 21 d。病程不同階段抗酸染色陽性時，細胞學(xué)類型的比例情況如下（表2）。可見，首次抗酸染色陽性可在結(jié)核性腦膜炎病程各階段，且可表現(xiàn)為各種細胞學(xué)類型，但以淋巴細胞反應(yīng)為主的細胞學(xué)類型最多見（圖1～5）。

表2 抗酸染色陽性時間分期和細胞學(xué)分型

圖1 抗酸桿菌（箭頭所示），細長略帶彎曲（改良抗酸染色1000×），嗜中性粒細胞反應(yīng)為主型細胞學(xué)，中位數(shù)時間發(fā)病第14天

圖2 抗酸桿菌（箭頭所示，改良抗酸染色1000×）淋巴細胞為主型細胞學(xué)，中位數(shù)時間發(fā)病第16.5天

圖3 抗酸桿菌（箭頭所示），細長略帶彎曲（改良抗酸染色1000×），混雜反應(yīng)細胞學(xué)，中位數(shù)時間發(fā)病第19天

圖4 抗酸桿菌（箭頭所示，改良抗酸染色1000×）正常細胞學(xué)，中位數(shù)時間發(fā)病第21天

圖5 抗酸染色陽性時間和細胞學(xué)分型關(guān)系，兩組間比較差異不具統(tǒng)計學(xué)意義(Kru s k a l-W a ll is檢驗P=0.812)

本文對細胞學(xué)類型和預(yù)后間的關(guān)系進行了分析,預(yù)后分為好轉(zhuǎn)、不良(死亡、自動出院)兩組，比較首次腰穿不同細胞學(xué)類型發(fā)生不良預(yù)后的概率,無統(tǒng)計學(xué)差異。因此本研究對細胞學(xué)持續(xù)表現(xiàn)與預(yù)后關(guān)系進行了分析，研究中10例患者混雜細胞學(xué)持續(xù)1個月以上，3例自動出院，7例好轉(zhuǎn)。非持續(xù)混雜細胞學(xué)患者160例，11例自動出院，1例死亡，1例未愈。兩組不良預(yù)后發(fā)生率經(jīng)比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.055），這提示腦脊液細胞學(xué)持續(xù)混雜反應(yīng)的患者更可能預(yù)后差。

2.3 應(yīng)用抗結(jié)核藥物對抗酸桿菌首次出現(xiàn)時間的影響96例在首次抗酸桿菌出現(xiàn)前應(yīng)用抗結(jié)核藥物，抗酸桿菌最早出現(xiàn)在發(fā)病4 d時，最晚在發(fā)病166 d，M 21.5 d，QR 25.5 d。74例在首次抗酸桿菌出現(xiàn)前未應(yīng)用抗結(jié)核藥物，抗酸桿菌最早出現(xiàn)在發(fā)病2 d，最晚出現(xiàn)在發(fā)病181 d，M 8.5 d，QR 10.3 d。經(jīng)Mann-Whitney檢驗，P＜0.001，推測抗酸染色陽性出現(xiàn)時間的推遲可能與抗結(jié)核藥物的影響有關(guān)。

2.4 抗結(jié)核對抗酸染色轉(zhuǎn)陰時間的影響170例觀察對象中，50例觀察過程中轉(zhuǎn)陰。46例在抗酸染色轉(zhuǎn)陰前應(yīng)用抗結(jié)核藥物，抗酸染色轉(zhuǎn)陰時間，最短2 d，最長77 d，M 11 d，QR 13.5 d；4例轉(zhuǎn)陰前未應(yīng)用抗結(jié)核藥物，抗酸染色轉(zhuǎn)陰時間最短4 d，最長12 d，M 6 d，QR 6.5 d。經(jīng)Mann-Whitney檢驗比較，P=0.230，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認為抗結(jié)核對抗酸染色轉(zhuǎn)陰時間有影響。

3 討論

結(jié)核性腦膜炎多緩慢起病，亦有急性、亞急性起病,本研究中多為急性、亞急性起病，與任鴻雁[3]報道一致。本病臨床表現(xiàn)缺乏特異性，多表現(xiàn)為低熱盜汗中毒癥狀，頭痛惡心嘔吐等腦膜刺激征，視乳頭水腫、意識障礙、腦疝等顱高壓表現(xiàn)，單癱、偏癱等腦實質(zhì)受損表現(xiàn)，復(fù)視、面神經(jīng)麻痹等顱神經(jīng)損傷及脊髓受損表現(xiàn)。影像學(xué)可表現(xiàn)為腦膜線樣強化增厚，基底池不規(guī)則強化，腦室系統(tǒng)擴大、室壁局限性增厚，基底池、腦膜、腦實質(zhì)可見結(jié)核瘤。本研究患者以頭疼、發(fā)熱、惡心嘔吐最常見，其中38℃～39℃比例最大。其次為肌力減退、顱神經(jīng)麻痹。13.7％患者存在其他部位結(jié)核。影像學(xué)表現(xiàn)為梗死灶者最多見、而腦積水、腦膜強化等典型表現(xiàn)者比例較小。相當一部分患者MRI無異常表現(xiàn)，這些通常發(fā)生在病程早期行MRI者，考慮與病灶尚未顯現(xiàn)有關(guān)。

傳統(tǒng)認為結(jié)核性腦膜炎腦脊液蛋白含量高,糖、低氯化物低，白細胞計數(shù)10～500×106/L并且淋巴細胞為主[4-5]。既往報道[6]，培養(yǎng)陽性的結(jié)核性腦膜炎患者，20％患者腦脊液白細胞計數(shù)不在傳統(tǒng)范圍內(nèi)，59.5％患者腦脊液細胞學(xué)為淋巴細胞為主型，10.1％的患者腦脊液中未出現(xiàn)嗜中性粒細胞。本研究中患者白細胞計數(shù)26.6％不在傳統(tǒng)范圍內(nèi)?？顾彡栃詴r的細胞學(xué)多表現(xiàn)為淋巴細胞學(xué)反應(yīng)為主型（62.7％），64.1％患者腦脊液中可見嗜中性粒細胞，與文獻報道一致[6-7]。并且研究發(fā)現(xiàn)抗酸陽性時的細胞學(xué)類型與抗酸陽性時間無關(guān)。

有文獻報道,腦脊液細胞學(xué)類型決定預(yù)后,越高的嗜中性粒細胞比例生存率越高。本文對細胞學(xué)類型和預(yù)后間的關(guān)系進行了分析,未發(fā)現(xiàn)細胞學(xué)類型對預(yù)測預(yù)后的價值，分析細胞學(xué)持續(xù)表現(xiàn)與預(yù)后關(guān)系發(fā)現(xiàn)腦脊液細胞學(xué)持續(xù)混雜反應(yīng)的患者預(yù)后可能更差。這就需要及時更換高敏感的藥物，以期好的預(yù)后。

本研究中170例觀察對象，首次抗酸染色陽性時間與就診時間接近，考慮為就診時機和腰穿及時性的影響，因此結(jié)核性腦膜炎疑似患者應(yīng)盡早行腰穿查找抗酸桿菌。有研究顯示，Ziehl–Neelsen染色經(jīng)過5～15 d治療后敏感性由52％下降至2％[8]。本研究表明，應(yīng)用抗結(jié)核藥物影響了結(jié)核桿菌的檢出時間。分析原因：其一，抗結(jié)核藥物作用于MTB細胞壁，導(dǎo)致部分MTB-L出現(xiàn)，抗酸性消失[9]，保留抗酸性的MTB減少，可著色的桿菌量減少。其二，MTB有彼此粘黏的特性，其在臨床標本并非均勻分布。當保持抗酸性的MTB量少到抗酸染色的檢測閾值時，取樣情況可影響檢出。這兩點影響抗酸檢出率，多次重復(fù)送檢才得到陽性結(jié)果[8]，致使抗酸桿菌檢出時間延長，因此我們應(yīng)重復(fù)送檢。

應(yīng)用抗結(jié)核藥物對轉(zhuǎn)陰時間的影響，未得出兩組有差別，可能與本研究抗酸轉(zhuǎn)陰前未應(yīng)用抗結(jié)核藥物組樣本量較小有關(guān)?？顾徂D(zhuǎn)陰后并非所有患者繼續(xù)送檢多次，不明確其是否為持續(xù)陰性，這需要將來進行前瞻性設(shè)計進一步探討。觀察對象中，亦存在抗酸染色轉(zhuǎn)陰后再次送檢時檢陽的病例，發(fā)現(xiàn)其病情有加重，考慮產(chǎn)生耐藥。

綜上所述，結(jié)核性腦膜炎患者抗酸染色陽性腦脊液白細胞計數(shù)通常為（77.5～190.6）×106/L，細胞學(xué)可表現(xiàn)為各種細胞學(xué)類型，但多表現(xiàn)為淋巴細胞反應(yīng)為主，同時存在嗜中性粒細胞，及時、重復(fù)送檢可提高抗酸染色檢出率。正常細胞學(xué)表現(xiàn)及生化結(jié)果不能排除結(jié)核性腦膜炎診斷。不典型結(jié)核性腦膜炎發(fā)病率越來越高，抗結(jié)核開始時間決定患者預(yù)后，因此診斷思維不該局限于傳統(tǒng)觀點。

[1]CHEN P,SHIM,FENG GD,et al.A highly efficient Ziehl–Neelsen stain:identifying denovo intracellular Mycobacterium tuberculosis and improving detection of extracellular M. tuberculosis in cerebrospinal fluid[J].JClin Microbiol,2012,50: 1166–1170.

[2]MARAIS,SUZAAN,THWAITES,et al.Tuberculousmeningitis: a uniform case definition for use in clinical research[J].Lancet Infectious Diseases,2010,10(11)：803.

[3]任鴻雁.結(jié)核性腦膜炎33例臨床及腦脊液動態(tài)分析[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2011,14(4):30-32.

[4]KARSTAEDT AS,VALTCHANOVA S,BARRIERE R,et al. Tuberculous meningitis in South African urban adults[J].Q J Med,1998,91(2):743-747.

[5]HERINGER RR,FERNANDES LE,GONCALVES RR,et al. Location of the lesion and the cerebrospinal fluid findings in tuberculousmeningitis:differences in the lumbar,cisternal and ventricular compartiments[J].Arq Neuropsiquiatr,2005,63(3): 543-547.

[6]王丙聚,馮國棟,楊毅寧,等.37例培養(yǎng)陽性結(jié)核性腦膜腦炎腦脊液細胞學(xué)動態(tài)分析[J].中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2012,11(5):448-451.

[7]楊笑,吳若芬,竇春陽,等.兒童結(jié)核性腦膜炎腦脊液細胞學(xué)變化[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志,2013,13(2):126-131.

[8]THWAITES GE,CAWS M,CHAU TT,et al.Comparison of conventional bacteriology with nucleic acid amplification (amplified mycobacterium direct test)for diagnosis of tuberculous meningitis before and after inception of antituberculosis chemotherapy[J].JClin Microbiol,2004,42(3): 996-1002.

[9]王和,陳崢宏.抗結(jié)核藥物誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌形成L型及其特性的觀察[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(1):52-55.

Cytological features of cerebrospinal fluid in 170 the patients with modified ZeiM-Neelsen positive tuberculousmengningitis.

LIU Yajuan,HE Junying,BU Hui,He Dan,ZOU Yueli,Department of Neurology，the second hos-pital of HEBEImedical university,Shijiazhuang 050000，China.Tel：0311-66003711-211.

Objective To investigate the features of the cerebrospinal fluid(CSF)in themodified ZeiM-Neelsen (MZN)positive tuberculous mengningitis(TBM).M ethods We retrospectively reviewed the clinical data of 170 patients with tuberculousmeningitis confirmed by MZN stain from December 2012 to July 2015.The purpose of the present study was to investigate the relationship of MZN staining and CSF cytology.Results Among 170 patients with TBM confirmed by MZN staining,128 cases had first detectable acid-fast bacillus(AFB)in earlier stage.The cytology included 15.5％mixed cellular cytology，58.5％lymphoid cytology，19.5％neutrophilic cytology and 6.5％normal cytology.Twenty-four cases had first detectable AFB within 1-2 months following disease onset.The cytology included 13.1％mixed cellular cytology,56.6％lymphoid cytology,21.7％neutrophilic cytology and 8.7％normal cytology. Eighteen cases had first detectable AFB 2 months after disease onset.The cytology included 26.7％mixed cellular cytology,46.7％lymphoid cytology,20.0％neutrophilic cytology,6.6％normal cytology.There was no significant differ-ence in median time of first detectable AFB among those four types of cytology(P=0.812).There was significant difference in median time of first detectable AFB between patients with and without anti-TB therapy[21.5（12.3，37.8）days vs.8.5（6.0，16.3）days，P<0.001].There was no significant difference in median time MZN stain turning negative between patients with and without anti-TB therapy[11(5.75,19.25)days vs.6（4.25，10.75）days,P=0.230].Conclusions AFB can be detectable within a month after the onset of TBM in most of cases.(MZN)positive staining is not associated with themajor type of cytology.Anti-TB therapy may delay the first detectable time of AFB.

Tuberculousmengningitis Cerebrospinal fluid Modified ZeiM-Neelse

R529.3

A

2016-01-27）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.04.005

☆河北省醫(yī)學(xué)適用技術(shù)跟蹤項目（編號：GL2012026）

*河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院（石家莊050000）

○☆通信作者（E-mail:hjy_zn@126.com）