廖亞云劉夕霞黃逸青廖宇晗吳原○☆

·論著·

L e t-7c-1對戊四氮致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用☆

廖亞云*劉夕霞△黃逸青※廖宇晗*吳原*○☆

目的研究let-7c-1對戊四氮（pentylenetetrazol，PTZ）致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，探討其可能機(jī)制。方法通過PTZ腹腔注射SD雄性大鼠建立慢性癲癇模型，隨機(jī)分為癲癇組、干預(yù)對照組、let-7c-1激動劑組，各組12只，另設(shè)12只大鼠為正常組。28 d后，觀察各組大鼠的行為學(xué)變化，let-7c-1基因表達(dá)及大鼠海馬組織中Bcl-2、Caspase3蛋白的表達(dá)。結(jié)果與正常組相比，癲癇組大鼠逃避潛伏期延長、穿越平臺次數(shù)減少、在目標(biāo)象限的總路程縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；癲癇組與干預(yù)對照組相比，逃避潛伏期、穿越平臺次數(shù)、在目標(biāo)象限的總路程無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；與干預(yù)對照組相比，let-7c-1激動劑組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)減少、在目標(biāo)象限的總路程縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。干預(yù)對照組與let-7c-1激動劑組let-7c-1基因相對表達(dá)量分別為（1.35±0.32）、（62.53±21.01）（F=50.97，P<0.05）。癲癇組let-7c-1基因表達(dá)量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。let-7c-1激動劑組let-7c-1基因表達(dá)量明顯高于干預(yù)對照組、癲癇組及正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與正常組相比，癲癇組的Bcl-2蛋白表達(dá)減少，Caspase3蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；癲癇組與干預(yù)對照組相比，Bcl-2蛋白及Caspase3蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。與干預(yù)對照組相比，let-7c-1激動劑組Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Caspase3蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論Let-7c-1可能通過減少海馬組織Bcl-2蛋白及增加Caspase-3蛋白表達(dá)使PTZ致癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能受損。

癲癇學(xué)習(xí)記憶功能凋亡

研究表明一些在腦及血液中特異表達(dá)的microRNA參與癲癇、腦卒中引起的大鼠海馬損傷[1]。MicroRNA與記憶障礙密切相關(guān)[2]，可通過影響神經(jīng)元的發(fā)生和發(fā)育調(diào)控大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能[3]。let-7是mircroRNAs的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)在難治性癲癇患者腦組織中l(wèi)et-7c基因表達(dá)上調(diào)[4]。我們在對PTZ致癇大鼠記憶障礙的前期研究也發(fā)現(xiàn)let-7c-1表達(dá)明顯上調(diào)[5]。一項(xiàng)對阿爾茨海默病的研究發(fā)現(xiàn)let-7c通過上調(diào)BACE2分泌酶減少Аβ的生成[6]，癲癇伴阿爾茨海默病的患者其認(rèn)知功能障礙的發(fā)生有著共同的microRNA異常表達(dá)基礎(chǔ)[7]。let-7與癲癇相關(guān)，是否同時(shí)對認(rèn)知功能有影響，我們尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)擬采用PTZ致癇大鼠模型，探討let-7c-1對PTZ致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及模型建立SD成年雄性大鼠，體重約220～240 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供（實(shí)驗(yàn)動物通過倫理委員會審核）。將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組（腹腔注射生理鹽水）、癲癇組（腹腔注射PTZ）、干預(yù)對照組（腹腔注射PTZ+側(cè)腦室注射let-7c-1-3 p agomir control）、let-7c-1激動劑組（腹腔注射PTZ+側(cè)腦室注射let-7c-1-3 p agomir），每組12只。造模成功后，立即進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)。水迷宮實(shí)驗(yàn)后第2天每組各隨機(jī)取6只大鼠的新鮮腦組織用于PCR實(shí)驗(yàn)，另外6只經(jīng)多聚甲醛心臟灌注后取海馬組織制作成石蠟切片，用于免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.2 癲癇動物造模的給藥方式取SD大鼠，腹腔注射PTZ（美國Sigma公司，生理鹽水配置成10 mg/mL）60 mg/kg后觀察大鼠行為20 min，根據(jù)Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行觀察及記錄，選擇IV～V級致癇大鼠作為癲癇動物模型組。將大鼠麻醉固定在立體定位儀上，參照大鼠腦立體定位圖譜[9]定位大鼠右側(cè)側(cè)腦室，暴露前囟，以前囟為原點(diǎn)往后0.8 mm，中線向右旁開1.3mm，用5mL注射器針頭鉆開顱骨，硬膜下3.7mm，用10μL微量注射器將let-7c-1-3 p agomir control、let-7c-1-3 p agomir、（廣州市銳博生物科技有限公司，生理鹽水配置成1 nmol/5μL）以1μL/5min速度泵入干預(yù)對照組，let-7c-1激動劑組大鼠側(cè)腦室，劑量為每只1 nmol，注射后留針10min緩慢退出，消毒、縫合。隨后用PTZ（35 mg/kg）腹腔注射點(diǎn)燃，觀察20min，隔天1次，共14次，持續(xù)28 d。取期間連續(xù)4次發(fā)作達(dá)II級或2次發(fā)作達(dá)IV～V級作為慢性癲癇模型[5]。

1.3 M orris水迷宮實(shí)驗(yàn)Morris水迷宮[10]由定位航行實(shí)驗(yàn)及空間探索實(shí)驗(yàn)組成，共6 d，分析大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。其中定位航行實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，記錄90 s內(nèi)找到平臺的時(shí)間（即逃避潛伏期）?？臻g探索試驗(yàn)在第6天撤去平臺時(shí)進(jìn)行，記錄90 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù)和在目標(biāo)象限（原平臺象限）的總路程。

1.4 RT-PCR熒光定量實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)步驟：①總RNA的提取和CDNA的合成：冰上分離海馬組織，用Trizol reagent提取總RNA，分光光度儀測定所提RNA純度及完整性；參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（寶生物工程大連有限公司）說明書對CDNA的合成進(jìn)行操作，反應(yīng)體系20μL，將反轉(zhuǎn)錄的CDNA冰上冷卻后，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②RT-PCR反應(yīng)：選擇SYBR染料法，在ABI7500型熒光定量PCR儀（型號：Applied Biosystems AB）進(jìn)行RTPCR反應(yīng)，以U6基因（大連寶生物工程有限公司）作為對照基因。具體反應(yīng)體系按說明書操作。分析觀察RT-PCR的擴(kuò)增和融解曲線，用相對定量2-ΔΔCt分析大鼠海馬組織中l(wèi)et-7c-1的相對表達(dá)量。

1.5 免疫組織化學(xué)①將大鼠腦組織制作成4μm厚石蠟切片；②采用SP法（SP試劑盒北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）：經(jīng)脫蠟、脫水、高壓抗原修復(fù)、血清封閉后，滴加一抗Bcl-2（稀釋度1:100）（英國abcam公司）或者一抗Caspase3（稀釋度1: 300）（santa公司），置于37℃濕盒內(nèi)過夜（12～16 h），復(fù)溫、清洗，滴加通用型兔抗羊二抗，PBS清洗，滴加辣根酶標(biāo)志鏈霉素卵白素孵育15 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，浸泡返藍(lán)，中性樹膠封片；③在高倍鏡（40×10）（日本奧林巴斯有限公司）下隨機(jī)選取6個(gè)不同視野觀察并拍照，采用IPP軟件進(jìn)行半定量分析，檢測陽性細(xì)胞的平均熒光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)結(jié)果以±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法進(jìn)行，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 模型建立癲癇動物模型腹腔注入PTZ后約4min出現(xiàn)面部抽搐，隨后出現(xiàn)單肢、多肢抽搐、全身強(qiáng)直、跌倒等癥狀，持續(xù)時(shí)間約1～3min。造模的SD大鼠共有42只，36只造模成功，86％大鼠出現(xiàn)癲癇樣癥狀并達(dá)Ⅳ～Ⅴ級發(fā)作，點(diǎn)燃期間100％大鼠連續(xù)4次發(fā)作達(dá)II級或2次發(fā)作達(dá)IV～V級。正常組腹腔注入生理鹽水后無癇性發(fā)作。

2.2 大鼠M orris水迷宮檢測結(jié)果在定位航行實(shí)驗(yàn)中，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長，各組的逃避潛伏期逐漸縮短，大鼠的記憶能力越強(qiáng)。水迷宮試驗(yàn)結(jié)果見表1、表2。癲癇組大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能較正常組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；經(jīng)側(cè)腦室注射let-7-1激動劑，大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能較干預(yù)對照組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)表明過表達(dá)let-7-1可使PTZ致癇大鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損。

2.3 let-7c-1基因表達(dá)采用熒光定量PCR對let-7c-1基因表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示正常組、癲癇組、干預(yù)對照組、let-7-1激動劑組的let-7c-1基因相對表達(dá)量分別是：1.00±0.00、1.48±0.32、1.35±0.32、62.53±21.01（F=240.43，P<0.05）。let-7 c-1激動劑組let-7c-1基因的表達(dá)均比正常組、癲癇組及干預(yù)對照組高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)溶解曲線及擴(kuò)增曲線見圖1。

2.4 Bcl-2、Caspase3蛋白表達(dá)各組大鼠Bcl-2和Caspase3蛋白的表達(dá)見圖2。Bcl-2蛋白主要在神經(jīng)元胞漿內(nèi)表達(dá)，Caspase3蛋白在神經(jīng)元胞漿及胞核都有表達(dá)。各組Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量分別為：0.1609±0.00608、0.1025±0.00529、0.1017± 0.00278、0.0607±0.00407（F=76.20，P<0.05）；Caspase3蛋白的表達(dá)量分別為0.0931±0.00234、0.1196±0.00221、0.1215±0.00276、0.1576±0.00165（F=35.70，P<0.05）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，Bcl-2蛋白光密度依次為：正常組>癲癇組>let-7c-1激動劑組，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Caspase3蛋白光密度依次為：正常組<癲癇組0.05）。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠逃避潛伏期比較（s）（n=12）

表2 各組大鼠第6天時(shí)穿越平臺次數(shù)及在目前象限的總路程比較（n=12）

3 討論

圖1 左圖為各組R T-P CR實(shí)驗(yàn)溶解曲線圖，U6及l(fā)e t-7c-1基因只有單峰，為特異性擴(kuò)增；右圖為U6及l(fā)e t-7c-1基因擴(kuò)增曲線圖：參考基因及目的基因擴(kuò)增效率具有一致性

圖2 左圖大鼠海馬組織中B c l-2蛋白及C aspas e3蛋白表達(dá)情況（40×），A為正常組，B為癲癇組，C為干預(yù)對照組，D為le t-7c-1激動劑組；右圖表示與正常組相比，P＜0.05

癲癇患者存在不同程度的認(rèn)知功能障礙。研究表明，microRNA表達(dá)和功能的異常與癲癇的學(xué)習(xí)、記憶障礙等疾病都有密切的關(guān)系。既往發(fā)現(xiàn)癲癇大鼠存在記憶障礙[11]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，與正常對照組比較，癲癇組學(xué)習(xí)記憶功能受損。我們前期研究[5]發(fā)現(xiàn)，在PTZ致癇大鼠認(rèn)知功能障礙大鼠中l(wèi)et-7c-1過表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過建立PTZ致癇大鼠模型研究let-7c-1過表達(dá)對PTZ致癇大鼠認(rèn)知功能的影響。結(jié)果表明，通過側(cè)腦室注射let-7c-1激動劑，可以使癲癇動物模型let-7c-1基因過表達(dá)；另外癲癇組let-7c-1基因表達(dá)量高于正常組。認(rèn)知功能方面，與干預(yù)對照組相比，let-7c-1激動劑組學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降。大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降趨勢與let-7c-1表達(dá)趨勢一致。結(jié)果提示過表達(dá)let-7c-1可使PTZ致癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能損害。

研究證實(shí)在癲癇動物模型中存在海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象[12]。近來研究表明癲癇發(fā)作后部分神經(jīng)元凋亡由Bcl-2、Bax等凋亡基因調(diào)控。Bcl-2蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，最終抑制細(xì)胞凋亡。Caspase3是一種蛋白酶，其表達(dá)上調(diào)表明凋亡通路被激活，細(xì)胞死亡增加。本實(shí)驗(yàn)通過制作慢性癲癇動物模型發(fā)現(xiàn)，癲癇組海馬組織細(xì)胞凋亡比正常組增多，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Caspase3蛋白表達(dá)顯著增加，這與前期研究相一致。

經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控。let-7c在腦血管疾病、神經(jīng)免疫系統(tǒng)疾病等疾病中的表達(dá)明顯上調(diào)。LIU等[13]發(fā)現(xiàn)let-7在腦損傷后的高表達(dá)與細(xì)胞凋亡有關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)研究中，側(cè)腦室注射let-7c-1激動劑使let-7c-1在腦組織中過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，Caspase3蛋白表達(dá)顯著增加，研究證明在癲癇動物模型中，let-7c-1激動劑可通過減少Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Caspase3蛋白表達(dá)導(dǎo)致海馬區(qū)凋亡增加。

研究發(fā)現(xiàn)Bcl-2、Bcl-xl、Fas和Caspase-3蛋白等let-7家族的靶基因與凋亡相關(guān)[14-15]。細(xì)胞凋亡的線粒體通路是癲癇致神經(jīng)元損傷的重要途徑，既往發(fā)現(xiàn)Caspase3參與了癇性放電致神經(jīng)元凋亡的過程[16]，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析我們推測let-7 c-1使癲癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能受損與線粒體細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)未進(jìn)行細(xì)胞凋亡通路相關(guān)因子的檢測，有待進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，let-7c-1負(fù)向調(diào)節(jié)PTZ致癇大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，過表達(dá)let-7c-1可通過減少Bcl-2蛋白的表達(dá)和增加Caspase3蛋白表達(dá)使癲癇大鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡增加。let-7c-1可能為癲癇致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的一個(gè)干預(yù)靶點(diǎn)。

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The effects of let-7c-1 on the learning and memory of epileptic rats induced by PTZ.

LIAO Yayun,LIUXixia,HUANG Yiqing,LIAO Yuhan,WU Yuan.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China.Tel:0771-5356504.

Objective To explore the effect of let-7c-1 on the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats and its relevantmechanism.Methods A model of temporal lobe epilepsy(TLE)was induced via PTZ kindling in SD male rats.The epileptic rats were divided into epilepsy group,agomir-control group,let-7c-1 agomir group(12 rats for each).Twelve rats were served as a negative control group.The behavior and the expression levesl of let-7c-1,Bcl-2 protein and Caspase3 were evaluated at 28 days following PTZ.Results Compared to the negative group, the escape latency of epilepsy group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P<0.05).However,those parameters were not significantly different between the epilepsy groupand the agmoir-control group(P＞0.05).Compared to the agmoir-control group,the escape latency of let-7c-1 agomir group was prolonged and the crossing times as well as the quadrant total distance in the target were reduced(P＜0.05).The expression levels of let-7c-1 and let-7c-1 were 1.35±0.32 in agmoir-control group and 62.53±21.01 in agomir group（F=50.97，P＜0.05）.The expression levels of let-7c-1 were higher in let-7c-1 agomir group than in other groups（P＜0.05）.Compared to the negative group,the expressions of Bcl-2 protein in other groups were decreased(P＜0.05)and the Caspase3 protein were increased(P＜0.05).Compared to the agomir-control group,the expression of Bcl-2 protein was significantly decreased and the expression of Caspase3 protein was significantly increased in let-7c-1 agomir group(P＜0.05).Conclusions The present study shows that let-7c-1 may impair the learning and memory of PTZ-induced epileptic rats through decreasing the Bcl-2 protein and increasing Caspase3 protein in the hippocampus.

Epilepsy Learning andmemory Apoptosis

R742.1

A

2016-08-27）

（責(zé)任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.04.010

☆國家自然科學(xué)基金（編號：81360201）

*廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（南寧530021）

△廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科

※廣西貴港市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

○☆通信作者（E-mail:wuyuan90@126.com）