郭杰+崔衛(wèi)濤+許青榮+胡薛英+肖運才+王喜亮+畢丁仁+李自力+周祖濤

摘要：2015年10月，湖北省某規(guī)?；u場產(chǎn)蛋雞群相繼發(fā)生某種疾病，日死亡率達2%。為了明確患病蛋雞死亡的原因及確定病原，對臨床送檢患病蛋雞開展了病理解剖、組織病理學觀察、PCR檢測和病毒分離等實驗室診斷。結(jié)果表明，患病蛋雞臨床剖檢可見心包內(nèi)有淡黃色清亮液體，肝臟腫脹、脂肪變性和變色，腎臟腫大、尿酸鹽沉淀較多；病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)肝細胞核內(nèi)形成嗜堿性核內(nèi)包涵體；病料樣品及病料雞胚接種尿囊液，PCR擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與I群禽腺病毒hexon基因同源性為99%，表明分離到的病毒為I群禽腺病毒。

關(guān)鍵詞：湖北?。坏半u；I群禽腺病毒；感染；診斷

中圖分類號：S852.659 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）12-2310-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.027

Diagnostic of Fowl Adenovirus-I Infection in Layer in Hubei Province

GUO Jie，CUI Wei-tao，XU Qing-rong，HU Xue-ying，XIAO Yun-cai，

WANG Xi-liang，BI Ding-ren，LI Zi-li，ZHOU Zu-tao

（College of Veterinary Medicine， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract：In October 2015，layers inthe large-scale chicken farms had occurred some kinds of disease in Hubei province，daily mortality rate up to 2%. In order to define the cause of death and pathogen of the sick laying hens，laboratory diagnosis were carried out，such as pathological anatomy，histopathology，PCR and virus isolation. Clinical autopsy sick layers are visible that light yellow clear liquid in pericardium，liver swelling，fatty degeneration and discoloration， renal swelling，uric acid salt precipitation， histopathology observed basophilic intranuclear inclusions in liver nuclei，tissue samples and chicken embryos inoculated allantoic fluid，the PCR amplification product sequencing showed sequence homology with fowl adenovirus-I hexon gene （99%）， so it can define that the isolated virus is fowl adenovirus-I.

Key words： Hubei province； layer； fowl adenovirus-I； infection； diagnostic

2015年10月，湖北省某規(guī)?；u場不同日齡的產(chǎn)蛋雞群相繼出現(xiàn)死亡情況，患病蛋雞雞冠蒼白，精神沉郁，食欲不振，排黃綠色糞便。一旦出現(xiàn)臨床癥狀，大部分在3～5 d內(nèi)死亡，有些無任何特征性癥狀突然死亡，日死亡率達2%，藥物治療效果不佳，造成的經(jīng)濟損失巨大。該雞場將患病雞送檢華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院實驗室，臨床剖檢可見心包中有淡黃色清亮液體；肝臟腫大，呈土黃色，表面有不同程度的點狀或條索狀出血，邊緣鈍厚，質(zhì)地脆弱易破裂；脾臟腫大，見有灰白色斑點；腎臟腫大、蒼白，表面有出血點。

根據(jù)該產(chǎn)蛋雞群的發(fā)病情況、臨床癥狀和病理解剖變化及雞I群禽腺病毒感染癥狀的報道[1-3]，初步診斷疑似為I群禽腺病毒感染引起的雞包涵體肝炎。為了進一步確診，對臨床患病蛋雞開展了組織病理學觀察、PCR檢測和病毒分離等實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

病料來源于湖北省某雞場的患病雞，剖檢采集肝臟、脾臟等組織，加入適量的無菌PBS溶液，研磨，-20 ℃保存；另一部分組織樣品在100 mL/L的中性福爾馬林溶液中固定。

蛋白酶K購自生工生物工程（上海）股份有限公司、Taq SuperMix購自南京金斯瑞生物科技有限公司；DNA Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司。

PCR儀（BioRad，美國）；電泳儀（北京市六一儀器廠，中國）；凝膠成像儀（BioRad，美國）；小型高速離心機（Eppendorf，德國）。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離 將病料勻漿，反復凍融2～3次后離心取上清，加入雙抗，4 ℃下感作過夜。經(jīng)卵黃囊接種6～8日齡雞胚，每胚接種0.2 mL。將24～96 h死亡及存活的雞胚置于4 ℃過夜，次日無菌收獲尿囊液，盲傳3代。

1.2.2 組織病理 切片取在100 mL/L福爾馬林溶液中固定好的患病蛋雞的肝臟、腎臟、腸道等組織，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，觀察組織病變。

1.2.3 DNA的提取 取400 μL病料勻漿樣品或收獲的尿囊液1.5 mL于滅菌離心管中，加入300 μL消化液（100 mmol/L NaCl、25 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、0.5% SDS、100 μg/mL蛋白酶K），37 ℃消化過夜。在上述消化混合物中加入等體積的苯酚，充分混勻，12 000 r/min離心10 min。取上清，加入等體積的苯酚∶氯仿（1∶1），混勻，12 000 r/min離心10 min；再取上清，用等量的氯仿抽提，12 000 r/min離心10 min。最后取上清加入2倍體積的無水乙醇，-20 ℃放置30 min，12 000 r/min離心10 min沉淀DNA。沉淀用70%的乙醇洗滌1次，空氣中自然干燥后懸浮于15 μL滅菌超純水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 PCR反應 參照I群禽腺病毒hexon基因序列設(shè)計PCR引物，擴增片段為470 bp，上游引物：5′-AATTTCGACCCCATGACGCGCCAGG-3′；下游引物：5′-TGGCGAAAGGCGTACGGAAGTAAGC-3′，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。采用50 μL的PCR體系：DNA 4 μL，上、下游引物各1 μL，Taq SuperMix 25 μL，滅菌超純水19 μL。PCR反應程序為95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.2.5 PCR擴增產(chǎn)物的檢測與分析 PCR產(chǎn)物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察，拍照記錄下結(jié)果。切下目的片段，并用瓊脂糖凝膠試劑盒回收純化，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床解剖

患病蛋雞心包中有淡黃色清亮液體（圖1），肝臟腫大，表面有不同程度的點狀或條索狀出血（圖2），呈土黃色，邊緣鈍厚，質(zhì)地脆弱易破裂（圖3），有的表面可見到大小不等的壞死灶，壞死灶和出血交相混合，使其表面凹凸不平。脾臟腫大，見有灰白色斑點（圖4）；腎臟腫大，表面有不同程度的出血點（圖5），腺胃乳頭出血（圖6）。

2.2 組織病理學觀察

肝臟的病變普遍且較嚴重，肝細胞索紊亂，肝索間可見出血、淤血現(xiàn)象；肝組織明顯的脂肪變性，腫大，胞漿氣泡呈氣球樣（圖7）；細胞間有炎性細胞浸潤，同時可見少量的嗜堿性核內(nèi)包涵體（圖8）。

2.3 PCR擴增與測序

PCR電泳檢測結(jié)果顯示，陰性對照孔未擴增出任何片段，病料樣品孔與雞胚尿囊液擴增產(chǎn)物大小與預期片段一致。將分離株的基因測序結(jié)果與GenBank中的序列比對，通過DNAStar軟件分析，結(jié)果顯示，分離株與I群禽腺病毒序列同源性為99%，表明被檢病料樣品和雞胚尿囊液中含有I群禽腺病毒。

3 討論

I群禽腺病毒感染主要引起雞包涵體肝炎和心包積水綜合征。心包積水綜合征病理變化為心包積液較嚴重，液體清亮或呈膠凍樣，肝臟腫大，呈土黃色甚至褐色，質(zhì)地脆弱。病理組織切片可見肝細胞脂肪變性、壞死，肝細胞核中可見嗜堿性核內(nèi)包涵體。針對病料及病料雞胚傳代尿囊液的I群禽腺病毒hexon基因PCR測序結(jié)果表明被檢病料和雞胚尿囊液中含有I群禽腺病毒。因此，根據(jù)病理解剖、組織病理學觀察、PCR檢測和病毒分離等實驗室檢測，該產(chǎn)蛋雞群確診為I群禽腺病毒感染引起的雞心包積水綜合征。

I群禽腺病毒廣泛存在于雞、鴨、鵝等的呼吸道和消化道，能使雞群呈隱性感染，作為繼發(fā)病原共同作用家禽，并能垂直傳播，污染雞胚。已有研究表明，某些免疫抑制病如傳染性法氏囊和傳染性貧血與Ⅰ群禽腺病毒有關(guān)[1，4，5]。當免疫力低下時，Ⅰ群禽腺病毒較易侵入雞群，引起導致產(chǎn)蛋下降、再生障礙性貧血和輕度呼吸道疾病。1986年就有報道，之后在少數(shù)省份散發(fā)[6，7]；2010年至今，該病在山東、江蘇、河南、河北、遼寧、山西、內(nèi)蒙古等省流行[8-10]。

目前，作為原發(fā)病原的作用尚不清楚，所以與其致病性有關(guān)的因素也不能確定。在本病例中，該規(guī)模化雞場產(chǎn)蛋雞群因I群禽腺病毒感染導致的死亡率約30%，日死亡率可達2%，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。因此，有必要對該病原是否是原發(fā)性病原及其致病性進行深入研究。雞群感染I群禽腺病毒后能夠引起免疫抑制，造成機體對疫苗的免疫應答失敗，給養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的危害。所以，對于該病還是要做到防重于治，家禽養(yǎng)殖場應加強雞場生物安全措施，減少家禽養(yǎng)殖的損失。

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